方法文章

远程实验室管理：呼吸道病毒诊断

DOI：

10.3791/59188

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2019年4月6日

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1Baylor Global Health, Baylor College of Medicine, 2Department of Medicine, Baylor College of Medicine, 3Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

已设计并建造了一种可快速部署、独立运行的实验室，适用于偏远且资源有限的全球地区。本文探讨了经过物流优化、可扩展、多功能实验室模块的特点及关键要素。同时制定并展示了基本实验室工作流程的检查清单，以及一项呼吸道病毒诊断检测的操作方案。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

近年来疫情（如埃博拉、寨卡、中东呼吸综合征、流感等）频发，凸显出对一种更灵活、协调的应对机制的迫切需求，该机制需解决从交通运输、资源获取、设施设备、通信到医护人员培训等多方面问题。为满足这一需求，我们开发了一种创新性、可扩展、强化物流支持的移动式实验室设施，适用于资源受限的全球环境中的紧急情况和疫情应对。基于学术医疗中心临床运营的经验，我们设计了一种可快速部署的模块化生物安全二级（BSL-2）和生物安全三级（BSL-3）实验室设施，并配备用户友好的软件系统，用于在偏远地区疫情暴发期间对药品和物资进行追踪与管理。本文介绍了我们的多式联运、可移动、可扩展的集装箱式实验室单元。该实验室设计通过降低能耗并支持替代水源，实现了离网运行。单元的信息通信技术（ICT）平台提供（i）基于平板电脑的便捷文档记录功能，（ii）对患者和物资的强化追踪能力，以及（iii）集成现场通信功能，并内置远程医疗支持。为确保在偏远环境中的质量控制，我们制定了一份基础实验室工作流程检查清单，以及一项采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）进行呼吸道病毒诊断的标准化操作规程。如所述，这一创新且全面的方法可在资源有限的全球环境中提供可靠的实验室检测能力。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

快速诊断是及时控制病毒感染的关键工具，尤其是在早期症状与多种感染性疾病难以区分的情况下。最近西非的埃博拉疫情（2014–2015年）1,2、亚洲和拉丁美洲的寨卡病毒暴发（2015–2016年）3,4、中东呼吸综合征（MERS）冠状病毒的出现5,6，以及美国异常致命的流感（influenza）疫情（2017–2018年）7,8，暴露出对可快速部署的实验室设施的迫切需求，这些设施需解决运输、可及性、基础设施、设备和通信等多方面问题。

离网运行能力（自主供电、供水等）在资源有限的全球农村地区至关重要9,10,11。我们基于贝勒医学院在临床运营和全球项目中的经验，设计并建造了一种基于集装箱的移动式实验室，具备易于部署、快速搭建和多功能使用（BSL-2 和 BSL-3）的能力。该多功能、物流优化的实验室设施如图1所示。

这种可快速部署的实验室设施采用可扩展设计，类似于贝勒医学院（Baylor College of Medicine）开发并由美国国际开发署（USAID）资助的先前描述的集装箱诊所（“应急智能舱”）12,13,14。单个打包单元（运输模式下）的尺寸为9英尺9英寸 × 8英尺 × 8英尺（图1A、B），展开后面积可达170平方英尺（15.75 m2）（图1C、D）。该单元可在十分钟内由两至四人完成部署。

该远程实验室按照生物安全二级（BSL-2）实验室设施建造（图2A），并配备一个独立的、模块化的、可附加的生物安全三级（BSL-3）单元（图2B），专为处理可能通过吸入导致严重或潜在致命性疾病的传染性病原体而设计15。两个实验室模块之间的连通性可实现实验工作流程的优化、资源共享以及成本节约（图2C-E）。

这些模块具有气密性和防水性，可提供舒适且节能的移动式庇护所。采用暖通空调系统（HVAC）实现集中式、温度可控的单元管理。通常情况下，实验室单元的设计通过使用太阳能电池板和/或独立发电机等替代电源，最大限度地降低能耗。每个单元均配备水槽和洗眼装置、电源接口及供水接口（图3A-C）。信息与通信技术平台提供一个可选的基于平板设备（Android手机/平板或iPhone/iPad）的记录应用程序，用于物资追踪和实验结果记录（图3D），该程序由贝勒大学信息技术（IT）研究团队合作开发，该团队在网络连接受限的偏远环境中具有丰富的工作经验。该系统可通过蜂窝网络或无线信号运行，支持在无网络连接时进行数据记录，并在网络恢复后立即自动备份或传输至基于安全云的服务器。

实验室具备多项关键的感染控制功能，包括：（a） 负压气流，(b) 手套箱或生物安全柜，(c) 健康风险管理系统：采用四级防护的杀菌紫外（UV-C）照明系统，可消除99.7%导致医疗相关感染的病原体。该设施可使用过氧化氢或次氯酸钠（漂白剂）系统进行高效且有效的消毒。16

确保实验室结果的质量依赖于对整个诊断检测过程所有环节的全面评估。本文提供了一份适用于生物安全二级（BSL-2）和生物安全三级（BSL-3）实验室的工作流程检查清单，以及一种快速呼吸道病毒诊断检测的实验方案。病毒性疾病的诊断依赖于通过实时逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）在样本（如鼻洗液、血液、粪便和尿液等）中检测病毒RNA或DNA。PCR技术能够快速估算样本中的病毒载量，因此成为病毒性疾病筛查的有效工具17,18。新型分子诊断检测方法的应用，拓展了对埃博拉病毒19,20,21、流感病毒8,22以及结核病（TB）23等病毒的诊断能力。

本研究的目的是验证一种新型模块化、可快速部署的实验室设施，并为在疫情、自然灾害或其他紧急救援情况下于偏远、资源匮乏环境中工作的实验室人员提供培训指南。本文介绍了在此创新性便携式实验室中进行呼吸道流感诊断的操作方案。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 安装

注意：部署该设备仅需 2-4 人 "乐高式" 实验室单元。理想情况下需4人共同操作，但2人也可完成部署。

  1. 使用叉车（图1A、B）或其他合适的起重设备搬运集装箱。应使用起重能力至少为七吨的叉车来搬运两种类型的集装箱24。
  2. 为设置实验室单元，选择一块约90 × 60平方英尺（27.4 × 18.3 m2）的平坦区域，确保无任何障碍物妨碍合理布局。确保该地点土壤排水良好，以保障场地排水，避免降雨后出现积水问题。应使用此前已整平且为坚硬压实土壤的场地，其最小抗压强度为10 kN/dm2。周围区域应允许设备进入，以便从运输装置上卸载单元，并容纳完成任务所需的支持设备。
  3. 将单元（或多个单元）以“运输模式”放置在选定场地的中央，并调整水平。每个单元配备有四个调平千斤顶，可在最大坡度为6.5%（约4度）的场地上展开。集装箱的最小抬升高度约为6英寸，以确保地板排水口和排放管道正常工作。千斤顶伸出长度不得超过12英寸。将支撑支架连接到千斤顶臂上。通过在每个底部导轨中心放置气泡水平仪，确保集装箱处于水平状态。在未正确就位前，切勿展开单元！
  4. 通过打开面板以实现完全功能来展开单元。首先找到两段式支撑杆。连接支撑杆，使其高度接近集装箱单元的高度。该杆可帮助用户打开面板，并在侧门开启时支撑屋顶面板的重量。设有安全卡扣作为销钉以保持面板锁定。首先取下安全卡扣，然后从孔中提起并拉出凸轮锁销。将销钉置于杠杆后方，并远离位于集装箱底部（可扩展侧）的凸轮锁杠杆。
  5. 升起屋顶面板1，注意该面板配有气体支撑杆，一旦面板门解锁，支撑杆将释放。这使得用户可使用两段式支撑杆升起屋顶（面板1）。将支撑杆顶端移至屋顶面板下方，临时支撑其重量（图4A）。
    1. 在用支撑杆托住屋顶面板的同时，找到位于集装箱左上侧的安全链。在2-3人的协助下，小心地将面板2向下拖动，直至安全链拉直，承担面板2的重量并已啮合。
    2. 用手将绞盘带连接到凸耳安装座上，将其缠绕在气体支撑杆外部。注意：若无绞盘工具，前一步骤可由每侧至少两人手动完成，即人工托住并缓慢放下面板。
      警告：面板重量为260磅！
  6. 确保面板2移动路径上无人或障碍物，使用绞盘和电钻继续降低面板（图4B）。当面板2完全降下后，断开绞盘带并将其收回绞盘中。取下绞盘并放置在集装箱的另一侧，以备使用。单元两侧结构相同，另一侧应按照上述相同步骤操作。
  7. 为完成第一侧的展开，向下伸手至面板（当前为地板），每侧至少两人手动将面板3向上抬起就位，作为该侧的门和前墙（图4C）。两人继续固定面板3，第三个人则移除支撑杆。
    警告：在面板3墙体就位前，任何人不得进入单元内部或位于屋顶下方！
  8. 从面板3内部找到两个闩锁，并使用安全带将其锁紧。确保黑色屋顶面板的橡胶密封垫被拉出并朝向单元内部。此操作必须完成，以防止雨水或其他水分渗入单元。
    1. 从集装箱内部解锁面板4。解锁后，将面板4向外推（图4D），使其像门一样摆开。锁紧内墙上的两个安全闩锁。解锁面板5，并对面板4重复相同步骤。使用相同的内部安全闩锁固定该面板。当整个单元内部均已锁定后，重新拧紧花篮螺栓，直至地板和端墙完全密封。
  9. 当集装箱两侧均安全展开后，检查千斤顶，并对可能发生的位移进行必要的调整。每周检查一次遮蔽所是否水平。在经历极端天气（如降雨或大风）后，应检查集装箱上的千斤顶并相应调整。
  10. 若计划使用可连接的实验室模块，则展开第二个集装箱（图5）。
  11. 将单元连接至电源和供水系统。有关通过断路器箱将柴油发电机连接至单元的详细说明，请参见相应手册24。
    注：远程实验室单元现已部署完毕。单元内部不可压缩空间可用于存放特定诊断测试所需的最少设备和实验耗材。BSL-3模块的加压系统安装有详细说明24，且需要额外的质量控制24。

2. 个人防护与基础实验室操作流程清单

注意：一般安全和实验室检测要求的任一阶段出现错误，均可能导致整个检测过程的结果无效。

  1. 在准备进入已安装的实验室单元之前，确保已满足所有BSL-2或BSL-3级别的安全要求：穿戴适当的个人防护装备（PPE）、洗手、佩戴手套，并对将要使用的任何工作区域进行去污处理。
  2. 遵循表1中的检查清单，该清单包含在BSL-2实验室和BSL-3模块（组装的手套箱室——负压，以及PCR室——正压）中进行实验时的个人防护安全要求。
  3. 对实验室内的所有工作区域和用品进行去污处理。若计划使用0.5%次氯酸钠溶液（即液体漂白剂）对工作区和用品进行去污，还需使用70%乙醇清洁所有接触过漂白剂的区域，因为漂白剂可能与工作区内的其他化学品混合产生有毒气体。所有含漂白剂的废弃物应丢弃至指定的专用废物桶中。
  4. 在开始于实验室单元内工作前，应熟悉其内部布局和结构。在手套箱（GB）室内处理样本时需遵守严格规定。GB室为负压环境！操作手套箱前，请查阅制造商的操作说明。多个来源提供了关于手套箱操作的详细教程25。
    注意：本实验的目的是从样本中提取并纯化核糖核酸（RNA）或脱氧核糖核酸（DNA）（如存在）。提取的RNA/DNA将通过实时逆转录PCR（RT-PCR）检测目标病毒病原体——流感病毒（INF）的存在与否。

3. 在BSL-2实验室设施中通过RT-PCR快速诊断流感病毒

  1. 接收并登记
    1. 应用个人防护装备检查清单（见第2节）。INF为2类病原体，需采取BSL-2级防护措施。必须穿戴适用于BSL-2级操作的个人防护装备。此外，应佩戴安全护目镜和带袖口的实验服，以尽量减少皮肤暴露的潜在风险。
    2. 根据世界卫生组织（WHO）的建议26，使用带塑料杆的无菌涤纶或人造丝拭子从呼吸道采样。
      注意：棉质或海藻酸钙拭子，或带有木棒的拭子可能含有可使某些病毒失活并抑制PCR检测的化合物26,27.
    3. 从患者处采集样本拭子后，将其从现场或诊所运送至实验室。通过传递窗转移样本；该传递窗无法从两侧同时打开。
    4. 在传递窗中，将装有样本的试管用漂白剂处理1分钟，随后用70%乙醇喷洒，擦干，以确保样本进入实验室单元前得到充分去污。浸泡完成后，单元内的实验技术人员将打开传递窗，从漂白剂容器中取出样本并进行登记。通常情况下，传递样本人员与取出样本人员并非同一人。
    5. 打开传递窗，收集待登记的样本。用纸巾擦拭经漂白剂和乙醇消毒过的样本表面。先用漂白剂、再用70%乙醇溶液擦拭传递窗内部。在交互式平板或笔记本电脑系统中登记样本。通过以下信息识别样本：
      - 采集日期
      - 发病日期
      - 患者年龄和性别
      - 标本类型（例如., 鼻拭子
      - 唯一标识符
      - 其他相关信息
    6. 使用条形码标记试管。在每个样本管以及四个指定用于分装的空管上粘贴条形码。将样本转移至通风橱。扫描每支试管上的条形码，并确保相应的样本标识信息显示在平板或笔记本电脑系统界面上。若无条形码，可使用耐酒精标记笔。务必直接标记在管体上，切勿标记在管盖上，以免操作过程中管盖混淆！完成注册流程。
  2. 样品等分试样
    1. 试管标记后，使用经认证的2级生物安全柜处理样本并进行样本分装。其中一份分装样本可用于即时检测，其余分装样本保留用于参考或复检。
    2. 当标本以鼻拭子头部浸入病毒运输液的形式送达后，将拭子头部在运输液中搅动30秒，并挤压拭子头部使其紧贴管壁。随后将拭子从运输液中取出，并按照生物危害性废弃物处理规程进行处置（妥善丢弃、高压灭菌或浸入1:100的含氯溶液中）。
      注意：储存培养基的最小体积应为0.5 mL。因此，3 mL样品可均分为六个等份（子样品）。每个0.5 mL样品使用1 mL冻存管，以提供冷冻后培养基膨胀所需的额外空间。
    3. 取样时，每个样本均应使用新的无菌或一次性移液器，并将用过的移液器丢弃至生物危害废物容器中，以避免交叉污染。确保每支试管均紧密密封。
    4. 每个样本使用一份等分试样进行立即提取，其余等分试样应储存于冷冻箱中（因是呼吸道样本，需在 -80 °C 条件下保存），以备后续使用。
    5. 在前往工作台之前，先用漂白剂清洁所有工作区域表面和设备，随后用70%乙醇溶液擦拭。
  3. 提取与纯化
    1. 为确保检测质量，将带有条形码的PCR样本分装管从样本处理区转移至指定用于提取的生物安全二级（BSL-2）安全柜工作站。该安全柜配备有独立的一套移液器专用于样本操作。
    2. 使用病毒RNA小量提取试剂盒提取RNA样本。按照生产商提供的说明书，采用离心柱法纯化病毒RNA。根据需要提取的样本数量配制主混合液。将样本与裂解缓冲液主混合液置于室温下。
    3. 准备需要提取的样本数量。用条形码编号或唯一标识符标记1.5 mL微量离心管。
    4. 将移液器调至 560 µL。装上新的移液器吸头。向每个已标记的离心管中加入 560 µL 裂解缓冲液。丢弃吸头。装上新的移液器吸头。加入 140 µL 样品。丢弃旧吸头，装上新的移液器吸头。对另一个样品重复上述操作。装上新的移液器吸头。向阴性对照管中加入 140 µL 缓冲液。将各管盖紧。
    5. 脉冲-涡流样品分装 1 用裂解缓冲液处理15秒。用样品等分试样重复一次。 2 对照管。将每个样品在微型离心机中离心5秒。室温孵育样品10分钟。
    6. 孵育10分钟后，重新离心各管，以去除管盖内表面的液滴。向样品中加入560 µL乙醇溶液。更换移液器吸头。对其他剩余或额外样品重复此步骤。牢固盖紧每个样品管，短暂涡旋振荡每个样品15秒。将样品微离心5秒。
    7. 将混合物加入离心柱中。准备干净的2 mL收集管，放入离心柱并标记以对应样品。将630 µL样品转移至相应的离心柱中。
    8. 盖紧管盖，转移至离心机。将样品均匀分布于离心机中。在6,000 × g 离心1分钟以去除裂解缓冲液。返回工作台，更换收集管。加入剩余的裂解缓冲液，重复离心步骤。弃去原始分装样品管。
    9. 弃去流出液，用两种缓冲液洗涤离心柱。加入500 µL Buffer AW1。每个样本均重复此步骤。盖紧每个样本的管盖，在6,000 × g 1 分钟。用第二个 Buffer AW2 重复操作，然后在 20,000 × g 3 分钟。
    10. 最后用洗脱缓冲液洗脱RNA。将柱子放入一个干净的1.5 mL离心管中，打开柱盖，加入60 µL Buffer AVE。室温孵育1分钟，然后在6,000 x g 1 分钟。样品现可进行 PCR 分析。
  4. PCR扩增与检测
    1. 在指定用于PCR的独立区域进行PCR扩增。根据生产商说明书，采用一步法PCR方案对病毒靶标进行PCR扩增。注意：使用病毒特异性引物、探针、2x RT-PCR缓冲液和RT-PCR酶配制总反应体系（master mix）。将总反应体系加入板或管中，随后分别加入各待测样本并混匀（见第4.4节）。
    2. 将反应板转移至PCR仪中，并根据病毒靶标扩增条件运行程序。样品上机后，完成整个扩增过程约需90分钟。
  5. 使用设备后的维护
    1. 根据设备使用情况，定期进行常规和周期性维护 表 2.

4. 在生物安全三级实验室中通过RT-PCR快速诊断流感病毒

注意：在 BSL-3 条件下，实验方案将保持不变，但安全措施优先于一切。进入 BSL-3 实验室前，应通过透明窗口观察，确认手套箱单元内已建立负压。当看到墙上一个粉红色小球可见时，表明负压已经建立。

  1. 接收与登记
    1. 建立负压后，打开门进入实验室单元。立即洗手，然后进行个人防护装备（PPE）的穿戴。应用PPE和BSL-3工作流程检查表（见第2节）。
    2. 按以下顺序穿戴个人防护装备：内层手套、防护服、鞋套、口罩、面罩、外层手套。建议穿戴可覆盖全身的完整防护服。
    3. 开启设备，使手套箱内压力稳定。使用含氯漂白剂喷雾溶液对将在手套箱内外使用的全部区域和物品进行去污。将含氯漂白剂废弃物丢弃至专用容器中。使用70%乙醇溶液清除所有使用过漂白剂的区域。
    4. 通过传递窗转移样本。
      注意：在将样本送至传递窗前，应将装有样本的管子浸入次氯酸盐溶液中消毒1-2分钟。特别地，需用含氯漂白剂溶液喷洒样本，静置至少1分钟后再通过传递窗送入BSL-3实验室内部。传递样本的外部人员与在BSL-3实验室内部接收并提取样本的人员不应为同一人。
    5. 在BSL-3实验室单元内接收样本，并在进行登记和标记步骤前对样本进行清洁。
    6. 使用交互式平板系统或笔记本电脑登记样本。使用以下信息识别样本（见第3.1.5节）。
    7. 使用条形码标记试管。若无条形码，则使用耐酒精标记笔。
      注意：务必直接在管体上做标记，切勿标记在管盖上，因为管盖在操作过程中可能被误换！
  2. 样本分装
    1. 样本完成登记且试管标记后，通过气锁托盘将样本送入经认证的手套箱，从手套箱内部取出样本。关闭门后，再打开手套箱另一侧的门以取出样本。切勿同时打开两扇门。为安全起见，应分两步依次开关每扇门。开启紫外光（UV-C）照明。
    2. 当样本安全转移至手套箱内部后，按照先前所述步骤在手套箱内进行样本分装。一份分装样本可用于即时检测，其余样本则保留作为参考或复检用途。样本以鼻咽拭子浸入病毒运输液的形式送达。取样时，将每份样本分别放入一个离心管中。将拭子头在运输液中搅拌30秒，取出前在管壁上挤压数次，随后根据生物危害废物处理规程进行处置（妥善丢弃、高压灭菌或浸入1:100的含氯溶液中）。
      注意：应储存的最小液体体积为0.5 mL，为此应使用1 mL离心管。因此，3 mL样本可被分为六个分装样本（子样本）。
    3. 每个样本使用新的无菌或一次性移液器，并将其作为生物危害废物丢弃。完成分装后，将样本转移至密闭容器中。盖紧管盖并做好防护后，从手套箱中取出。
    4. 在手套箱内，密封生物危害废物袋，并准备新的废物袋以防止交叉污染。使用含氯漂白剂对手套箱工作区作用5分钟，随后用70%乙醇溶液清洁所有曾接触漂白剂的区域。
    5. 每个样本留取一份分装样本用于即时分析，其余样本作为呼吸道样本储存于-80 °C冰箱中。完成去污后，保留一份分装样本用于检测，将所有样本从手套箱中取出并转移至-80 °C冰箱储存。
  3. 提取与纯化
    1. 完成去污后，将需要用于PCR分析的条形码分装样本从样本处理区重新送入手套箱。
    2. 在手套箱内完成提取程序的所有裂解步骤。根据制造商说明书，使用病毒RNA小量提取试剂盒（viral RNA mini kit）提取RNA样本。按照制造商说明书中的离心柱法步骤，逐步完成病毒RNA的纯化。
    3. 准备需要提取的样本数量。使用条形码编号或唯一标识符标记1.5 mL微量离心管。
    4. 向140 µL样本中加入560 µL裂解缓冲液，短暂涡旋震荡。室温孵育10分钟。
      注意：灭活程序可能因所提取的BSL-3病原体类型而异，在某些情况下可能需要进一步灭活。
    5. 裂解完成后，将每个样本管盖紧密封好，并放入加压气锁通道中（若离心机位于手套箱外部）。将裂解后的样本转移至生物安全柜中，继续完成后续步骤。
      注意：RNA提取与纯化过程可在手套箱内完成，或在手套箱内开始后转移至生物安全柜完成，具体取决于BSL-3病原体类型及所需操作规程。
    6. 务必再次使用含氯漂白剂对手套箱内的工作区和物品进行去污，并使用70%乙醇溶液清洁所有曾接触漂白剂的区域。
    7. 按照第3.3.6至3.3.10节的步骤进行RNA的洗涤与纯化。
    8. 提取完成后，将样本通过传递窗转移至PCR分析区。
    9. 样本移出并转移后，根据第2节要求，对手套箱外部的实验室工作区进行去污。
    10. 在脱卸个人防护装备前，需等待实验室单元内的空气循环完成规定次数的过滤循环，确保安全后再开始脱卸PPE。脱卸并丢弃所有PPE至专用废物容器后，立即按照第2节要求，在实验室中用肥皂和水彻底洗手，然后离开实验室单元。
  4. PCR扩增与检测
    注意：PCR扩增在专设的PCR区域进行，该区域通过传递窗与手套箱区域相连。测试前必须对工作区和物品进行去污。
    1. 从传递窗中取出已提取的RNA样本。
    2. 使用一步法PCR程序对病毒靶标进行PCR扩增。使用病毒特异性引物、探针、2x RT-PCR缓冲液和RT-PCR酶配制主混合液。为每个靶向检测使用一个1.5 mL离心管，加入以下组分：水、引物与探针、2x缓冲液和RT-PCR酶。涡旋混匀后短暂离心。
    3. 将主混合液分装至各排管中。主混合液配制完成后，将PCR试剂盒放回推荐温度下储存。
    4. 使用不同吸头将各个样本分别加入各排管中。将样本板或离心管在1,500 rpm下离心1分钟。样本现已准备好加载至实时荧光定量PCR仪。
    5. 将加样后的板转移至PCR仪器，按照病毒靶标扩增条件运行程序。单次运行约需90分钟。
    6. 在获取结果并离开实验室前，脱卸PPE，并根据第2节要求对每个工作站进行充分去污，为下一次诊断测试做好准备。
  5. 设备使用后的维护
    1. 根据表2的要求，在设备使用后进行定期和周期性维护。
      注意：整体诊断周转时间约为4小时。提取时间和PCR准备时间可能因样本数量而异，诊断测试相应可能需要4-5小时或更长时间。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究的目的是证明所提出的BSL-2和BSL-3移动实验室设施能够提供适当的环境，使呼吸道病毒诊断检测获得与高质量固定实验室检测结果一致的代表性结果。该实验室设施的设计符合职业健康与安全（OHS）建议中规定的检测要求。一旦远程实验室设施部署完成（图4），且所有设备和物资安装就位（图5），即可开始进行实验室检测。

根据实验室标准操作规程，进行BSL-2操作时需穿戴适当的个人防护装备（如实验服、防护鞋、手套、高级别口罩、护目镜等）。对于BSL-3操作，负压PCR实验室模块配备经过认证的手套箱。实验室单元通过外部传递窗进行升级，以在样本接收步骤保护工作人员。注册过程可借助先前开发的基于平板电脑的应用程序简化操作（图3D）。其他可在笔记本电脑上运行的合格应用程序也可使用。

该特定呼吸道病毒诊断检测可在相互连接的实验室模块中进行，将诊断流程的各个步骤分离开，以避免污染或生化试剂之间可能产生的干扰，从而影响检测结果。为最大限度地保证诊断质量，快速诊断检测实践采用以下两种配置之一：(i) 基础BSL-2实验室与相连的PCR通行实验室（第3节），或 (ii) 通过传递窗连接的GB实验室与PCR实验室（第4节）。建议的实验室工作流程示意图见图6，并特别强调个人防护。该示意图明确了每个标注步骤在人员防护方面的重要性，尤其适用于偏远地区培训较少的实验室工作人员。

流感的快速诊断检测通过RT-PCR技术完成。该操作流程包含四个主要步骤。请注意，每个操作阶段均分配有独立的工作区域。

第一步是获取样本，并将其分成若干等份。然后可使用条形码标记这些等份，以提高数据管理的效率，并将样本存放在冰箱中以备后续研究。第二步是在裂解缓冲液中通过离心和加热使样本失活。第一和第二步必须在生物安全柜中进行。应使用独立的移液器套装和设备。如有条件，建议在PCR专用房间内进行PCR检测。第三步是记录实验结果。第四步是在实验结束后对设备进行维护，并提醒人员做好个人防护。

如果样本预计被归类为生物安全等级3级以上（例如埃博拉病毒、寨卡病毒、中东呼吸综合征病毒、结核分枝杆菌），则必须使用手套箱设施。在远程实验室中，手套箱房间设有独立的传递窗用于接收样本，并配备笔记本电脑或平板设备用于样本登记。样本分装及病毒灭活操作均需在手套箱内完成。建议使用紫外光C（UV-C）照射以防止操作过程中的污染。样本灭活后，后续操作步骤与基础实验室的生物安全等级2级（BSL-2）和生物安全等级3级（BSL-3）检测相同，并遵循检查清单第三部分 （表1，图6）。

用于临床研究设置的移动医疗实验室集装箱示意图。
图1. 实验室设施原型。（A, B）运输模式；（C）展开模式：外部；（D）展开模式：内部。请点击此处查看此图的放大版本。

实验室模块示意图；显示PCR室、手套箱房间；用于受控实验的装置。
图2. 示意图。（A）基础实验室BSL-2；（B）BSL-3模块包括手套箱和PCR实验室，两者之间设有共用的传递窗，用于安全转移样本；（C）实验室设施（A）和（B）相互连接，并共享公用设施；（D、E）从相对两侧拍摄的相连单元实景照片。请点击此处查看此图的高清版本。

实验室安全设置及用于追踪PCR和实验室服务的平板电脑应用程序；工作流程图。
图3. （A）BSL-3设施内部设有（1）一个传递窗、一个水槽，以及（2）入口处的洗眼站；（B）电源接口；（C）供水接口；（D）基于平板电脑的软件，用于物资追踪和实验室结果记录。 请点击此处查看此图的放大版本。

显示四个步骤中顺序组装过程的折叠面板结构示意图。
图 4。 实验室设施的展开部署。 图示为单元一侧面板展开的步骤说明（A-D）。请点击此处查看此图的放大版本。

带有模块、暖通空调系统、生物安全柜、手套箱和离心机的实验室平面图示意图。
图 5. 可连接实验室的示意图：（A）BSL-2 模块 1；（B）手套箱与 PCR 模块 2。请点击此处查看此图的放大版本。

PCR诊断工作流程图；过程包括样本制备、核酸提取和检测。
图6。偏远地区实验室呼吸道病毒诊断性RT-PCR检测的流程图。 请点击此处查看此图的放大版本。

远程实验室 BSL-2远程实验室 BSL-3
第一部分第一部分
        i. 实验技术人员通过标有“入口”的门进入，穿上挂在入口门旁架子上的实验服。禁止穿露趾鞋，建议佩戴高级口罩和护目用具。       i. 实验技术人员应从手套箱外部观察其窗口，确认负压已启动（箱体内应可见粉红色小球，以表明负压系统正常工作）。
      ii. 实验技术人员在水槽中洗手，戴上一次性手套，开始接收样本。      ii. 若负压系统正常工作，实验技术人员应通过唯一入口门进入，穿上挂在入口门旁架子上的实验服。禁止穿露趾鞋，建议佩戴高级口罩和护目用具。
     iii. 样本在递送至传递窗前已浸入次氯酸盐浴液，现存放于传递窗内，供实验技术人员取用。     iii. 实验技术人员在水槽中洗手，戴上一次性手套、个人防护装备（PPE），并开始接收样本。
     iv. 样本已在样本接收处接收。     iv. 样本在递送至传递窗前已浸入次氯酸盐浴液，现存放于传递窗内，供实验技术人员取用。
第二部分      v. 样本已在样本接收处接收。
      v. 根据诊断流程，将样本转移至生物安全柜中进行灭活处理。第二部分
     vi. 对样本进行显微镜检查、离心或快速检测（ROTs）前的预处理。     vi. 在手套箱内对样本进行灭活处理。
    vii. 执行相应的诊断检测。   vii. 对样本进行核酸提取操作。
   viii. 将样本储存于 4°C 冰箱或适当的冷冻设备中。  viii. 提取完成后，将样本转移至传递窗。
第三部分     ix. 实验技术人员通过单元 PCR 侧的入口门进入（正压环境）。
     ix. 使用水槽进行染色及物品清洗。      x. 实验技术人员从入口旁的架子上取用实验服，洗手后戴上手套。
      x. 使用笔记本电脑和工作台面进行分析与记录。     xi. 从手套箱房间经传递窗接收样本。
     xi. 通过运行高压灭菌器对设备进行灭菌。   xii. 如有必要，在层流柜中对样本进行预处理。
    xii. 将所有生物危害性废弃物丢弃至生物危害废物容器中。  xiii. 执行相应的诊断检测。
   xiii. 在水槽中洗手。  xiv. 将样本储存于 4°C 冰箱或适当的冷冻设备中。
  xiv. 将实验服重新挂回架子上。第三部分
    xv. 从同一扇门离开。   xv. 使用水槽进行染色及物品清洗。
  xvi. 使用笔记本电脑和工作台面进行分析与记录。
 xvii. 将试管转移至传递窗，送入 PCR 室，并通过运行高压灭菌器对设备进行灭菌。
xviii. 将所有生物危害性废弃物丢弃至生物危害废物容器中。
  xix. 在水槽中洗手。
   xx. 从同一入口门离开。

表1. PCR诊断工作流程检查清单。

维护与校准
实时荧光定量 PCR 系统每月每月执行一次背景校准
18 个月每 18th 个月执行一次背景、空间和染料校准
离心机1 年通过外部或内部校准服务对每分钟转数和温度进行校准
手套箱每日目视检查各部件，特别是 HEPA 过滤器暴露表面、手套、O 型圈和软管是否损坏。确保风管夹具紧固并处于正确位置。进行泄漏压力测试。测试压力报警装置。
6 个月更换 HEPA 过滤器
1 年对系统进行校准
高压灭菌器每周使用温和的非研磨性清洁剂清洗水箱和支架
3 个月校准计时器和仪表
1 年或每 50 个循环检查、彻底清洁、测试并校准
冰箱和冷冻柜6 个月检查风扇电机、蒸发器盘管，清洁冷凝盘管和冷凝器过滤器，并根据需要更换电池
1 年通过内部或外部校准服务对冷冻柜进行校准

表2. 实时荧光定量PCR仪的维护。

必需推荐
实验服、防护鞋、手套实验服、防护鞋、手套、口罩、护目镜
4 °C 冰箱、-20 °C 冰柜4 °C 冰箱、-20 °C 冰柜、-80 °C 冰柜
一套自动移液器三套自动移液器
离心机、摇床、PCR仪自动化机器人系统
RT-PCR仪、冰浴装置带温度控制的RT-PCR仪、无冰冷却器
生物危害废物袋高压灭菌器用于处理生物危害废物

表3. 呼吸道病毒RT-PCR诊断检测最低要求（生物安全二级实验室，BSL-2）。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

上述远程实验室设施以物流为导向，具有可扩展性、快速部署能力、多功能性，并基于以人为本的设计理念，旨在保护实验室工作人员并提高工作空间效率。本文开发并展示了快速建立实验室以及安全进行呼吸道病毒分离与诊断的详细方案。

为确保设备最佳运行，实验室需维持以下条件：环境温度 21 ± 2 °C，允许温度范围 5 至 40 °C，湿度 14 ± 5% RH，允许最高相对湿度为 80% RH（无冷凝），海拔高度介于 0 至 2,000 米之间。

能耗是离网实验室管理中最关键的参数之一。对于核心实验设备，其能效差异可达15%-40%；但此处采用平均能耗估算，以提供适当的服务水平。最高功率（1,500–2,000 W）设备包括空调系统、手套箱系统、PCR仪和高压灭菌器。考虑到每天8小时的高强度实验操作以及16小时的实验室环境控制，BSL-2实验室的日均能耗约为36 kWh/天，BSL-3实验室约为43 kWh/天，而联用型BSL-2/BSL-3+设施则为73 kWh/天。对于单个实验室单元，建议配备运行/持续功率≥8 kW、浪涌/启动功率≥10 kW的电源；对于联用设施，则需运行/持续功率≥12 kW，浪涌/启动功率≥14 kW。需要注意的是，在BSL-3实验室中，强烈建议配置备用电源，以避免意外断电，并确保在诊断检测过程中手套箱和负压系统能够持续稳定运行。

汽油动力发电机是应急能源供应的一种经济高效的解决方案。假设一台汽油发电机在满负荷（100%负载）运行时的燃油效率约为每小时1.5加仑。那么，如果平均每日能耗为8小时40%负载和16小时10%负载，则相应的生物安全二级（BSL-2）或三级（BSL-3）实验室设备每天需要7至9加仑燃料，而所连接的设施则需要约15加仑/天。

远程实验室设备的设计符合离网太阳能系统的性能要求。太阳能电池板无需额外燃料，且由于热带和亚热带地区（如非洲、亚洲和拉丁美洲）太阳辐射较强，可实现高效运行。目前，一套 commercially available 太阳能电池板系统每日可提供高达 44 kWh/day 的电力使用量。

无论选择何种替代性电能来源，都强烈建议在实验室设施中安装滤除电污染的设备，以提高电源质量并保护实验仪器。应将PCR系统远离强电磁辐射源，尤其是未屏蔽的电磁辐射源，因为强电磁辐射可能干扰设备的正常运行。此外，切勿将PCR系统置于强振动源附近，例如离心机或泵，因为过度振动会影响仪器性能。实验室设备只能安装在无导电性污染物的环境中，例如无尘埃颗粒或木屑的环境。确保房间远离可能将颗粒物排放到仪器部件上的任何通风口。

实验室用水量取决于每日开展的诊断检测数量以及实验室工作人员的数量。在诊断过程中，包括提取和PCR检测在内的试剂混合液制备需要使用无核酸酶水，且必须与其他耗材和化学品一并提前备妥。每开展一次诊断检测至少需要50 mL无核酸酶水；所需无核酸酶水的具体体积取决于工作负荷（即样本数量）。蒸馏水用于运行高压灭菌器。一次高压灭菌循环的耗水量为160–180 mL，建议每日使用高压灭菌器。大多数塑料制品（如离心管、移液器吸头等）为一次性使用，但部分器具可重复使用，需进行清洗（如大容量容器、支架等）。常规自来水用于操作间歇的手部清洗，每日最低用水量估计为15–20 L。供水需具备足够压力；建议安装沉淀物前置过滤系统，以保护用水设备免受沉淀物损害，并提高自来水的水质。

用于冷藏时，每个实验室单元至少需要一台5.1立方英尺的冰箱（+4 °C）和一台4.9立方英尺的冷冻机（-20 °C至-30 °C），以储存样品/RNA。

实验室去污染包括多个等级：清洁 > 抗菌 > 消毒 > 灭菌。简单清洁可使用肥皂和水，配合戴手套的手或刷子进行擦洗。抗菌是指用液体抗菌化学剂清洗，以抑制微生物的生长和繁殖。70%的酒精溶液可用作抗菌液体。消毒是指使用液体化学剂处理，以消除物体表面和设备上几乎所有的致病微生物（细菌芽孢除外）。化学剂的作用时间、温度和浓度均至关重要。次氯酸钠溶液（0.5%），即漂白剂，可用于大规模的表面净化和水净化，是一种有效的消毒剂。紫外线杀菌照射是另一种消毒方法。杀菌灯可产生UV-C光，使细菌和病毒失活。灭菌是采用物理或化学方法杀灭所有微生物生命形式，包括抵抗力极强的细菌芽孢。灭菌可通过高压蒸汽灭菌器（autoclave sterilizer）实现。

所有实验室废弃物必须在产生时进行分类。将固体、非锐器类的感染性废弃物放入标有生物危害标志的防漏废弃物袋中。若产生的废弃物为锐器，则必须放入防刺穿容器中。将可能具有感染性的液体废弃物收集在正确标记的液体生物危害容器中。容器和废弃物袋的填充量不得超过其容积的2/3。所有含漂白剂的废弃物必须单独分类并投入指定的废弃物容器中。处理实验室废弃物时应轻拿轻放，避免产生气溶胶以及废弃物袋/容器的破损。装有生物危害废弃物的收集袋或容器在使用后必须密封，并用0.5%次氯酸钠溶液对容器外表面进行去污处理。所有实验室废弃物在焚烧前必须在高压灭菌器中于121 °C条件下灭菌30分钟。请参考高压灭菌器的操作手册以确保正确使用。如有可能，应在高压灭菌过程中加入化学或生物指示剂，以验证灭菌效果。所有经高压灭菌处理的固体和液体废弃物必须清晰标注“已灭菌”，并标明灭菌参数、日期、时间和操作人员。标记后的废弃物应存放于安全、独立的区域，等待后续焚烧处理。

正如预期，诊断检测的流程取决于疾病类型和样本种类。如果建议采集血液样本用于病毒鉴定（例如埃博拉病毒19），样本分装可保存在 -20 °C，而非必须保存在 -80 °C（后者适用于呼吸道病毒）。在患者采样时，最好采集多份样本，而不是之后再对样本进行分装。如果可能，每种类型的样本都应在不同的样本管中至少采集两份。若无法进行额外采样，则必须对样本进行分装。

如果无法将替代样本保存在适当的温度下（例如，无可用冰箱），应将拭子保存在纯（100%）乙醇或99%变性酒精（仅含甲醇添加剂）中。在此情况下，拭子头部必须放入含有1–2 mL乙醇的小瓶中。请注意，此类样本仅适用于PCR检测。此外，每种特定病毒的诊断都必须采用经过充分验证的检测方法8,23，而未知病毒样本必须送至指定实验室进行进一步分析19,20,21。

必须明确呼吸道病毒诊断PCR检测所需实验室设备的强制性和推荐性要求。表3强调了RT-PCR诊断检测所需的基本设备以及最低限度的高级设备（推荐）和相关要求。对于BSL-3实验室操作，为工作人员提供额外的负压防护（例如手套箱）至关重要且必不可少。

采用相互连接的实验室模块更有利于增加参与实验室检测的人员数量，并缩短单次检测所需的时间。可以通过自动化qPCR仪（例如QiaCube）替代耗时的手工RNA提取步骤。尽管该仪器体积较大（宽65 cm，长62 cm，高86 cm），但在BSL-2或BSL-3实验室单元内重新调整家具布局后，仍可适应移动实验室的工作空间。

未来的工作将集中于开发增强现实（AR）和虚拟现实（VR）培训。AR/VR眼镜将被用于提供一个互动平台，以教授成为训练有素的实验室工作人员所需的关键技能。软件指南中将包含执行实验室诊断测试中一些复杂、多步骤操作的实用技巧。这种人员培训方法应能提高偏远地区实验室设施中诊断测试的执行质量和管理水平，尤其是在偏远且资源有限的地区。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

贝勒医学院持有移动诊所的美国临时专利申请（美国专利申请号 15/523,126，#620078924）。作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文内容不一定反映美国卫生与公共服务部或作者所属机构的观点或政策。本研究得到了保罗·艾伦家族基金会"增强型零影响应急智能舱"项目的支持。我们深切感谢来自贝勒医学院、GSS健康公司以及美国国家航空航天局约翰逊航天中心的同事们所进行的富有成果的讨论与合作。我们诚挚感谢赛默飞世尔科技公司及其代表出借实时荧光定量PCR仪、离心机和自动移液器，以在远程实验室设施中开展呼吸道病毒诊断检测。作者感谢Marta Storl-Desmond和Sidney Stephen Sorrell在稿件撰写和视频拍摄方面提供的帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高压灭菌器“BioClave”Benchmark Scientific，美国新泽西州爱迪生B4000-1616升，台式，尺寸：22英寸×17.5英寸×15.7英寸，全自动，超紧凑
条形码扫描仪Zebra Technologies ZIH Corp.，林肯郡，伊利诺伊州，美国Symbol LS2208手持式，轻量
断路器箱面板 enclosureSquare D（施耐德电气），法国 MH62WP NEMA 3R/5/12，尺寸：20 英寸宽 × 62 英寸高 × 6-1/2 英寸深，配电箱
离心机 - 微型离心机 17,000 × g赛默飞世尔科技公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德75002440可容纳 24 个 1.5 或 2 ml 离心管，尺寸：8.9 × 9.6 × 13.8 英寸
II级生物安全柜NuAire, Inc.，明尼苏达州普利茅斯，美国NU-602-4004 英尺 II 级 A2 型笼盒更换生物安全柜，12" 通路开口，HEPEX 压力导管 
III级生物安全柜（手套箱）美国佛罗里达州奥蒙德比奇无菌实验室型号 #PGB-36，序列号 #C-2937手套箱，便携式，36"，III级生物安全柜。尺寸：36英寸×20英寸×23.75英寸，包含2个内置电源插座
低温冷却器VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺414004-2860.5 或 1.5 ml 离心管台式冷却器
冷冻机（30°C 冷冻室Thermo Fisher Scientific，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德Model ULT430A占用 4.9 立方英尺空间
层流柜NuAire, Inc.，明尼苏达州普利茅斯，美国NU-126-3003 英尺垂直层流空气柜，8" 接入开口，高效微粒空气（HEPA）过滤器供气，99.99%
迷你离心机赛默飞世尔科技公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德75004061尺寸：4.1英寸×5.0英寸×6.0英寸
自动移液器VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺05-403-151移液器4件套（2.5、10、100和1,000）μL 体积）
自动移液器“Finnpipette”赛默飞世尔科技公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德4700880移液器4件套（2、20、200和1,000）μL 体积，高级容积传动（AVG），超耐用
发电机美国明尼苏达州明尼阿波利斯市康明斯电力公司C60 D660 千瓦，60 赫兹，单相，120/240伏，柴油
冰箱BioMedical Solutions, Inc.，美国德克萨斯州斯塔福德BSI-HC-UCFS-0504W标准台下冰箱 &冰箱和冰柜
冰箱赛默飞世尔科技公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德05LRAETSA 占据  5.1 立方英尺
RT-PCR仪“Step-one plus”赛默飞世尔科技公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德4376598可容纳96个样本，尺寸：9.7×16.8×20.2英寸 
涡旋混合Thermo Fisher Scientific，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德88880017TS尺寸：6.1×8.3×3.3 英寸
<强>化学品
AgPath-ID 一步法 RT-PCR 试剂应用生物系统公司，美国加利福尼亚州福斯特城4387391
乙醇 Koptec Pure 200 证明Decon Labs, Inc.，宾夕法尼亚州普鲁士王市，美国V1001
无核酸酶水Ambion, Inc.，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德AM9906
QIAamp病毒RNA小型试剂盒Qiagen，德国希尔登52906
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR 试剂盒美国加利福尼亚州卡尔斯巴德，Invitrogen11732-088
<强>一次性
1 mL 冻存管赛默飞世尔科技公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德03-337-7X 
1.5 mL 离心管VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺10025-726
10 µL型滤芯吸头Neptune，VWR，Radnor，PA，美国Neptune，BT10XLS3
20 µL型滤芯吸头Multimax, BioExpress, VWR, Radnor, PA, 美国MultiMax，P-3243-30X
200 µL型滤芯吸头ART，Thermo Fisher Scientific，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德ART, 2770
1000 µL型滤芯吸头Phenix Research Products，坎德勒，北卡罗来纳州，美国TS-059BR
AB定制探针赛默飞世尔科技公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德N/A定制探针
CombitipsEppendorf，美国纽约州霍普奇89232-972
Integrated DNA Technology (IDT) 定制探针和引物IDTN/A定制探针
MicroAmp 快速光学 96 孔反应板Thermo Fisher Scientific，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德490003-978 CS
MicroAmp 快速反应管（8 管/条）Thermo Fisher Scientific，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德4358293
MicroAmp 光学 8 孔管条赛默飞世尔科技公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德4323032
MicroAmp 光学粘性膜Thermo Fisher Scientific，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德4311971
<强>材料与试剂
生物危害废物袋VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺14220-04620.3 x 30.5 cm 生物危害袋
手套美国马萨诸塞州霍利斯顿，丹维尔科学公司G4162-250小号、中号或大号丁腈或乳胶手套
实验服N/AN/A可定制
口罩VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺414004-663高级防护口罩
防护鞋N/AN/A可定制

参考文献

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RT PCR BSL 2 BSL 3 PCR

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