增强型酵母单杂交筛选技术用于鉴定结合人类DNA序列的转录因子

摘要

在此，我们介绍一种改进的酵母单杂交筛选方案，用于鉴定可结合人源特定DNA区域的转录因子（TFs）。该方法采用高通量筛选流程，可系统检测转录因子与目标DNA序列的结合能力。 >单次实验中检测 1,000 个转录因子。

摘要

确定调控每个人类基因的转录因子（TFs）组合是一项艰巨的任务，需要整合多种实验和计算方法。其中一种方法是酵母单杂交（Y1H）检测，该方法利用报告基因在酵母细胞核环境中检测转录因子与DNA区域之间的相互作用。Y1H检测包含两个组分：一种“DNA诱饵”（例如.，启动子、增强子、沉默子等）和一种“转录因子猎物”（TF-prey），可用于筛选报告基因的激活。目前大多数已发表的Y1H筛选实验方案均基于将转录因子猎物文库或阵列转化至DNA诱饵酵母菌株中。本文描述了一种称为增强型Y1H（eY1H）检测的流程，该方法通过使用高密度阵列（HDA）机器人平台，将DNA诱饵菌株与阵列化的转录因子猎物菌株进行交配，从而检测转录因子与DNA之间的相互作用，实现1,536菌落格式的高通量筛选。该方法显著提高了通量（可同时检测60个DNA诱饵序列与 >每位研究人员筛选1,000个转录因子需耗时两周）以及可重复性。我们通过将人类启动子序列与包含1,086个人类转录因子的阵列进行测试，展示预期结果的不同类型，同时列举筛选过程中可能出现的问题及相应的解决方案。

引言

生物医学领域的一个核心问题是确定调控每个人类基因的机制。转录是控制基因表达水平的第一步，由每种基因特异的一组转录因子（TFs）进行调控。鉴于人类基因组编码了>1,500 种转录因子^1,2，要鉴定出调控每个基因表达的完整转录因子集合，仍然是一个尚未解决的挑战。 

研究转录因子与DNA相互作用的方法可分为两类：以转录因子为中心的方法和以DNA为中心的方法³（图1A）。在以转录因子为中心的方法中，针对特定的转录因子检测其与基因组DNA区域的结合能力，或确定其DNA结合特异性。这类方法包括染色质免疫沉淀联合高通量测序（ChIP-seq）、蛋白质结合微阵列以及SELEX技术^4,5,6。在以DNA为中心的方法中，通过检测特定DNA序列来确定能够与其结合的一组转录因子。其中应用最广泛的是酵母单杂交（Y1H）实验，该方法利用报告基因在酵母细胞核环境中检测转录因子与DNA区域之间的相互作用^7,

方案

1. 准备工作

1. Sc −U −H 平板（150 mm 培养皿） 
   注意：这些平板将用于培养 DNA-bait 酵母菌株。 
   1. 将缺失营养成分混合物、酵母氮源基础（YNB）、半硫酸腺苷和硫酸铵溶解于 920 mL 水中，用 5 M NaOH 调节 pH 至 5.9（每升培养基约需 1 mL；培养基成分见表 2）。倒入 2 L 锥形瓶中，并加入搅拌子。
   2. 在另一个 2 L 锥形瓶中，将琼脂加入 950 mL 水中（不要加入搅拌子，以免在高压灭菌时琼脂沸腾溢出）。 
   3. 在液体程序下，15 psi 条件下高压灭菌 40 分钟。 
   4. 立即将第一个锥形瓶中的内容物（包括搅拌子）倒入含琼脂的锥形瓶中。加入葡萄糖，在磁力搅拌器上充分混匀，然后在水浴中冷却至 55 °C。 
   5. 向培养基中加入亮氨酸和色氨酸。在磁力搅拌器上充分混匀后，倒入 150 mm 无菌培养皿中（每皿约 80 mL）。在室温下干燥 3–5 天，用塑料袋包裹，并在室温下保存最多 6 个月。 
2. YAPD 矩形平板
   注意：这些平板将用于培养 DNA-bait 菌....

结果

分析 eY1H 实验结果时应考虑三个主要因素：DNA 钓饵菌株的报告基因本底活性、对应转录因子- DNA 相互作用的报告基因活性强度，以及阳性克隆的数量。DNA 钓饵菌株的报告基因本底活性（即自激活活性）是指读出平板中酵母菌落的整体生长情况和颜色，即使在不存在转录因子猎物（TF-prey）的情况下也会出现。理想情况下，非自激活菌株表现为本底呈白色或浅棕色，而阳性相互作用的菌落则更大且呈蓝色。自激活的 DNA 钓饵菌株则在缺乏组氨酸的培养基中表现出酵母生长，并在 X-gal 存在下所有菌落均呈现蓝色，这可能与酵母转录激活因子结合到 DNA 钓饵上有关⁸。所检测到的 TF-DNA 相互作用对应的报告基因活性强度（即菌落大小和蓝色深浅）取决于多个参数，包括结合亲和力、转录因子在酵母中的表达水平、结合位点数量及其与报告基因上游酵母最小启动子之间的距离，以及 DNA 钓饵菌株的报告基因本底活性。例如，弱相互作用在本底较低的钓饵中可能容易被检测到，但在自激活或本底不均一的钓饵中可能难以识别。还需注意的是，酵母中的报告基因活性水平并不一定与人类细胞中的调控活性相关，因为酵母与人类在染色质结构、核小体定位.......

讨论

与基于转化的传统文库筛选或阵列筛选方法相比，本文所述的机器人化eY1H交配筛选方法显著提高了识别结合特定DNA区域的转录因子（TF）集合的通量。此外，eY1H检测到的转录因子-DNA相互作用具有高度可重复性：90%的相互作用在每个转录因子测试的四个菌落中均为阳性，且90%的相互作用在相同酵母DNA诱饵菌株的独立筛选中可被重复验证^10,12,19。更重要的是，eY1H检测到的转录因子-DNA相互作用在人类报告基因检测^12,20、原代人类细胞（未发表结果）以及C. elegans基因敲除动物¹¹中验证的成功率为40%–70%。该验证率与ChIP-seq数据的验证率相似²¹。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-氨基-1,2,4-三唑（3AT）~95% TLC	Sigma	A8056-100G	HIS3基因产物的竞争性抑制剂
硫酸腺嘌呤（半硫酸盐），二水合物	US Biologicals	A0865	酵母正常生长所必需
高凝胶强度琼脂 - 细菌级	American International Chemical	AGHGUP	酵母生长的营养培养基
硫酸铵	US Biologicals	A1450	合成酵母培养基中的氮源
D+葡萄糖无水物	US Biologicals	G3050	酵母生长所必需
缺组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的酵母氮源缺陷型培养基混合物，富含腺嘌呤，不含酵母氮源基础成分	US Biologicals	D9540-02	酵母生长所需的合成完全培养基
edge 多参数pH计	Hanna Instruments	HI2020-01	用于测定选择性培养基的pH值
平头牙签，750支装	Diamond		用于在培养皿上划线接种酵母
玻璃珠	Walter Stern	100C	制作酵母菌苔时用于分散酵母
甘油 ≥99%	Millipore Sigma	G9012-1L	制备冷冻酵母保存菌种所需
L-组氨酸	US Biologicals	H5100	用于选择性培养基中酵母生长的筛选
L-亮氨酸	US Biologicals	L2020-05	用于选择性培养基中酵母生长的筛选
L-色氨酸	Sigma	T-0254	用于选择性培养基中酵母生长的筛选
N,N-二甲基甲酰胺	Sigma	319937-1L	用于配制X-gal溶液
Omnipense Elite	Wheaton	W375030-A	用于向Singer平板中精确分配培养基体积
蛋白胨，细菌级	American International Chemical	PEBAUP	酵母生长所需的蛋白质来源
培养皿，150 mm × 15 mm	VWR	10753-950	用于培养用于筛选的酵母诱饵
PlusPlates	Singer Instruments	PLU-003	用于制作矩形琼脂平板，配合Singer机器人使用
精密低温BOD冷藏培养箱	ThermoFisher Scientific	PR205745R	用于在恒定温度下培养酵母平板
RePads 1,536短型	Singer Instruments	REP-005	用于转移转录因子-猎物阵列、酵母杂交，以及将酵母转移到二倍体筛选和检测平板
RePads 384短型	Singer Instruments	REP-004	用于将转录因子-猎物阵列从384菌落格式转移至1,536菌落格式
RePads 96长型	Singer Instruments	REP-001	用于将转录因子-猎物阵列从甘油保存菌种转移至琼脂平板
RePads 96短型	Singer Instruments	REP-002	用于将转录因子-猎物阵列从96菌落格式转移至384菌落格式
Singer HDA RoToR机器人	Singer Instruments		用于高通量转移酵母
氢氧化钠（颗粒，ACS认证）	Fisher	S318-1	用于调节选择性培养基的pH值
磷酸氢二钠七水合物	Santa Cruz Biotechnology	sc-203402C	X-gal检测中β-半乳糖苷酶报告基因活性所必需
磷酸二氢钠一水合物	Santa Cruz Biotechnology	sc-202342B	X-gal检测中β-半乳糖苷酶报告基因活性所必需
尿嘧啶	Sigma	U0750-100G	用于选择性培养基中酵母生长的筛选
X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷）	Gold Biotechnology	X4281C100	β-半乳糖苷酶将无色X-gal转化为蓝色，以检测蛋白质-DNA相互作用
酵母提取物	US Biologicals	Y2010	酵母生长与扩增的营养培养基
酵母氮源基础（粉末），不含氨基酸、碳水化合物和硫酸铵	US Biologicals	Y2030	酵母旺盛生长所必需