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利用纳米等离子体增强散射与低倍显微镜成像定量肿瘤来源的外泌体

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DOI：

10.3791/59177

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2019年5月24日

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1Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, West China Hospital of Sichuan University, 2Virginia G. Piper Biodesign Center for Personalized Diagnostics, The Biodesign Institute, Arizona State University, 3School of Biological and Health Systems Engineering, Arizona State University, 4Department of Electrical and Computer Engineering, North Dakota State University

本文内容

摘要

外泌体来源的疾病及恶性细胞生物标志物在临床转化中受到缺乏快速且准确定量方法的限制。本报告描述了利用低倍暗场显微镜图像对外泌体特定亚型在少量血清或血浆样本中进行定量分析的方法。

摘要

感染细胞或恶性细胞常分泌更多的外泌体，导致循环中外泌体中与疾病相关的成分水平升高。这些外泌体有望作为疾病诊断的生物标志物，并用于监测疾病进展及治疗反应。然而，大多数外泌体分析流程需要进行外泌体的分离和纯化步骤，这些步骤通常耗时且劳动密集，因此在临床环境中应用受限。本报告描述了一种无需单独分离和纯化步骤即可快速分析外泌体外膜上特定生物标志物的方法。该方法利用针对外泌体的特异性抗体将外泌体捕获在载玻片表面，随后与偶联纳米颗粒的疾病特异性抗体探针进行杂交。杂交完成后，通过分析结合纳米颗粒的低倍暗场显微镜（LMDFM）图像，确定目标外泌体群体的丰度。该方法易于在科研和临床中推广应用，用于分析与疾病相关的膜结合型外泌体生物标志物。

引言

外泌体由大多数细胞类型释放，在细胞间通讯中发挥关键作用，包括参与多种疾病相关的病理生理过程，因为它们能够靶向特定组织或细胞类型，并含有多种核酸、蛋白质和脂质，这些成分反映了其来源细胞的特征，并可对受体细胞产生调控作用1,2,3,4。在疾病状态下，外泌体常以较高水平分泌，能够与邻近或远端的细胞相互作用，并在血液循环以及大多数其他体液中以相对较高的浓度存在，这些体液包括唾液、尿液、胰液、胆汁以及支气管肺泡灌洗液5,6,7,8,9,10,11。外泌体在人体体液中的丰富性与稳定性，加之其富含信息的特性，使其成为疾病诊断和治疗监测的理想生物标志物。

这包括肿瘤来源的外泌体（TDEs），其含有肿瘤特异性或选择性因子，可作为疾病生物标志物，包括与肿瘤相关的突变等位基因。TDEs 可参与肿瘤微环境的重塑，促进肿瘤的发生和发展及转移，并调控抗肿瘤反应。12外泌体分泌增加是大多数癌症及肿瘤微环境多种特征的常见表型，已知缺氧、酸性pH值和炎症等均可促进外泌体的释放。令人意外的是，尽管有多种细胞均可分泌外泌体，但总外泌体水平的升高本身即可作为癌症生物标志物。例如，最近一项研究发现，细胞外囊泡（EV）的总浓度在 胆汁 果汁可区分常见恶性与非恶性病变 胆汁 100% 准确识别胆管狭窄患者7. 其他体液（包括血浆）的研究也发现了类似结果。然而，由于个体间存在差异以及其他混杂因素的影响，大多数将外泌体作为疾病生物标志物的研究均聚焦于检测选择性地与肿瘤来源外泌体（TDEs）相关的生物标志物，而非总外泌体数量。

然而，将外泌体生物标志物转化为临床实践仍然具有挑战性，因为大多数已报道的外泌体检测方法需要耗时且劳动密集的分离步骤13。目前常用的外泌体分离方法包括超速离心法、密度梯度法、尺寸排阻法、共沉淀法、亲和捕获法以及微流控分离技术。其中，超速离心法被视为“金标准”方法，也是最常用于外泌体分离的技术，但该过程耗时较长，且会导致外泌体损伤和外泌体膜聚集，并产生含有蛋白质、脂蛋白及其他可能影响后续分析因素的污染样本14。大多数外泌体分离方法（包括超速离心法）难以区分通过不同机制产生、具有不同功能的外泌体（30–150 nm）、微囊泡（100–1000 nm）和凋亡小体（100–5000 nm），这是由于这些颗粒在尺寸上存在重叠以及外泌体群体本身的异质性所致15。迫切需要开发新方法，以在提高外泌体回收率的同时减少外泌体损伤和污染，从而提升外泌体检测的灵敏度与可重复性；然而，基于此类方法的任何检测技术还需进一步优化，才能适用于临床环境中的转化应用。

最近几项研究提出采用集成化平台直接从体液中捕获并分析外泌体。这些方法利用微流控、电动力学、亲和捕获等多种技术进行外泌体分离，并通过电化学、表面等离子共振及其他方法检测已捕获的外泌体。由于复杂性高、成本昂贵、通量低或其他问题，其中许多方法在临床环境中的可行性尚不明确。

我们开发了一种快速且低成本的检测方法，可用于对总外泌体及特定外泌体亚型（包括与疾病相关的外泌体，如肿瘤来源外泌体TDEs）进行高灵敏度和高特异性的定量分析。该方法仅需少量样本，并采用简化的操作流程，适用于临床环境。在该检测中，将载玻片包被抗体，这些抗体可结合外泌体表面表达的外泌体特异性或疾病特异性标志物，从而直接捕获加样至载玻片孔中的小体积血浆或血清样本中存在的目标外泌体。捕获的外泌体随后与偶联抗体的纳米颗粒发生杂交反应，该纳米颗粒可识别这些外泌体上感兴趣的生物标志物，该标志物可以是通用的外泌体标志物，也可以是特定外泌体亚型特有的因子。然后使用暗场显微镜（DFM）采集各样本孔的图像，并分析来自结合在外泌体上的纳米颗粒的散射光强度，以实现定量检测6,16,17。值得注意的是，通过低倍暗场显微镜（LMDFM）对整个样本孔成像，可避免在高倍暗场显微镜分析中因用户需手动选择成像视野而引入的选择偏倚。LMDFM图像分析可能受到表面不规则结构（如划痕和样本碎片）引起的光散射伪影干扰，但可通过我们开发的一种简单的降噪算法有效降低此类背景干扰，该算法可在NIH图像分析软件ImageJ（https://imagej.nih.gov/ij/）上运行。该算法首先应用一个输入轮廓阈值，用于检测样本孔的边界，从而定义后续分析的图像区域；然后将该轮廓区域内的图像信号按红、蓝、绿三个通道分离，并用红色通道减去蓝色通道，以消除由表面伪影和照明不均产生的信号对纳米棒信号的干扰。

本文介绍了如何利用该检测方法快速定量血浆或血清样本中的总外泌体水平或特定外泌体水平。

方案

1. 纳米颗粒探针的制备

注意：本实验采用功能化金纳米棒（AuNRs；直径25 nm，长度71 nm），其表面共价结合了中性亲和素聚合物（AV），在暗场显微镜（DFM）照射下，表面等离子体共振峰产生红色散射信号（峰值波长641 nm）。

  1. 将40 µL AuNR-AV（2.56 × 1011 个颗粒）用200 µL PBS（pH 7.0）洗涤三次，每次通过离心和吸除上清完成（4 °C下8,500 × g 离心10分钟）；最后一次离心并吸除上清后，将AuNR-AV沉淀重悬于40 µL PBS中。
  2. 将上述AuNR-AV悬液与10 µL生物素化抗体（0.5 mg/mL）及150 µL PBS混合，该抗体特异性识别目标外泌体亚型表面的抗原；随后在4 °C下使用混匀仪孵育2小时，使中性亲和素-生物素结合反应充分完成。
  3. 将所得的抗体偶联金纳米棒（AuNR-IgG）通过离心和吸除上清洗涤三次（4 °C下6,500 × g 离心10分钟），然后重悬于200 µL PBS中，4 °C保存备用。
    注意：必须采用无菌操作并尽量缩短储存时间，以避免AuNR-IgG污染或降解。建议在抗体偶联后24小时内使用。

2. 外泌体捕获载玻片的制备

  1. 用 PBS 将选定的外泌体捕获抗体稀释至 0.025 mg/mL，并将此稀释液 1 µL/孔加入多孔蛋白 A/G 载玻片中，然后将载玻片置于湿盒中 37 °C 孵育 1 小时，使捕获抗体结合到固定在载玻片上的蛋白 A/G 上。
  2. 抽吸各孔以去除未结合的抗体，用 PBS 每孔加入并抽吸 1 µL 洗涤 3 次，然后每孔加入 1 µL 封闭缓冲液（见材料表），并将载玻片在湿盒中 37 °C 孵育 2 小时，以封闭剩余的蛋白结合位点。
  3. 抽吸各孔以去除封闭缓冲液，用 PBS 每孔加入并抽吸 1 µL 洗涤 3 次，随后立即使用封闭后的载玻片进行外泌体捕获与分析。

3. 标准曲线制备

  1. 为了准确定量特定外泌体亚型的绝对或相对丰度，用户必须使用均匀表达目标外泌体表面生物标志物的纯外泌体群体生成标准曲线。本研究分析表达与转移相关的膜蛋白Ephrin A2受体的外泌体丰度，该蛋白已被报道与胰腺癌分期及预后相关6,18。
    注意：人胰腺癌细胞系PANC-1及其外泌体已知表达该蛋白，本实验采用该细胞系分离的外泌体构建标准曲线，用于定量复杂外泌体样本中表达该蛋白的外泌体数量。
  2. 在无血清培养基中于37 °C培养细胞48小时，使外泌体在培养基中积累，随后通过离心悬浮培养物或直接吸取贴壁细胞培养物的培养基来收集细胞培养上清液。
  3. 将收集的培养基在2000 × g 条件下离心30分钟，以去除碎片，并回收上清液。
  4. 使用适当容量的0.45 µm低蛋白结合滤器装置（例如250 mL聚醚砜真空过滤装置）过滤澄清后的培养上清液。
  5. 使用截留分子量为100,000的滤器系统，在3200 × g 条件下离心浓缩滤液至终体积250 µL。收集滤器中截留的体积，然后用200 µL PBS洗涤滤器，并将洗涤液与收集的外泌体样品合并。
  6. 将此样品在21,000 × g 条件下离心45分钟，小心回收上清液，注意避免收集任何沉淀物质。
  7. 将回收的上清液在100,000 × g 条件下离心3小时，以沉淀外泌体。吸除上清液，并将外泌体沉淀重悬于100 µL PBS中。
  8. 若在24小时内使用，将所得外泌体悬液储存于4 °C；如需长期保存，则储存于-80 °C。
    注意：避免对外泌体样品进行反复冻融。
  9. 混匀后取一部分外泌体悬液，通过直接计数外泌体数量（例如纳米颗粒追踪分析、可调电阻脉冲传感技术）或测定外泌体裂解物的蛋白浓度（如微定量双辛可宁酸法或其他等效方法）来估算外泌体数量16,19。
  10. 对外泌体悬液进行一系列梯度稀释，以便将纳米颗粒信号与输入的外泌体数量或蛋白含量进行比较。
  11. 将每种外泌体标准品各1 µL转移至检测板中的复孔中。
    注意：标准曲线可用于计算纳米颗粒信号与外泌体浓度之间相关性直线的斜率，以（1）评估检测性能，以及（2）确定实验样品中目标外泌体的相对浓度。

4. 处理人血浆或血清样本

  1. 采用标准方法收集血浆或血清样本，并于 -80 °C 保存，直至进行外泌体分析。在室温水浴中快速解冻样本。通过反复颠倒混匀，使解冻后的样本形成均匀悬浮液。
    注意：由于凝血过程中会大量释放外泌体，血清与血浆样本的检测结果可能不具等效性。
  2. 将血浆或血清样本在 500 × g 条件下离心 15 分钟，以沉淀蛋白聚集体及其他碎片。取部分血浆或血清样本转移至新管中，加入 PBS 制备成 1:1 稀释液。根据需要，通过轻柔涡旋或颠倒混匀稀释后的样本。将每种血浆或血清悬浮液各取 1 µL 加入检测板中相应的复孔孔位。

5. 外泌体捕获与检测

  1. 在已封闭的EV捕获载玻片的孔中加入1 µL/孔的外泌体样本，每个样本设置8个复孔，并将载玻片置于湿盒中4 °C孵育过夜。吸除所有样本孔中的液体，然后每孔加入1 µL PBS洗涤孔，以去除未结合的外泌体及其他污染物。
  2. 向样本孔中加入1 µL/孔预先制备的AuNR-IgG悬浮液（见上述第1节），将载玻片置于湿盒中37 °C孵育2小时。吸除纳米颗粒溶液，用含0.01% Tween-20的PBS（PBST）在混合仪上洗涤载玻片10分钟，随后吸除液体，再用去离子水在旋转混合仪上洗涤所有样本孔10分钟，最后空气干燥，用于后续LMDFM成像。
    注意：通过同一样本的八个复孔评估板间变异系数（CV）。若样本CV值>20%，则视为无信息价值，如有足够样本应重复实验。

6. DFM 图像采集

  1. 使用配备暗场聚光镜（1.2 < NA < 1.4）和4倍物镜的显微镜，结合数字相机，在光照条件一致的情况下拍摄外泌体定量图像，曝光时间为1/220秒。
  2. 打开图像采集软件。
    注意：本方案中我们使用NIS-Elements显微成像软件（见材料表），但也可使用其他能够匹配其图像采集参数的软件。NIS-Elements Viewer成像软件是一款免费的独立程序，可用于查看图像文件和数据集，包含分析、可视化和归档工具。以下参数同样适用于配备自动对焦和自动载物台的显微镜，该系统可自动拍摄多幅图像并拼接为单幅图像。
  3. 将载玻片倒置放置在显微镜载物台上，调整载玻片位置，并在载玻片背面（即聚光镜镜头接触的位置）滴加少量浸油。
  4. 点击软件界面中的实时按钮，根据高浓度标准样品孔调整曝光时间，确保图像不出现饱和。
  5. 从采集选项卡中打开扫描大图像窗口，并按如下设置软件界面参数：宏图像光学配置 = 当前；物镜：2:10x，扫描光学配置 = 当前，物镜：2:10x；拼接重叠率 = 20%；拼接方式 = 最优路径。
  6. 选择创建大图像、移动载物台期间关闭活动快门、每次采集前等待：20 ms、开始时手动对焦以及每20个视野进行一次步进对焦。这些设置将随扫描图像一同保存。
  7. 移动显微镜载物台以定义目标扫描区域的左、上、右、下边界。调节焦距使显示器上的图像清晰，并根据需要调整聚光镜设置和环境光照，以尽量减少聚焦图像中的光照不均现象。
  8. 在软件中为图像输出文件命名。点击扫描按钮，让显微镜自动扫描、生成并保存整张载玻片的拼接图像。
  9. 使用所选的图像采集软件打开已保存的图像，并将其以1/8比例保存，用于后续在ImageJ的DSM插件中进行分析。

7. DFM 图像分析

  1. 下载 ImageJ 程序（https://imagej.nih.gov/ij/）。按照 https://imagej.net/Plugins#Installing_plugins_manually 中列出的说明，将 DSM 算法插件安装到 ImageJ 中。
  2. 打开 ImageJ 软件，然后在 DSM 算法中设置以下输入参数：轮廓阈值 (Ct) = 253.020，类型 = 红色，中心尺度 (S) = 0.8，低 (Lt)/高 (Ht) 定量限 = 0/62。
  3. 使用 ImageJ 打开第 6.8 节中保存的图像。从 插件 选项卡中选择 DSM Scan 按钮，然后根据打开的图像定义列数和行数。该程序可自动识别检测区域，并分析相应区域内纳米颗粒的散射强度。在 DSM Scan 窗口中设置以下输入参数：调整大小百分比 = 25，斑点直径（像素） = 190 – 200，直径范围 = 32，直径增量（像素） = 8，DSM 配置 - 下限 = 0，上限 = 62，相邻距离 = 100，减去偏置 = 0。
    注意：纳米颗粒的散射强度结果反映了载玻片上结合的外泌体数量。

结果

使用多孔蛋白A/G包被载玻片（图1A），先用抗EphA2抗体进行功能化处理，随后用于特异性捕获来自胰腺癌患者及非胰腺癌患者血清样本中的EphA2阳性外泌体（每孔1 µL），再与偶联抗CD9抗体的金纳米棒孵育（图1B）。利用ImageJ软件中的DSM插件分析这些纳米颗粒散射的光信号，以定量各孔中结合的EphA2阳性外泌体。DSM算法可自动界定样本孔的边界，滤除来自划痕或碎片等伪影的噪声，计算每个孔的散射信号，并输出相应数据（图2）。该算法能显著抑制样本中划痕或杂质引起的光散射伪影，提高纳米颗粒检测的灵敏度和重复性，并可自动批量处理载玻片图像，适用于高通量分析。该算法通过用户在ImageJ中输入的命令和参数，实现图像背景扣除、各孔散射信号计算，并输出数据文件和图像文件（图3）。感兴趣区域由ImageJ宏程序中的轮廓阈值函数，根据捕获图像中高亮度的孔边界进行定义。图像分析采用预设的轮廓阈值和图像参数，计算每个孔中纳米颗粒散射的强度。

如我们先前的研究（Liang 等人6的补充信息）所述，从 PANC-1 细胞培养物中分离的外泌体经透射电子显微镜和蛋白质印迹法表征，其尺寸范围、形态特征及蛋白标志物表达均符合高纯度外泌体样本的特征。本研究采用与先前研究相同的方法制备 PANC-1 外泌体，用于验证我们开发的 nPES 检测法在外泌体定量中的应用。该检测法使用抗 EphA2 抗体捕获总外泌体群体中的大部分外泌体，并使用针对通用外泌体蛋白 CD9 的抗体检测被捕获的外泌体。对 PANC-1 外泌体样本进行系列稀释（蛋白浓度范围为 0.24 至 1.2 µg/µL）后检测，结果显示复孔之间具有良好的重复性（图 4A），散射信号响应值与外泌体蛋白浓度之间呈现显著的线性相关性（图 4B）。

为了展示该方法的潜在应用，我们分析了胰腺癌患者与非胰腺癌患者的血清样本，以检测表达癌症相关生物标志物EphA2的血清外泌体的丰度。实验中使用抗EphA2抗体直接从血清中捕获目标外泌体，并利用与抗CD9抗体偶联的纳米颗粒检测已结合的外泌体。分析结果显示，胰腺癌患者的血清样本中EphA2阳性外泌体水平显著高于对照组（图5）。

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图1：外泌体定量方案。 （A）本实验所用多孔蛋白A/G载玻片（192孔）的示意图。 （B）目标外泌体通过与载玻片结合的捕获抗体（如抗EphA2抗体）在表面固定后，直接从样本（包括血清和血浆）中捕获，随后与偶联检测抗体（如抗CD9抗体）的金纳米棒孵育，再通过暗场显微成像（DFM）分析进行检测。 请点击此处查看本图的高清版本。

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图2：通过将DSM算法应用于LMDFM图像进行外泌体定量。 低倍镜图像采用DSM算法处理，以消除由划痕、混合空隙、碎片及样品照明不均等因素引起的背景信号和信号伪影，从而实现对金纳米棒信号的稳健检测，该信号与外泌体浓度相关。本图经Sun, D. 等人许可改编自《分析化学》期刊发表的文章《低倍暗场显微镜远场图像中纳米颗粒光散射的噪声抑制方法》。 88 (24), 12001-12005 (2016)。版权所有 (2016) 美国化学学会。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图3：DSM算法命令与输出的示意图 指定步骤使用 ImageJ 的原生命令，所有输入参数均通过图形用户界面根据实验要求进行选择。该图已获许可改编自 Sun, D. 等人，低倍暗场显微镜远场图像中纳米颗粒光散射定量的降噪方法，《分析化学》。 88 (24), 12001-12005 (2016)。版权所有 (2016) 美国化学会。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图4：代表性纳米等离激元增强散射（nPES）液态微阵列荧光显微（LMDFM）图像及数字散斑显微（DSM）输出数据。（A）nPES检测分析PANC-1外泌体浓度梯度的LMDFM图像；（B）该载玻片上光学信号与外泌体浓度之间的线性相关性（从左至右：每列对应的外泌体浓度分别为0.24、0.356、0.53、0.80、1.20 µg/µL）。数据以均值±标准误表示，n=6，皮尔逊相关系数R2 = 0.99，各浓度重复样本的变异系数 < 0.2。请点击此处查看该图的高清版本。

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图5：EphA2的LMDFM信号+ 胰腺癌患者与非胰腺癌患者的血清外泌体存在差异。 使用抗 EphA2 捕获抗体（肿瘤相关）和抗 CD9 检测抗体（通用外泌体标志物）通过 nPES 分析血清样本，显示胰腺癌患者与非胰腺癌患者血清样本中 EphA2+ 外泌体浓度存在显著差异（N = 7/组）。结果以均值表示±中国台湾p = 0.002（双侧Mann-Whitney U检验）。该图改编自[Sun, D. et al. 低倍暗场显微镜远场图像中纳米颗粒光散射的噪声抑制方法。《分析化学》。 88 (24), 12001-12005 (2016)]. 请点击此处以查看该图的放大版本。

讨论

外泌体来源于早期内体膜的规律性内陷，形成多泡体，这是一种特殊的内体亚群，其内部含有大量腔内小泡，这些小泡通过与细胞质膜融合，将成熟的外泌体释放到细胞外空间。由于这一生物发生途径，外泌体可携带与构成或融合至内体膜的膜组分相关的膜结合因子，以及多种不同类型的胞质成分，因此其内含物包括蛋白质、DNA 和多种 RNA 亚型（mRNA、微小 RNA、长链非编码 RNA），这些成分可反映其来源细胞的表型特征20。由于外泌体几乎可由所有细胞类型分泌，且在病变或恶性细胞中分泌量可能增加，并可在大多数体液中积聚，因此外泌体正受到全面而系统的研究，被视为一种极具前景的微创手段，用于检测特定疾病状态并监测其对治疗的反应21。

外泌体分离是目前大多数外泌体分析所必需的步骤，但该过程耗时且劳动密集，限制了具有潜在医学意义的外泌体相关生物标志物在临床上的转化应用。许多常用的分离方法（如超速离心法、尺寸排阻法、沉淀法等）由于外泌体（30–100 nm）、微囊泡（100–1000 nm）和凋亡小体（100–5000 nm）在尺寸范围或物理特性上存在重叠，往往难以充分区分这些组分，或可能破坏外泌体的完整性15。目前已有新的技术方法正在开发中，有望实现更快速的外泌体分析，但由于种种原因，尚不清楚其中许多平台在临床环境中实施的可行性如何。

在本报告中，我们提出了一种新方法，该方法利用低倍暗场显微镜图像实现基于纳米颗粒的高通量外泌体定量。该方法无需外泌体纯化、昂贵的专用设备或新颖的技术专长，因此可快速应用于大多数科研和临床环境。当将检测结果与标准曲线进行比较时，我们的检测方法可用于精确定量携带特定生物标志物的目标外泌体群体的浓度，因为我们的结果显示光学响应与外泌体浓度之间存在强烈的线性相关性（R2 = 0.99）。为展示该方法的实际应用潜力，我们提供了相关数据，其中我们采用该方法对来自胰腺癌患者和非胰腺癌患者的血清样本中与胰腺癌相关的外泌体生物标志物浓度进行了定量分析。

在LMDFM中，会对整个样品孔进行成像，以避免高倍DFM分析中存在的选择偏差问题。在高倍DFM分析中，用户必须手动选择用于后续图像分析的视野区域。然而，LMDFM易受表面不规则性（如划痕和样品碎片）引起的光散射伪影影响。可通过使用我们开发的DSM降噪算法来降低此类背景干扰，从而检测目标外泌体来源信号，该算法运行于美国国立卫生研究院（NIH）的图像分析软件ImageJ上。但仍需注意避免引入此类伪影，以免降低检测的动态范围。

本实验所用材料：

用于承载1 µL/孔的多孔SuperProtein A/G载玻片购自Arrayit公司（货号：AGMSM192BC）。纳米颗粒购自Nanopartz公司（货号：C12-25-650-TN-DIH-50-1，浓度为6.4 × 1012/mL）。DFM图像采用连接于Nikon Ti-Eclipse显微镜的Nikon DiR2数码相机拍摄，照明条件保持一致，曝光时间为1/220秒。本研究中使用的PANC-1细胞系购自美国模式培养物集存库（ATCC）。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

该项工作主要由美国国立卫生研究院（NIH）的研究经费（U01CA214254）资助， R01HD090927、R01AI122932、R01AI113725 和 R21Al126361-01 亚利桑那州生物医学研究委员会（ABRC）青年研究者奖

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Eppendorf Repeater streamFisher Scientific05-401-040
Eppendorf Research plusEppendorf31200000110.1 – 2.5 µL，深灰色
功能化金纳米棒NanopartzC12-25-650-TN-DIH-50-1体外中性亲和素聚合物功能化
HulaMixer 样品混合器Thermo Fisher Scientific15920D
Incu-shaker 10LBenchmark ScientificH1010
倒置研究显微镜NikonTi-DH配备暗场聚光镜、DS-Ri2 相机、Ti-SH-U 通用支架和电动载物台
NIS-ElementsNikon显微镜成像软件
磷酸盐缓冲液 (1X)GE Healthcare Life SciencesSH30256.02HyClone
经蛋白A/G处理的玻璃基底载玻片Arrayit Corp.AGMSM192BC高品级微阵列基底
Q500 超声波破碎仪Qsonica, LLCQ500-110配备标准探头 (#4220)
Superblock 封闭缓冲液Thermo Scientific
TWEEN 20Sigma Life Sciences9005-64-5

参考文献

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