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方法文章

墨西哥洞穴鱼睡眠与运动活动的自动化测量

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DOI：

10.3791/59198

⸱

2019年3月21日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University, 2Jupiter Life Science Initiative, Florida Atlantic University, 3Harriet L. Wilkes Honors College, Florida Atlantic University

本文内容

摘要

本实验方案详细介绍了量化墨西哥洞穴鱼运动行为和睡眠的方法。该方法在以往分析的基础上进行了扩展，可用于测量群居条件下饲养的鱼类的这些行为。该系统可广泛应用于其他鱼类物种的睡眠和活动研究。

摘要

在不同门类中，睡眠的特征表现为高度保守的行为特征，包括升高的觉醒阈值、睡眠剥夺后的反弹以及集中的行为静止期。墨西哥洞穴鱼Astyanax mexicanus (A. mexicanus) 是研究环境扰动下性状演化的一个模式生物。A. mexicanus 存在具眼的地表栖居型和多种无眼的洞穴栖居种群，二者在形态和行为上均表现出显著差异。在多个独立进化的洞穴鱼种群中均出现了睡眠减少的现象。本实验方案描述了一种用于量化A. mexicanus 洞穴型和地表型鱼类睡眠及运动活动的方法。通过一套低成本的视频监测系统，可对单独饲养的幼鱼或成鱼进行长达一周或更长时间的行为成像记录。该系统适用于受精后4天至成年阶段的鱼类。此外，该方法还可通过在单个实验区域内记录多条鱼的行为，调整用于研究社会互动对睡眠的影响。在完成行为记录后，使用自动化追踪软件分析数据，并通过定制化脚本进行睡眠分析，以量化多种睡眠参数，包括睡眠持续时间、睡眠片段长度和睡眠片段次数。该系统可广泛应用于几乎所有鱼类物种（包括斑马鱼和刺鱼）的睡眠、昼夜节律行为和运动活动的测量。

引言

睡眠在动物界的生理、功能和行为层面上都具有高度的保守性1,2,3。虽然哺乳类实验动物的睡眠通常通过脑电图进行评估，但电生理记录在体型较小且遗传操作便利的模式系统中实用性较低，因此这类系统中的睡眠通常基于行为特征来测定3,4。与睡眠相关的行为特征在动物界中高度保守，包括觉醒阈值升高、可被刺激逆转以及长时间的行为静息状态5。这些指标可用于描述从线虫C. elegans到人类等多种动物的睡眠状态6。

利用行为静息来界定睡眠需要使用自动追踪软件。通过追踪软件，可在多天内确定动物的活动期与静止期，并将长时间的不活动阶段归类为睡眠7,8。近年来，已开发出多种追踪系统，用于获取多种小型且遗传操作便利的模式生物的活动数据，包括线虫、果蝇和鱼类9,10,11。这些系统均配有可实现动物行为自动追踪的软件，包括开源免费软件和商业软件7,12,13,14。这些系统在灵活性方面各有不同，但均可高效地对多种遗传操作便利的模型生物中的睡眠表型进行筛选与表征。

对斑马鱼（Danio rerio）睡眠的遗传学研究已鉴定出大量调控睡眠的基因和神经回路15,16。尽管这为在脊椎动物实验动物中研究睡眠的神经基础提供了有力的系统，但关于睡眠如何进化以及自然变异如何影响睡眠调控，目前所知仍较少。墨西哥洞穴鱼（Astyanax mexicanus（A. mexicanus））在睡眠、运动活动和昼夜节律方面已进化出显著差异17,18。这类鱼以具有眼睛的表层鱼类形式存在于墨西哥和美国南部德克萨斯州的河流中，同时在墨西哥东北部 Sierra Del Abra 地区周围至少存在29个洞穴种群19,20,21。值得注意的是，包括睡眠减少在内的许多行为差异似乎在多个洞穴鱼种群中独立出现14,22。因此，洞穴鱼为研究睡眠、昼夜节律及社会行为的趋同进化提供了一个理想的模型。

本方案描述了一种用于测量A. mexicanus 幼体和成体睡眠及运动行为的系统。该系统采用自行搭建的基于红外技术的记录装置，可在明暗条件下对动物进行视频录制。可使用 commercially available software（商用软件）来测量活动性，并通过自定义宏程序量化非活动性的多个方面，以确定睡眠时段。本方案还介绍了实验改进方法，可用于追踪水箱内多只动物的活动情况，从而研究睡眠与社会行为之间的相互作用。该系统还可应用于其他鱼类物种（包括斑马鱼和刺鱼）的睡眠、昼夜节律行为和运动活动的测量。

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方案

注意：建立幼虫和成虫行为追踪的系统。

1. 构建幼虫睡眠系统

注意：用于追踪受精后4天至30天（dpf）的A. mexicanus幼体至稚鱼阶段的监测系统需要多种设备，包括红外（IR）照明装置、丙烯酸红外光扩散板、自动灯光控制器（定时器）、计算机、摄像头，以及电线和电源控制器等辅助材料（图1A）。以下说明将介绍如何构建一套系统，以精确追踪幼体A. mexicanus的运动行为，用于研究其睡眠和昼夜节律。

  1. 构建一个由红外光（IR）和白光发光二极管（LED）组成的照明系统：将三个红外灯以三角形排列，彼此间距约为 7.62 cm，安装在一块 30.5 cm × 30.5 cm 的薄金属平台散热片上。使用电线将灯串联连接，并接入电源。
  2. 在三个红外灯的中心位置放置一个白光 LED，并将其连接至电源。
  3. 将 LED 的电源连接至一个设定为标准昼夜节律时间的灯光定时器。
  4. 构建幼虫追踪系统的平台。平台的所有组件均使用 0.33 cm 厚的白色标志级亚克力板制成。
  5. 将记录平台放置在带有照明的方形散热片上方，实验期间装有鱼类的观察区域将置于该平台上进行行为追踪。
  6. 在光源与动物之间，在箱体内放置第二层亚克力板，以散射红外光，实现最佳照明效果和对比度。
    注意：    幼虫光照箱的尺寸如下：由两块 18 cm × 8.5 cm 和两块 17 cm × 8.5 cm 的 LED 亚克力板通过化学粘合组成一个 18 cm × 18 cm 的正方形结构，高度为 8.5 cm。此外，使用适当的工具可轻松对亚克力板进行切割或钻孔，以实现定制尺寸。
    1. 将整个幼虫追踪平台及照明装置置于一个封闭的塑料管内，然后将摄像头置于管子顶部。
      注意：必须避免照明反射出现在追踪视频中，否则会影响追踪的准确性。将摄像头置于包围平台的管子顶部，有助于改善实验所用摄像头的照明条件和图像清晰度。
  7. 改装一个网络摄像头（参见材料表），用于基于红外光的记录。使用旋转工具拆除厂家配备的镜头（参见材料表）。
  8. 拆下摄像头背面的小型银色螺丝，以取下内部外壳。
  9. 拆下摄像头机身内部的小型黑色螺丝，以松动镜头剩余部分。使用小螺丝刀移除切割镜头后残留的任何镜头外壳部件。
  10. 拆除电荷耦合器件（CCD）外壳顶部的蓝色 LED。
  11. 将摄像头重新组装：将内部外壳恢复至原始位置，并将两个银色螺丝重新拧回原位。
  12. 使用小型锯子和圆形塑料铣刀对摄像头内部进行修整，使其能够适配镜头转接环。打磨多余塑料，直至可安装镜头适配器。
  13. 在尽可能靠近 CCD 的位置安装红外透过滤光片，但不得与 CCD 直接接触。
    注意：操作时需小心，避免损坏摄像头外壳内的 CCD 芯片。确保切割面尽可能平整。密封红外滤光片外缘与摄像头机身之间的任何缝隙，防止未经过滤的光线进入 CCD。
  14. 通过将摄像头前端的转接环拧入镜头后端，将摄像头与一个 35 mm 固定镜头连接（参见材料表）。
  15. 将摄像头和镜头安装在覆盖实验平台和光源的塑料管顶部盖子上预先钻好的孔中，并将 USB 线连接至用于记录动物行为的计算机。
    注意：应将鱼类放置在与种群饲养区分离的行为实验室内，以确保行为记录过程中干扰最小化。注意尽量减少温度和通风的波动，以免干扰行为实验结果。

2. 成人睡眠系统

  1. 通过将红外灯带裁剪为约46 cm的间隔，构建用于追踪成年鱼类的红外照明系统。每个10 L的行为学实验缸使用一条46 cm长的灯带即可。
  2. 将每条灯带串联连接，用电烙铁将灯带焊接到直流电源线上，并连接至9 V电源。
  3. 将每条红外灯带固定在一块51 cm × 5.1 cm的铝片上，该铝片将作为散热片使用。
  4. 在每条红外灯带前方直接放置一块46 cm × 5 cm、厚度为0.32 cm、透光率为9%的白色标志级亚克力板，以散射红外光。
  5. 将所有实验缸放置在可支撑后置式红外照明的支架上。
  6. 在10 L的玻璃缸中使用不透明塑料隔板创建独立的实验区域。
    注意：实验区域的大小可根据所用隔板数量和水箱尺寸进行调整。实验区域的大小会影响洞穴型和表层型鱼类的运动活动及睡眠行为23。
  7. 将摄像头安装在距离水箱约4–6 m的位置。通常每台摄像头可同时记录3个水箱，以提供足够的分辨率用于追踪。
    注意：成年鱼的行为记录通常不需要单独的白光照明系统来控制昼夜变化。仅使用行为学实验室内连接定时器的标准顶置照明通常已足够。

3. 记录运动活动

注意：所有行为记录均使用配备备用电池电源的标准笔记本电脑或台式计算机进行。由于24小时记录的文件体积较大（60–100 GB），请将所有记录保存在外部硬盘驱动器上。

  1. 在开始记录前，将4-30日龄的鱼类适应环境18-24小时。将幼鱼首次放入记录装置时以及记录开始前1小时，用活体丰年虾喂养。成年鱼应在记录行为前4-5天进行适应，并每天喂食一次薄片饲料或活体黑蠕虫。
    注意：记录前务必将幼鱼转移至新鲜水中，因为残留的丰年虾会在后续分析中导致追踪困难。也可选择与轮虫共培养，因其体型微小，不会干扰追踪。
  2. 将4-6日龄的鱼类置于24孔组织培养板中。将20-30日龄的鱼类置于12孔组织培养板中进行记录。
  3. 将成年鱼记录于10 L的水箱中，水箱可配备隔板以容纳五条单独饲养的鱼，或不设隔板以在社交环境中记录其睡眠与活动行为。
    注意：开始记录前需仔细调节相机焦距，以最大限度提高追踪准确性。切勿将相机镜头光圈开得过大，否则会显著降低图像清晰度。但亦需注意平衡：若光圈关闭过度，视频帧率将低于15.00 fps。为确保后续分析的准确性，帧率必须保持在每秒15.00帧，以便与某些自编的睡眠分析脚本23,24兼容。
  4. 设置照明/亮度及背景光源。
  5. 在记录开始前优化照明条件。始终将对比度保持在尽可能高的水平，并通过调节亮度和背景照明，使动物轮廓最为清晰。
  6. 对鱼类进行24或48小时的连续记录。
    注意：建议配备应急备用电池组，以在停电时为所有照明设备、计算机和相机供电。如有可能，所有电池组也应接入应急电源插座。通常情况下，电池组最多只能为设备供电数分钟至一小时，其主要作用是在主电源中断时，维持系统运行直至切换至应急供电系统。

4. 使用自动化追踪软件分析单独饲养鱼类的运动活性

  1. 开始行为分析时，打开追踪软件，选择 从模板创建新实验，然后选择 应用预定义模板.
  2. 由于程序现在会询问要追踪的物种，请选择 鱼类. 使用下拉框选择以下任意一项 斑马鱼幼体 的 成年斑马鱼 根据实验范式。
  3. 设置用于追踪每只动物的实验区域。对于幼虫，选择 圆底孔板 和 无区域模板对于成年人，使用 开放旷场，方形 与 无区域模板然后确定合适的竞技场数量，每个被追踪的动物对应一个竞技场。
  4. 选择最佳模型以进行优化追踪，然后点击追踪 中心点， 并确保动物的颜色比背景更深。应用视频采集时的帧率，跟踪软件应能自动检测此参数。
  5. 绘制标尺以校准物体在现实世界中的距离，从而准确测定鱼类的运动行为 竞技场设置.
  6. 编辑追踪区域，确保鱼类活动的整个范围均被覆盖；否则在数据采集过程中将导致样本丢失。
    注意： 设置实验区域时需格外小心。幼鱼尤其容易因实验区域过大或过小而产生追踪误差。实验中光照不良还可能在孔板壁上产生阴影，软件可能将其误认为是动物，导致假阳性结果。
  7. 点击 高级. 在……之下 方法 在 检测设置，选择 动态减影，然后点击 背景 并选择 开始学习调整暗对比度信号/噪声比，直至动物被良好追踪，且背景不会导致追踪发生跳变。
    注意： 视频质量可能因实验而异，因此每次试验可能需要相应地使用不同的设置。使用 受试者轮廓 和 受试者体型 特征可以显著改善追踪结果。
  8. 选择试验列表，并在开始将数据记录到程序中之前加载正确的参数。
  9. 点击进入 采集 标签，选择 追踪所有计划中的试验 并点击录制按钮。
  10. 下 分析图谱，确保 距离与时间 & 运动 被选中。
    注意： 为了后续的睡眠分析，这些设置必须正确，因为 .perl 文件需要按正确的顺序读取这些数据才能计算睡眠。
  11. 在“导出”中选择 原始数据，将数据导出为 Unicode 文本。

5. 群养鱼类的追踪

  1. 按照步骤 4.1–4.4 在追踪软件中设置实验。
  2. 在下拉菜单中，选择实验中需要追踪的动物数量。
  3. 在 Arena 设置中，绘制正确的标尺以校准真实世界中的距离。
  4. 在 Detection 设置中，使用 Dynamic Subtraction，并调整暗部对比度以实现对动物的最佳追踪。
  5. 在检测设置中调整目标尺寸，使仅追踪动物的一小部分。
    注意：仅追踪动物的一小部分可减少在数据采集过程中动物路径交叉时发生目标切换的情况。
  6. 获取轨迹后，使用 Track Editor 手动修正鱼类路径交叉的时间段。

6. 从运动活动数据中提取睡眠信息

注意：幼体和成体 A. mexicanus 睡眠的行为学定义为持续静止时间达到或超过 1 分钟。该定义基于觉醒阈值实验确定，在睡眠状态下（静止时间>60 秒），需要更强的感官刺激才能引发行为反应，而清醒状态下则不需要14,17。为了排除鱼类常见的小幅度运动和漂移干扰，设置了速度阈值，以区分真实运动与噪声或漂移。这些阈值通过计算距离与睡眠持续时间之间的相关性，选取最高 R² 值来确定，从而获得最准确的运动与睡眠判别速度。对于幼鱼，上下限速度均为 12 mm/s，因其几乎不存在漂移现象；而对于成鱼，为考虑漂移因素，下限设为 2 cm/s，上限设为 4 cm/s。

  1. 在分析计算机上安装 Cygwin，以运行自定义脚本，提取运动和睡眠行为数据。
  2. 在 Cygwin 的主目录中创建一个新的实验文件夹。
  3. 从追踪软件导入原始 Unicode 数据，并在 Cygwin 中执行 .sh 文件，将编码从 UTF-16 转换为 UTF-8。
  4. 在 Cygwin 中执行 .perl 文件，以提取睡眠数据。
  5. 打开宏文件，并按照电子表格中的说明完成所需的数据分析。
    注意：执行此部分分析需要具备基本的命令行编程能力，掌握通用的 Linux 命令即可。如果程序在读取数据时出现问题，请使用任意可用的文本编辑器检查追踪软件输出的数据，确保其编码和顺序正确，以便可执行文件能够正确写入。

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结果

在图1所述的定制封闭系统中，可稳定记录4至30日龄（dpf）的幼鱼。该系统配备红外光和可见光照明，可在明暗条件以及不同可见光环境下进行记录（图1A）。随后使用追踪软件分析视频（图1B、C），并利用自定义睡眠宏进行后期处理（参见补充下载）。来自三个独立洞穴鱼种群的幼鱼与表型鱼相比表现出显著的睡眠减少（图1D），且该睡眠减少现象在不同发育阶段具有一致性。用于睡眠分析的鱼类年龄通常取决于实验操作。例如，A. mexicanus在4日龄时还不摄食，因此研究睡眠与...

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讨论

本方案描述了一种用于定量分析幼体和成体洞穴鱼睡眠及运动活动的定制系统。洞穴鱼已成为研究睡眠进化的领先模型，可用于探究睡眠调控的遗传与神经基础1。本方案中的关键步骤包括优化光照条件和视频质量，以确保实现准确追踪，这是定量睡眠所必需的。本文所述的数据采集与分析系统具备完整功能，此外还有许多其他系统（无论是商业产品还是自行构建的系统）也可用于定量分析运动和行为28,29,30。先前用于单条鱼睡眠检测的方法可进一步扩展，以实现对群体饲养鱼类的分析。在故障排查或实验设计过程中需要重点考虑的是，社会行为可能对个体睡眠造成干扰。例如，攻击行为在Astyanax中较为常见，且表型鱼与洞穴鱼之间的攻击水平存在差异31。通过优化鱼的数量、实验区域大小以及性别比例，以尽量减少攻击行为，将有助于获得可重复的睡眠调控测量结果。

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披露

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

本工作获得了NIGMS资助项目GM127872（ACK）、NINDS资助项目105072（ERD和ACK）以及NSF资助项目1656574（ACK）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12 V 电源适配器Environmental Lights24 瓦 12 VDC 电源供应器
亚克力分隔板（成体）TAP Plastic按需订购相应尺寸的板材
成体红外光源Environmental Lights 24 瓦 12 VDC 电源供应器
电池组CyberPowerCP850PFCLCD
相机镜头（成体）Navitar Zoom 7000Zoom 7000
相机镜头（幼体）Fujian 35mm f/1.7B01CHX7668在亚马逊购买
相机镜头转接环d1524219
相机支架CowboyStudio Super ClampB002LV7X1K在亚马逊购买
鱼缸Deep Blue ProfessionalADB11006
散热片（成体）M-D Building productsSKU: 61085按需裁剪
散热片（幼体）M-D Building productsSKU: 57000按需裁剪
红外灯（成体）Environmental Lights 红外 850 nm 5050 LED 灯带irrf850-5050-60-reel按需裁剪
红外灯（幼体）LED WorldB00MO9H7H4在亚马逊购买
红外光扩散亚克力板TAP Plastic按需订购相应尺寸的板材
笔记本电脑/计算机N/AN/A任何笔记本电脑均可使用。
LED 灯Chanzon 10 高功率 LED 芯片 3W 白光（6000K-6500K/600mA-700mA/DC 3V-3.4V/3 瓦）B06XKTRSP7需配合 Chanzon 25 件装 1 W、3 W、5 W LED 散热片（2 针黑色）铝基板面板使用
灯光定时器Century 24 小时插拔式机械定时器（接地型）
红外灯塑料壁装板Everbilt 塑料穿孔板型号 # 17961
电源线BNTECHGO 22 号硅胶电线B01K4RPE0Y
电源Rapid LEDMOONLIGHT DRIVER (350MA)
组织培养板Fisherbrand12 孔（FB012928）24 孔（FB012929）
三脚架球形云台Demon DB-44B00TQ54CZO在亚马逊购买
USB 硬盘Seagate 3TB 备份硬盘STDT3000100
USB 网络摄像头Microsoft LifeCamQ2F-00014在亚马逊购买
相机壁装支架LDR Industries 1/2" 钢管307 12X36使用法兰和 90° 弯头固定在墙上。也可使用三脚架固定相机。

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