由于缺乏快速准确的定量方法, 病细胞外衍生的病性和恶性细胞生物标志物的临床翻译受到阻碍。本报告描述了使用低放大暗场显微镜图像来量化小体积血清或血浆样本中的特定外源亚型。
感染或恶性细胞经常分泌更多的外显子, 导致在循环中的疾病相关外显子的水平升高。这些外显子有可能成为疾病诊断的生物标志物, 并监测疾病进展和治疗反应。然而, 大多数外显子分析程序需要外显子分离和纯化步骤, 这通常是耗时和劳动密集型的, 因此在临床环境中的效用有限。本报告描述了一个快速的程序来分析特定的生物标志物外膜外膜, 而不需要单独的分离和纯化步骤。在这种方法中, 外显子体被外细胞特异性抗体捕获在滑块表面, 然后与特定于疾病的纳米粒子共轭抗体探针杂交。通过对结合纳米粒子的低放大暗场显微镜 (LMDFM) 图像的分析, 确定了结合纳米粒子的目标外显子群的丰度。这种方法可以很容易地用于研究和临床应用, 以分析膜相关的外源生物标志物与疾病。
外质体从大多数细胞类型中释放出来, 并在细胞间通信中发挥着关键作用, 包括与各种疾病有关的病理生理过程, 因为它们可以是特定组织或细胞类型的家园, 并含有各种核酸, 蛋白质和脂质, 反映其来源细胞, 并能对其接受细胞1,2,3,4产生调节作用。外质体通常在疾病状态下在较高的水平上分泌, 可以与相邻和遥远的细胞相互作用, 在循环中以及包括唾液、尿液、胰腺和胆汁在内的大多数其他体液中发现的浓度相对较高果汁和支气管肺泡灌洗液5,6,7, 8,9, 10, 11.人体体液中外显子体的丰富和稳定, 加上其信息丰富的性质, 使其成为疾病诊断和治疗监测的理想生物标志物。
这包括肿瘤衍生的外显子体 (TDEs), 其中包含肿瘤特有或选择性的因素, 可作为疾病的生物标志物, 包括肿瘤相关的突变等位基因。TDEs 可以参与肿瘤微环境的重塑, 促进肿瘤的发展和转移, 调节抗肿瘤反应12。TDE 分泌的增加是大多数癌症的常见表型, 肿瘤微环境的几个特征, 包括缺氧、酸性 pH 值和炎症, 已知会促进外溶酶分泌。令人惊讶的是, 考虑到分泌外显子体的细胞数量, 总外体细胞水平的增加本身就能起到癌症生物标志物的作用。例如, 最近的一项研究发现, 胆汁汁中的 ev 总浓度以100% 准确的方式鉴别胆总管狭窄患者的恶性和非恶性7。使用包括血浆在内的其他体液的研究也发现了类似的结果。然而, 由于可能会受到学科变异的影响, 以及其他混淆因素, 大多数研究将外质体作为疾病生物标志物进行调查, 其重点是检测有选择地与 TDEs 相关的生物标志物, 而不是总外质数字。
然而, 将外显子生物标志物转化为临床实践仍然具有挑战性, 因为大多数报告的外显子检测方法需要耗时和劳动密集型的隔离程序13。目前流行的外植体分离方法包括超离心、密度梯度、大小排除、共沉淀、亲和力捕获和微流体分离方法。超离心是 “金标准” 方法, 最常用于外相分离, 但这一方法非常耗时, 会导致外染色体损伤和外膜聚类, 并产生被污染的外染色体样品。蛋白质、脂蛋白和其他因素, 可以影响随后的分析14。大多数外显子分离方法, 包括超离心, 不能将外周细胞 (30–150 nm) 与微囊 (100–1000 nm) 和凋亡体 (100–5000 nm) 分离, 由于其大小, 微囊和凋亡体 (100–5000 nm) 产生于不同的机制, 具有不同的功能这些群体之间的重叠, 以及外显子种群的多样性15。需要新的方法来提高外显子检测的灵敏度和重现性, 方法是改善外显子检测的恢复, 同时减少外显子的损伤和污染, 尽管基于此类方法的任何检测也需要进行优化, 以实现这些检测适用于临床应用的转换。
最近的几项研究建议使用集成平台直接从体液中捕获和分析外显子。这些方法采用微流体、电动、亲和力捕获和其他各种外显子分离方法, 以及电化学、表面等离子体共振和其他检测捕获的外质体的方法。目前尚不清楚其中许多方法在临床环境中的可行性, 因为它们的复杂性、费用、低吞吐量或其他问题。
我们开发了一种快速而廉价的检测方法, 可用于对总外显子和特定外显子体亚型进行敏感和具体的定量, 包括与疾病相关的外显子体, 如 Tde, 它只需要少量的样本,采用适用于临床环境的简化工作流程。在此检测中, 幻灯片上涂有抗体, 这些抗体结合在外生体表面表达的特定于外体细胞或疾病特异性标记, 以便直接捕获小体积血浆中存在的目标外溶体或应用于油井上的血清样本。幻灯片。然后, 捕获的外质体与抗体共轭纳米粒子杂交, 该纳米颗粒识别这些外显子上感兴趣的生物标志物, 这些外观体可以是一般的外显子标记, 也可以是感兴趣的外质亚型特有的因素。然后使用暗场显微镜 (dfm) 采集这些样品井的图像, 并对其进行分析, 以测量在每个样品井6、16、17中捕获的纳米颗粒中的散射光。值得注意的是, 通过低放大倍率 DFM (LMDFM) 对整个样品进行成像, 可避免高放大度 DFM 分析在用户必须直接选择要捕获的字段以便进行后续图像分析时遇到选择偏差。LMDFM 图像分析受表面不规则性 (包括划痕和样品碎片) 光散射伪影的影响, 但使用我们开发的简单降噪算法可以在 NIH 图像分析程序上运行,ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/)。该算法首先应用输入轮廓阈值, 用于检测样本的边界, 以定义图像的区域, 供后续分析。然后将此等高线区域定义的区域拆分以分离图像的红色、蓝色和绿色通道中存在的信号, 并从红色通道中减去蓝色通道, 以消除表面伪影产生的信号和纳米棒的不均匀照明信号。
本文介绍了如何使用此检测快速量化血浆或血清样本中的总或特定外体细胞水平。
外质体产生于外胚乳膜的调节入侵, 产生多个囊泡体, 这是一个特殊的内质子子集, 其中包含大量的内胚层囊泡, 与质膜融合后释放成熟外显子进入细胞外空间。由于这种生物发生途径, 外质体可以携带与膜分裂相关的膜结合因子, 这些膜与内共生膜以及多种不同类型的细胞质成分有关, 因此含有蛋白质、DNA。和各种 RNA 亚型 (Mrna, 微 Rna, 长非编码 Rna), 可以反映其起源细胞的表型 20.由于外显子体是由大多数 (如果不是所有的细胞类型) 分泌的, 可以表现出更多的分泌, 从病变或恶性细胞, 并积累在大多数体液外显子体是一个有希望的全面和系统的研究的主题, 作为一个有希望的最低限度的研究侵入性手段, 以检测特定的疾病状况, 并监测他们对治疗的反应21。
在大多数当前的外显子分析中, 需要进行外显子隔离是一个漫长而劳动密集型的过程, 它限制了具有潜在医学相关性的外细胞相关生物标志物的临床翻译。许多常见的分离方法 (超离心、尺寸排除、沉淀等) 由于其大小范围或范围内的重叠, 往往不能充分区分外显体 (30–100 nm) 和微囊 (100–1000 nm) 和凋亡体 (100–1000 nm)。物理特性或可能损害外显子的完整性15。目前正在制定新的方法, 可能会允许更快速的外部分析, 但不清楚在临床环境中实施其中许多平台的可行性如何。
在本报告中, 我们提出了一种新的方法, 允许基于纳米粒子的高通量外量量化使用低放大暗场显微镜图像。这种方法不需要外显子纯化、昂贵的专用设备或新颖的技术专长, 因此在大多数研究和临床环境中都应易于快速翻译。当将检测结果与标准曲线进行比较时, 我们的检测可用于精确量化带有特定生物标志物的目标外显子群的浓度, 因为我们的结果显示出强烈的线性相关性 (R2 = 0.99)在光学响应和外显子浓度之间。为了证明这种方法的现实世界潜力, 我们提供了数据, 在这些数据中, 我们使用这种方法来量化从有和有非患者身上获得的血清样本中与胰腺癌相关的外源生物标志物的浓度胰腺癌。
在 LMDFM 中, 对整个样品井进行了成像, 以避免在高放大度 DFM 分析中发现的选择偏差, 用户必须直接选择样本字段进行捕获, 以便随后进行图像分析, 但容易受到表面光散射伪影的影响不规范, 包括划痕和样品碎片。使用 NIH 图像分析程序 imagej 上运行的 DSM 降噪算法, 可以减少此背景以检测目标外部源信号, 但仍需注意避免引入此类伪影, 这可能会降低的检测方法。
本分析中使用的材料:
从 Arrayit 公司 (AGMSM192BC) 购买了保存 1μl/well 的多井超蛋白质 a 幻灯片。纳米粒子是从 Nanopartz (C12-25-650-TN-DH-50-50-1,6.4 x10 12/ml) 中获得的。DFM 图像是用连接在尼康 Ti-Eclipse 显微镜上的尼康 DiR2 数码相机拍摄的, 光线一致, 曝光时间为半。本研究中使用的 PANC-1 细胞系是从美国类型的文化收藏中购买的。
The authors have nothing to disclose.
这项工作主要得到亚利桑那州生物医学研究委员会 (ABRC) 青年调查员的研究资金的支持 (U01CA214254、R01HD090927、U01CA214254、R01AI113725 和 R21Al126361-01)。
Eppendorf Repeater stream | Fisher Scientific | 05-401-040 | |
Eppendorf Research plus | Eppendorf | 3120000011 | 0.1 – 2.5 µL, dark gray |
Functionalized Gold Nanorods | Nanopartz | C12-25-650-TN-DIH-50-1 | In vitro neutravidin polymer functionalization |
HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | |
Incu-shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | |
Inverted Research Microscope | Nikon | Ti-DH | With Dark field condenser, DS-Ri2 camera, and Ti-SH-U universal holder, and motorized stage |
NIS-Elements | Nikon | Microscope imaging software | |
Phosphate Buffered Saline (1X) | GE Healthcare Life Sciences | SH30256.02 | HyClone |
Protein A/G Treated Glass Substrate Slides | Arrayit Corp. | AGMSM192BC | Premium microarray substrate |
Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Q500-110 | With standard probe (#4220) |
Superblock blocking buffer | Thermo Scientific | ||
TWEEN 20 | Sigma Life Sciences | 9005-64-5 |