我们描述了一种在BALB/c小鼠中建立的体内免疫、可转化的肝炎模型，可用于研究药物诱导的自身免疫性肝炎的发病机制，包括该疾病中观察到的性别差异。我们将阐述如何利用该模型通过体内和体外实验技术实现可重复的分析。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
药物诱导的自身免疫性肝炎（DIH）是自身免疫性肝炎患者中约9%至12%所观察到的最常见的肝脏药物诱导性超敏反应过程。DIH患者中绝大多数为女性。由于缺乏模拟人类疾病的动物模型，这种患病率性别差异的潜在机制尚不明确。尽管如此，人们普遍认为这些机制与人类白细胞抗原单倍型及性激素有关。相比之下，利用DIH小鼠模型，我们发现IL-4启动的 CD4+ T细胞针对细胞色素P450 2E1（CYP2E1）的一个表位，可诱导中性粒细胞、巨噬细胞和肥大细胞浸润到雌性BALB/c小鼠的肝脏中。利用该模型，我们还发现IL-33诱导的FoxP3+调节性T细胞可在雌性和雄性小鼠中提供对DIH的保护作用。该DIH模型通过使用与DIH相关的药物代谢物共价修饰的CYP2E1表位免疫小鼠而建立。该表位可被DIH患者所识别。我们的方法可诱导出强烈且可重复的肝炎及自身抗体，可用于研究DIH的发病机制。尽管体内研究若操作不当可能给小鼠带来不必要的疼痛和痛苦，但其优势在于能够在大量小鼠中评估疾病的发生机制。此外，可通过侵入性操作研究被修饰肝脏蛋白的生物学效应。在实验设计中加入体外研究，可实现快速重复和细胞水平的机制分析。因此，我们将展示本研究的模型方案及其在研究DIH体内和体外机制中的应用。
引言
本方法旨在描述一种药物诱导的自身免疫性肝炎的小鼠模型，该模型可在体内形成，并展示如何利用该模型研究该疾病的分子、免疫学和遗传学基础。我们研究的长期目标是通过研究易感患者中的药物诱导性肝炎（DIH），揭示导致慢性肝炎症和肝损伤的机制。肝病和肝硬化是25至64岁成年人死亡的第六大常见原因。特发性药物性肝损伤（DILI），有时称为药物诱导性自身免疫性肝炎（DIH），是美国急性肝衰竭的第三大常见原因。DIH是最常见的肝脏药物诱导性高敏反应，在约9%至12%的自身免疫性肝炎患者中被观察到1。绝大多数DIH患者为女性2,3,4。在易感个体中，使用卤化挥发性麻醉剂（如异氟烷、七氟烷、地氟烷或氟烷）后可引发一种类型的DIH。这些麻醉剂通过其代谢产物的活性物质共价结合于肝脏蛋白，从而形成新的自身抗原，能够诱发过敏或自身免疫反应5。
由于缺乏能够密切模拟人类疾病诱导过程的动物模型，此前对麻醉药及相关形式的药物性肝损伤（DIH）发病机制的研究一直受到阻碍。我们已建立一种实验性小鼠DIH模型，其特征与患者中免疫介导的药物性肝损伤（DILI）相似。通过使用经三氟乙酰氯（TFA）代谢物共价修饰的两种自身抗原之一进行免疫，可诱....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有实验程序均经动物护理与使用委员会批准。
1. 肝脏S-100胞质蛋白或CYP2E1表位的三氟乙酰化
注意：首先制备三氟乙酰化的 S100（TFA-S100）和三氟乙酰化的 CYP2E1 抗原表位（TFA-JHDN5）。由于免疫需要同系型 S100 蛋白，且必须使用 BALB/c 小鼠来制备免疫原，因此需采用该品系小鼠。此制备方法可获得大量免疫原，建议每年进行约四次。制备 TFA-JHDN5 时采用完全相同的方法。CYP2E1 抗原表位（JHDN5），序列为 GII/ FNN/ GPT/ WKD/ IRR/ FSL/ TTL，可通过测序获得或直接购买。
- 肝脏S100组分的分离
- 在使用40–60 mg/kg氯胺酮与4–6 mg/kg赛拉嗪混合物对5–10只BALB/c小鼠进行镇静后，通过观察肌肉张力降低以及对疼痛刺激（如足趾夹捏，即缩足反射）无反应，同时伴随翻正反射和眼睑反射消失，确认麻醉深度适当。
- 使用显微外科剪，沿中线切口暴露腹腔内容物，并在下腔静脉上做一小切口以清除血液。
- 将24号套管针插入门静脉，以每分钟10 mL的速度在37°C水浴中用40 mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）灌注肝脏 4 °C. 取出合并的肝脏并称重，切成小块（10 – 15 mm）。
注意：通过腹腔....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
用于诱导药物性免疫性肝炎（DIH）的免疫程序如图1所示，包括在颈部基部（第0天）和尾部基部（第7天）进行的两次免疫。 图2展示了在第14天使用CFSE检测对CYP2E1、JHDN5、CYP2E1表位以及麻醉药的三氟乙酰（TFA）代谢产物所产生的代表性增殖数据。 图3展示了第14天诱导产生的CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞（Tregs）的设门策略及代表性流式细胞术分析结果。 图4展示了第21天苏木精-伊红染色的代表性切片，显示肝炎的进展情况6。 图5展示了第21天雌性与雄性BALB/c小鼠肝脏组织的苏木精-伊红染色代表性切片，显示雌性小鼠肝炎更为严重，并展示了这些肝脏组织中细胞成分的比较10。 图6.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案的优势在于其可重复性，因此严格遵循建议的步骤至关重要。免疫原的制备对某些研究者而言可能构成障碍，但我们已使用本文所述表位成功复制了我们的模型，从而无需分离肝脏中的S100组分。很可能其他表位或蛋白质经修饰后亦可在免疫后诱导肝炎；然而，本文仅描述我们已验证并获得可靠结果的蛋白质。已有研究表明，多种蛋白质在接触卤代麻醉药后可发生三氟乙酰化。最可能由于表位扩散现象，其中一些蛋白质在其天然、未三氟乙酰化的状态下也成为自身抗体的靶标。例如，丙酮酸脱氢酶复合体的E2亚单位（PDH-E2）携带的表位（硫辛酸辅基）在结构上与TFA-加合物中的TFA基团具有相似性。研究已证实，氟烷性肝炎患者体内产生的抗体可与TFA-蛋白质和PDH-E2发生交叉反应20,21。
我们的DIH模型需要在小鼠背部进行两次用完全弗氏佐剂（CFA）乳化的免疫接种。已知使用CFA进行足垫注射与小鼠的疼痛和痛苦相关。因此，实验性DIH模型的建立包含了多次实验尝试。当我们评估仅使用一次CFA免疫、第二次免疫使.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Njoku 博士希望感谢 Noel R. Rose 博士（医学博士、哲学博士），感谢他提供的指导和富有见地的讨论，这些促成了本模型的建立。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.1% 2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS） | 赛默飞世尔科技 | 28997 | |
| AKP底物试剂盒 | 伯乐（BioRad） | 172-1063 | |
| BALB/c 小鼠 | Jackson | ||
| CellTrace™ CFSE 细胞增殖检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | C34554 | |
| CFA H37Ra | 贝克顿·迪金森（Difco Bacto） | 231131 | |
| FcR封闭试剂 | Milteyi | 130-092-575 | |
| 通用补充剂 | 赛默飞世尔科技 | HPRG770 | |
| HepaRG™ 细胞冻存 | 赛默飞世尔科技 | HPR GC10 | |
| 活/死可固定Aqua死细胞染色试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | L34965 | |
| NaHCO₃ | 默克生命科学 | S5761 | |
| Percoll® | Millipore Sigma | P1644-1L | |
| 百日咳毒素 | List Biologicals | 180 | |
| 磷酸盐缓冲液 pH 7.4 | 各种 | ||
| 皮尔斯™ 蛋白酶抑制剂小片剂，无EDTA | 赛默飞世尔科技 | 88666 | |
| 氢氧化钾 | JT Baker | 3140-01 | |
| S-乙基三氟硫代乙酸酯（S-ETFA） | 默克生命科学 | 177474 | |
| Slide-a-lyzer透析盒（10 K，12 ml） | 赛默飞世尔科技 | 66810 | |
| UltraPure™ 10% SDS 溶液 | 赛默飞世尔科技 | 24730020 | |
| Williams E 培养基，不含酚红 | ThermoFisher | A1217601 |
参考文献
- Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease. World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).
- Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
