利用 Sniper-Cas9 通过定向进化在不损失靶上活性的前提下最小化 CRISPR-Cas9 的脱靶效应

摘要

本文介绍了一种优化CRISPR-Cas9系统以在不降低靶上活性的前提下提高其特异性的实验方案。我们采用一种名为Sniper-screen的定向进化方法，筛选具有理想特性的Cas9突变体。Sniper-Cas9可与截短的单导向RNA（truncated single-guide RNAs）以及核糖核蛋白（ribonucleoprotein）递送形式兼容，这两种策略均为已知可提高特异性的常用方法。

摘要

将成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白9（Cas9）开发为治疗手段时，必须避免其潜在的有害脱靶效应。已有多种方法被设计用于降低此类效应。本文介绍一种基于大肠杆菌（Escherichia coli）的定向进化方法，称为Sniper筛选法（Sniper-screen），用于获得一种具有优化特异性和保留靶向活性的Cas9变体，即Sniper-Cas9。利用Sniper筛选法，可同时进行阳性与阴性筛选。该筛选还可使用其他单导向RNA（sgRNA）序列重复进行，以富集真正的阳性克隆。通过使用CMV-PltetO1双启动子表达Cas9变体，可在哺乳动物细胞中快速检测文库的整体表现。本文还描述了进一步提高Sniper-Cas9特异性的方法。首先，既往研究表明，使用截短型sgRNA可提高Cas9的特异性。与其他工程化Cas9不同，Sniper-Cas9在与截短型sgRNA联用时仍能保持野生型（WT）水平的靶向活性。其次，Sniper-Cas9可采用核糖核蛋白（RNP）形式递送，而非质粒形式，且不会影响其靶向活性。

引言

在本文中，我们旨在通过结合多种策略来提高Cas9的特异性。目前已有多种方法用于避免CRISPR-Cas9的脱靶效应。例如，可使用截短的sgRNA以实现更高的特异性¹。此外，可通过将Cas9的递送方式从质粒形式改为核糖核蛋白（RNP）形式来提高特异性²。已根据先前报道的合理化设计，对Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）蛋白中的特定氨基酸残基进行了修饰^3,4,5。或者，也可随机改变氨基酸残基，并利用酵母⁶或E. coli^7,8筛选系统鉴定出特异性最高的Cas9变体。

然而，许多研究团队报告称，采用旨在削弱Cas9与底物之间非特异性相互作用的设计所构建的Cas9变体，其靶向活性较低。^{7,8,9,10,11,12}我们开发了一种 E. coli基于定向进化系统Sniper-screen筛选随机突变的Cas9变体。一个 E. coli 筛选系统相较于酵母系统具有优势，因其具有更快的倍增时间和更高的转化效率 E. coli.

Sniper筛选法利用三种不同的质粒以及整合到大肠杆菌（E. coli）基因组中的目的基因（GOI），同时进行阴性与阳性筛选。Cas9变体由低拷贝数质粒上的CMV-PltetO1双启动子系统表达，使得在E. coli中鉴定出的候选变体可直接在哺乳动物细胞中进行测试，无需亚克隆步骤。目的基因（GOI）通过Tn7转座子系统导入E. coli基因组中。sgRNA质粒含有温度敏感型复制起点，可表达靶向GOI的sgRNA，但sgRNA与GOI序列之间并非完全匹配。第三个质粒上存在一个完全匹配的sgRNA靶位点，该质粒携带ccdB基因，其编码一种可致死的毒素蛋白，能够抑制DNA旋转酶（gyrase）活性。在此系统中，表达具有高脱靶活性Cas9变体的细胞会因基因组DNA中错配位点处产生双链断裂（DSBs）而被清除；另一方面，表达低靶向活性Cas9变体的细胞也会因ccdB基因的致死性表达而被淘汰。通过调节无水四环素（ATC）的浓度，可改变Cas9变体的表达水平，从而调整筛选压力。

我们推断，将错配的sgRNA靶位点定位于基因组DNA而非质粒上，将提高该系统的灵敏度。这种方法的优势在于，基因组中仅有一个靶位点，而在单个大肠杆菌（E. coli）细胞内可能存在多个含有靶位点的质粒。

利用该系统，我们鉴定出一种Cas9变体Sniper-Cas9，其在靶向活性方面达到与野生型Cas9相当的水平，同时脱靶活性较野生型Cas9显著降低。通过使用截短型sgRNA或以核糖核蛋白复合物（RNP）形式递送，而非质粒递送，Sniper-Cas9可实现更高的特异性比率。

方案

1. 人类的整合 目的基因 进入 BW25141 E. coli 菌株

1. 目的基因（GOI）的克隆
   1. 采用标准PCR方法，使用含有NotI和XhoI限制性酶切位点的引物，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增一段包含多个候选靶位点的500 bp人源GOI片段。
      注：本实验中，GOI为人类EMX1基因。
   2. 用NotI和XhoI限制性内切酶对PCR产物和pgrg36¹³载体进行双酶切。
   3. 通过凝胶电泳纯化目标片段（500 bp和12 kb）。
   4. 使用T4 DNA连接酶将片段连接。具体操作：在20 μL反应体系中混合50 ng酶切后的pgrg36载体和6 ng PCR插入片段，体系包含1×连接酶缓冲液和0.5 U连接酶。于室温（RT）孵育过夜。
   5. 将连接产物转化至DH5-α感受态细胞中。将转化后的菌株接种于含氨苄青霉素（100 μg/mL）的Luria肉汤（LB）琼脂平板上，32 °C培养过夜。挑取单克隆菌落，接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中过夜培养。使用 commercially available miniprep Kit 从E. coli中提取质粒DNA。通过Sanger测序对小量制备的质粒（mini-prep）进行测序，确认GOI片段的正确插入¹³。
2. BW25141-GOI菌株的构建
   1. 将获得的pgrg36-GOI质粒转化至BW25141 E. coli菌株中。必须使用BW25141菌株，以最大限度减少假阳性克隆的数量。
   2. 将转化后的菌株在LB培养基中32 °C过夜培养。GOI被插入至BW25141菌株的基因组DNA中（即BW25141-GOI）。按照标准pgrg36操作流程¹³去除BW25141-GOI菌株中的pgrg36-GOI质粒。简要步骤：将单克隆菌落稀释约10⁷倍后，接种于LB平板，42 °C过夜培养。随后将菌落划线接种至新的LB平板，42 °C继续培养过夜。
   3. 使用pgrg36操作流程推荐的引物进行菌落PCR，验证GOI的正确插入：5'-GATGCTGGTGGCGAAGCTGT-3' 和 5'-GATGACGGTTTGTCACATGGA-3'。该引物扩增基因组DNA中的插入位点，预期PCR产物大小为904 bp加上插入片段长度（本实验中为500 bp）。
   4. 制备电转化感受态的BW25141-GOI细胞（详细步骤见3.2.6–3.2.10）。

2. Cas9 变体文库的制备

1. 文库构建
   1. 转化 Cas9 载体⁷ 进入一种商业产品 E. coli 突变株（材料表）并按照制造商说明制备突变体文库（Mutator文库）。
   2. 对Cas9载体中的完整野生型Cas9序列使用易错PCR试剂盒进行易错PCR扩增，材料表).
      注意：在 Sniper-Cas9 案例中采用了低错误率方案，以避免破坏蛋白质的原有功能。
   3. 用适当的限制性内切酶消化Cas9载体。对PCR产物（来自步骤2.1.2）和消化后的载体骨架进行琼脂糖凝胶回收纯化。
      注意：SpCas9 基因的大小约为 4.3 kb。在 Sniper-Cas9 案例中，选用 XhoI 和 KpnI 来消化 pBLC-SpCas9 载体。
   4. 将骨架片段（来自步骤 2.1.3）与通过易错 PCR 扩增的插入片段（来自步骤 2..1.3）通过等温组装连接 体外 重组
      注意：需要超过 500 ng 的骨架质粒才能获得高浓度的文库（易错 PCR [EP] 文库）。在 Sniper-Cas9 实验中，使用了两种不同的易错 PCR 试剂盒来构建 EP 文库（EP 文库 I 和 II）。
   5. 使用能够进行低洗脱体积的DNA纯化试剂盒，纯化组装产物（来自步骤2.1.4）材料表用 6 μL 无核酸酶水（NFW）洗脱，并测定 DNA 浓度。
   6. 将每种Cas9文库载体（共三种文库，每种不少于500 ng）分别转化至50 μL电转感受态细胞中 E. coli 细胞（材料表）。参见步骤 3.2.1-3.2.4 中的电穿孔实验方案。在本项文库构建中，每 50 μL 感受态细胞使用 1 mL SOC 培养基，而非 250 μL。
   7. 制备含有回收细胞的混合物与SOC培养基的1:100、1:1,000和1:10,000稀释液。将稀释后的细胞接种至添加氯霉素（12.5 μg/mL）的100 mm LB琼脂平板上。将剩余细胞接种至245 mm平板上² 培养皿。37 °C 过夜培养。
2. 文库复杂度的计算
   1. 通过凝胶成像系统或普通数码相机拍摄稀释平板照片。运行 OpenCFU 软件¹⁴ 拍摄稀释平板的照片并上传。在平板内设置计数区域，并剔除假菌落。
   2. 手动将菌落数乘以稀释倍数，得到原始转化子数量。将这些数值转换为以10为底的对数形式。计算平均值以确定文库的复杂度。
   3. 当达到所需的复杂度值时，使用涂布棒和 20 mL 添加氯霉素的 LB 培养基收集 245 mm 方形培养皿（步骤 2.1.7）上的所有菌落。不要培养收集的菌落，而是使用商业化的中量质粒提取试剂盒纯化质粒文库。
      注意：文库复杂度越高越好。在鉴定 Sniper-Cas9 时，文库多样性达到 3 x 10⁶ 每个文库均实现了上述目标。

3. 进化 Cas9 的阳性与阴性筛选

1. 靶点选择与质粒构建
   1. 在GOI中选择一个sgRNA间隔序列。将随机核苷酸中的一个或两个残基替换，以产生错配序列。
      注：在Sniper-Cas9案例中使用了人源EMX1靶点3（GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA，含GGG PAM）。以下为所用的错配序列：GAGTCCGAGCAGAAagAGAA、GAacCCGAGCAGAAGAAGAA、GAGTCCGAGCAGAgGAAGAA 和 GAGcCCGAGCAGAAGAAGAA。
   2. 使用标准的寡核苷酸（oligo）克隆方法⁷，将错配序列（见步骤3.1.1）插入sgRNA质粒中。
   3. 将带有3'端PAM的错配序列插入p11-lacY-wtx1（材料表）中，使用标准的寡核苷酸克隆方法¹⁵构建ccdB质粒。
2. 制备Sniper筛选用E. coli感受态细胞
   1. 将BW25141-GOI电转化感受态细胞置于冰上解冻。
   2. 向50 μL解冻的BW25141-GOI细胞中分别加入1 ng的ccdB质粒和含有双错配的sgRNA质粒。用移液器轻轻混匀后转移至预冷的0.1 cm电穿孔比色皿中。
   3. 通过电穿孔将两种质粒共转化至E. coli中。电穿孔后立即加入250 μL SOC培养基。轻轻吹打混匀细胞与培养基，然后将混合物转移至1.5 mL微量离心管中。
      注：为获得最高效率，电压应设为1.80 kV，运行时间应在4.8 ms至5.0 ms之间。
   4. 将转化后的细胞在32 °C下温和振荡培养1小时以恢复生长。
   5. 取125 μL恢复后的细胞涂布于含氨苄青霉素（50 μg/mL）/卡那霉素（25 μg/mL）的LB琼脂平板（培养条件）上。将剩余细胞涂布于含氨苄青霉素/卡那霉素/阿拉伯糖（1.5 mg/mL）的LB琼脂平板（ccdB表达条件）上。32 °C过夜培养。
   6. 检查ccdB表达条件平板上是否无存活菌落。用涂布棒收集培养条件平板上的菌落，并将其接种于250 mL SOB（超优肉汤）培养基中，该培养基补充有50 μg/mL氨苄青霉素和25 μg/mL卡那霉素，在32 °C下温和振荡培养。
   7. 当600 nm处的光密度（OD₆₀₀）达到0.4时，将培养瓶置于冰上冷却。准备预冷的去离子水和预冷的10%甘油溶液（使用前灭菌）。
   8. 将细胞在4 °C下以4,000 × g离心5分钟，弃去上清液。加入200 mL预冷的去离子水，用10 mL移液管重悬细胞。重复此步骤3次。
   9. 用50 mL预冷的10%甘油溶液洗涤细胞，然后按前述条件（4 °C下4,000 × g离心5分钟）离心。
   10. 弃去上清液，将沉淀重悬于300 μL 10%甘油溶液中。分装成50 μL一份，用液氮速冻后于-80 °C保存（即Sniper筛选细胞）。
3. Sniper筛选
   1. 将Sniper筛选细胞（来自步骤3.2.10）与来自每个文库的100 ng Cas9变体质粒（来自步骤2.2.3；参见步骤2.1.1和2.1.4）共转化。按照步骤3.2.1–3.2.3所述的电穿孔步骤进行操作。
   2. 将250 μL细胞转移至新的1.5 mL微量离心管中，加入250 pg ATC，使其终浓度为10 ng/mL。对含ATC和不含ATC的细胞均进行复苏培养（复苏步骤参见步骤3.2.4）。
   3. 取25 μL复苏后的不含ATC的细胞涂布于含氯霉素/卡那霉素的LB琼脂平板（非选择性条件）上。向含ATC的复苏细胞中加入ATC，使其在245 mm LB平板上的终浓度为100 ng/mL，立即涂布于含氯霉素/卡那霉素/阿拉伯糖的LB琼脂平板（选择性条件）上。32 °C过夜培养。
      注：LB平板的大小和数量由筛选文库的多样性规模决定。例如，若使用直径100 mm、含20 mL LB的培养皿，则加入2 μg ATC。
   4. 拍摄平板照片，使用OpenCFU软件¹⁴计数可存活菌落数量（参见步骤2.2.1）。确保非选择性平板上的菌落数至少为文库多样性的10倍以上，以覆盖所有变体。
   5. 按如下方式计算存活频率：
      存活频率 = 选择性平板上的菌落数 /（非选择性平板上的菌落数 × 10）
   6. 收集三个文库中在选择性平板上存活的所有菌落并混合。将存活菌落在含12.5 μg/mL氯霉素的250 mL LB培养基中于42 °C过夜培养。使用中量提取试剂盒（midiprep kit）提取筛选后的Cas9文库DNA。
      注：此步骤可清除sgRNA质粒。
   7. 重复步骤3.3.1–3.3.6的筛选过程，直至存活频率达到平台期。转化时使用10 ng筛选出的Cas9质粒，复苏期间ATC浓度维持在10 ng/mL，选择性条件下ATC浓度维持在100 ng/mL。
4. 基因重排与第二轮筛选
   1. 采用以下DNA重排方案对筛选出的混合变体进行重排。使用位于插入片段两端上下游约150个核苷酸处的引物，通过PCR扩增Cas9质粒中的Cas9插入片段。取2 μg PCR产物，用DNase I在37 °C消化1分钟。
   2. 通过2%琼脂糖凝胶电泳纯化长度为70–200 bp的片段。对纯化后的片段进行PCR扩增，并以此产物为模板，使用针对Cas9两侧设计的适当引物再次扩增Cas9插入片段。将最终PCR产物用于构建Cas9文库（构建方法见步骤2.1.4）。
   3. 使用另一种错配的sgRNA质粒（见步骤3.1.1）制备新的Sniper筛选细胞（参见第3.2节），并重复筛选流程（第3.2–3.3节），直至存活率趋于稳定。转化时使用10 ng筛选出的Cas9质粒，复苏期间ATC浓度为10 ng/mL，选择性条件下ATC浓度维持在10 ng/mL。
5. 进化型Cas9突变体质粒的筛选
   1. 完成最后一次筛选后，从选择性平板上随机挑取一百个菌落，接种于含氯霉素的LB培养基中，在42 °C过夜培养。
   2. 采用质粒小提（miniprep）方法提取质粒，并使用Cas9内部的测序引物对插入片段进行Sanger测序。
   3. 选择出现频率最高的前三种变体，用于在人源细胞系中进一步测试。

4. 将Cas9以RNP形式与截短的sgRNA共同递送

1. 使用 Cas-OFFinder 进行靶基因筛选
   1. 使用 Cas-OFFinder（http://www.rgenome.net/cas-offinder/）选择靶位点。根据特定类型的 Cas9 及靶基因组（人、小鼠、斑马鱼等）选择相应的 PAM 类型。填写 查询序列 标签，选择 错配数，然后单击 提交 按钮。
   2. 几秒钟后，将显示靶向位点（错配数为‘0’）和脱靶位点。通常应选择错配数为一至三个的脱靶位点。
2. sgRNA模板的制备
   1. 订购以下模板序列的crRNA和tracrRNA寡核苷酸：crRNA序列：5'-TAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAA-3'；tracrRNA序列：5'-AGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3'。将步骤4.1.2中获得的靶序列填入crRNA序列的N20位置。如需设计截短型sgRNA，可从5'端去除碱基，获得N19、N18或N17的sgRNA序列。
   2. 按照以下步骤配制用于扩增编码sgRNA序列的PCR反应体系：加入10 μL 5x缓冲液、0.5 μL crRNA引物（100 pmol/μL）、0.5 μL tracrRNA引物（100 pmol/μL）、2.5 μL dNTPs（各10 mM）、0.5 μL DNA聚合酶以及36 μL NFW。材料表).
   3. 使用以下条件对模板进行扩增：初始变性：98 °C 下 1 min；变性、退火和延伸：98 °C 下 10 s，54 °C 下 15 s，72 °C 下 20 s，共 25 个循环；最终延伸：72 °C 下 5 min。
   4. 在2%琼脂糖凝胶上分析2 μL扩增的模板DNA（来自步骤4.2.3）。使用PCR纯化试剂盒纯化模板。
      注意：模板DNA的大小为125 bp。
3. sgRNA的合成
   1. 按照以下步骤配制sgRNA合成的反应混合物：将8.5 μL模板DNA（来自步骤4.2.3）、1 μL UTP（25 mM）、1 μL CTP（25 mM）、1 μL GTP（25 mM）、1 μL ATP（25 mM）、4.2 μL MgCl₂、2 μL 0.1 M DTT、1 μL RNase抑制剂、2 μL T7 RNA聚合酶和2 μL 10×转录缓冲液加入无核酸酶的离心管中，轻轻混匀。₂ （100 mM）、4.5 μL T7 RNA聚合酶（50 U/μL）、3 μL 10× T7 RNA聚合酶缓冲液、1.2 μL 焦磷酸酶（0.5 U/μL）、0.75 μL RNase抑制剂（40 U/μL）以及4.2 μL无核酸酶水（NFW）。
   2. 在37 °C下孵育反应混合物过夜（至少10 h）。向反应混合物中加入0.5 μL DNase（2 U/μL），在37 °C下孵育15–30 min。使用RNA纯化试剂盒纯化sgRNA。
   3. 为降低由sgRNA上的5'-三磷酸基团引发的先天免疫反应所导致的毒性¹⁶，用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）去除向导RNA的5'-三磷酸，步骤如下：将10 µg的 体外在37 °C条件下，使用250 U CIP处理转录的RNA 3小时，同时加入100 U RNase抑制剂。使用RNA纯化试剂盒纯化经CIP处理的sgRNA。

5. WT-Cas9 与 Sniper-Cas9 蛋白的表达与纯化

1. 蛋白质表达在 E. coli
   1. 转化 pET 质粒¹⁸ 将编码 His 标签标记的野生型和 Sniper-Cas9 插入 BL21 (DE3) E. coli 菌株
   2. 接种一环含有 pET-Cas9 表达质粒的新鲜菌落于 50 mL 含 50 μg/mL 卡那霉素的 LB 培养基中，37 °C、200 rpm 振荡培养过夜（预培养）。
   3. 将10 mL过夜培养物转移至500 mL含50 μg/mL卡那霉素的新鲜LB培养基中。在37 °C、200 rpm振荡条件下培养2 h。
   4. 监测 OD₆₀₀ 直到培养物达到对数生长中期（OD₆₀₀ ≈ 0.6–0.7).
   5. 用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，终浓度为 0.25 nM）诱导表达 WT-Cas9 或 Sniper-Cas9 蛋白。将培养物在 18 °C 下过夜培养。
2. 蛋白质纯化
   1. 通过在 5,000 x g 条件下离心收集细胞 g 4 °C 下离心 10 分钟。
   2. 将沉淀重悬于裂解缓冲液（50 mM NaH₂PO₄，300 mM NaCl，10 mM 咪唑，4 mM 二硫苏糖醇（DTT），5 mM 苄脒，100 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF），pH 8，每克湿重使用 20 mL。
   3. 加入PMSF、DTT和溶菌酶，使终浓度均为1 mg/mL，冰上孵育30分钟。
   4. 在冰上对细胞进行超声处理。以200–300 W功率反复脉冲处理，每次10秒，脉冲间歇冷却10秒，总时长为20分钟。
   5. 将裂解液在6,000 x g条件下离心 g 4 °C 下孵育 30 分钟。
   6. 将上清液转移至新离心管中。向5 mL澄清裂解液中加入1 mL His-Bind琼脂糖树脂，4 °C轻柔振荡孵育1小时。
   7. 将裂解液/His-Bind 琼脂糖树脂混合物上样至底部出口带盖的层析柱中。
   8. 取下底部盖帽，收集柱流出液。
   9. 用洗涤缓冲液（50 mM NaH）洗涤柱子 2 次₂PO₄，300 mM NaCl，20 mM 咪唑，pH 8）；收集洗涤组分，用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。
   10. 用1 mL洗脱缓冲液（50 mM NaH）将蛋白质洗脱10倍₂PO₄，300 mM NaCl，250 mM 咪唑，pH 8），收集样品进行SDS-PAGE。
   11. 使用100 kDa超滤管浓缩洗脱的WT-或Sniper-Cas9蛋白。将样品储存于含10 mM Tris-HCl、150 mM NaCl和50%甘油的溶液中，置于-80 °C保存。

6. RNP 递送

1. 转染及RNP递送的细胞准备
   1. 在含10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO₂条件下培养HEK293T细胞。
   2. 将WT-或Sniper-Cas9蛋白（2 μg）与sgRNA（2 μg）混合，在室温下孵育10分钟，形成RNP复合物。
   3. 用胰酶消化并计数细胞，每反应准备2 × 10⁴个细胞。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞后离心，吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于电穿孔缓冲液中。
   4. 使用以下参数将RNP复合物电穿孔转入细胞：1,300 V、30 ms、单次脉冲。电穿孔后立即将细胞接种至48孔板中，每孔加入500 μL含FBS和抗生素的DMEM（如步骤6.1.1所述），于37 °C、5% CO₂条件下培养。
   5. 转染48小时后，使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

7. 转染编码Sniper-Cas9和sgRNA的质粒

1. sgRNA 质粒的构建
   1. 根据以下模板序列订购正向和反向寡核苷酸，正向序列：5'-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'；反向序列：5'-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3'。将其中的 N20 替换为步骤 4.1.2 中获得的靶序列。可将靶序列缩短至 N19、N18 或 N17 长度，以合成截短型 sgRNA。
   2. 在 1× T4 DNA 连接酶缓冲液中对两条寡核苷酸进行退火。
   3. 使用 BsaI 限制性内切酶对 pRG2 载体进行酶切消化。
   4. 通过 0.8% 琼脂糖凝胶对酶切后的载体（3,300 bp）进行凝胶纯化。
   5. 使用 T4 DNA 连接酶在 37 °C 下连接退火后的寡核苷酸与纯化的载体片段：在 20 μL 反应体系中混合 50 ng 酶切后的 pRG2 和 1 ng 退火寡核苷酸，室温孵育 15 分钟。
   6. 将连接产物转化至 DH5 alpha 感受态细胞中，并在含氨苄青霉素（100 μg/mL）的 LB 琼脂平板上于 37 °C 培养转化子。通过标准测序方法确认寡核苷酸在载体中的正确插入。
2. 编码 Sniper-Cas9 与 sgRNA 质粒的转染
   1. 将 HEK293T 细胞在含 10% 胎牛血清和 1% 抗生素的 DMEM 培养基中，于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养。转染前一天，用胰蛋白酶消化并计数细胞。当以 48 孔板规模操作时，每孔接种 1 × 10⁵ 个细胞于 250 μL 完全培养基中。转染当天，细胞融合度应达到 50%–80%。
   2. 在 48 孔板规模下，每孔转染使用 250 ng p3s-Cas9 质粒和 250 ng sgRNA 质粒，采用脂质体转染试剂。将质粒溶于 25 μL 无血清 MEM 培养基中混合。
   3. 将 1 μL 转染试剂与 25 μL 无血清 MEM 培养基稀释，室温孵育 5 分钟。随后将两种混合液合并，室温继续孵育 20 分钟，以形成质粒-脂质体复合物。
   4. 孵育 20 分钟后，将 50 μL 含质粒-转染试剂复合物的溶液直接加入含细胞的各孔中，轻轻前后摇动培养板混匀。转染后，将细胞置于 37 °C、CO₂ 培养箱中继续培养 48–72 小时，随后检测外源基因的表达情况。

8. 计算插入缺失频率以确定靶向和脱靶活性

1. 靶向深度测序分析目标位点及潜在脱靶位点
   1. 使用基因组DNA提取试剂盒从步骤6.1.5或7.2.4中提取基因组DNA。通过PCR扩增含有目标位点和脱靶位点的基因组DNA，构建深度测序文库。
   2. 使用带索引的引物对每个样本进行标记。将混合后的文库使用下一代测序仪进行双端测序。
2. 使用Cas-Analyzer进行深度测序数据分析
   1. 利用Cas-Analyzer评估工具¹⁷分析深度测序数据。
   2. 在Read 1和Read 2标签下选择相应的Fastq文件（Read 1 = XX_SXX_L001_R1_001.fastq，Read 2 = XX_SXX_L001_R2_001.fastq）。
   3. 填写基本信息标签页和分析参数标签页，然后点击提交按钮。

结果

完成 Sniper-screen 后，可通过将含有氯霉素、卡那霉素、阿拉伯糖和 ATC（CKAA）的 LB 平板上的菌落数除以仅含氯霉素和卡那霉素（CK）的 LB 平板上的菌落数，计算存活菌落的百分比。当使用 SpCas9 文库进行 Sniper-screen 时，该百分比通常非常低。通过使用存活菌落池重复筛选，可富集真阳性结果。例如，在本例具有代表性的 Sniper-screen 中，经过第三次筛选后获得了 100% 的存活率（图 1）。可利用 RNPs 或质粒编码的 Sniper-Cas9 对不同靶点进行转染，并通过靶向扩增子测序检测其相应的靶上和脱靶活性（图 2）。在大多数靶点处，Sniper-Cas9 与野生型相比表现出相当的靶上活性水平以及更高的特异性比率。截短的 sgRNA 也可用于进一步提高特异性（图 3）。然而，由于在大多数情况下，与全长 sgRNA 相比，截短型 sgRNA 会导致较低的靶上活性，因此其应用仅限于少数靶点。因此，必须测试不同长度（17 至 20 个核苷酸）的 sgRNA，并同时检测其靶上和脱靶活性，以优化特异性。

图 1：使用不同随机 Cas9 变体文库进行的代表性 Sniper 筛选。 突变文库、EP 文库 I 和 EP 文库 II 表示使用不同商业试剂盒构建的文库。第一轮、第二轮和最终轮表示富集筛选执行的次数⁷。本图经 Lee 等人⁷ 修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

图2：通过质粒或核糖核蛋白（RNP）递送20碱基引导序列时，野生型Cas9（WT-Cas9）或Sniper-Cas9的靶向与脱靶活性。 特异性比值通过将靶向活性除以脱靶活性计算得出。误差条表示标准误（SEM）（n = 3）⁷。本图经Lee等⁷修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 3：使用不同长度的 sgRNA 靶向 FANCF01 和 AAVS 位点时，Sniper-Cas9 与野生型 Cas9（WT-Cas9）的靶上和脱靶活性比较。特异性比值通过将靶上位点的插入缺失频率除以相应脱靶位点的插入缺失频率计算得出。图中注明了 5' 末端含有匹配鸟嘌呤的 sgRNA（GX18 或 GX19）以及含有不匹配鸟嘌呤的 sgRNA（gX17、gX18、gX19 或 gX20）。当标准化后的靶上活性 <70% 时，未计算特异性比值⁷。本图改编自 Lee 等人⁷。 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

对于希望避免繁琐筛选流程以获得 Sniper-Cas9 的研究者，Sniper-Cas9 蛋白及其编码质粒均可获取。利用这些材料，应确定 sgRNA 的最佳长度，即能够提供最高特异性比率的长度。此外，建议以核糖核蛋白复合物（RNP）形式递送 Sniper-Cas9 和 sgRNA，因为与质粒形式递送相比，通常可实现更高的特异性比率。与 Sniper-Cas9 不同，其他工程化 Cas9 变体不兼容截短的 sgRNA^6,7 或以 RNP 形式递送⁸（HiFi-Cas9 除外）。

对于Sniper-screen而言，错配序列的选择是最关键的步骤。应避免选择与目的基因（GOI）序列具有较低切割活性相关联的错配sgRNA。否则，具有野生型特异性水平的Cas9变体会无法切割含有错配靶位点的大肠杆菌（E. coli）基因组DNA，从而导致大量背景菌落的产生，危及整个筛选过程。

与酵母相比，大肠杆菌（E. coli）具有更快的倍增时间以及更高的转化效率，因此Sniper-screen相较于基于酵母的筛选方法具有优势。此外，与其他将错配位点携带在质粒上的大肠杆菌（E. coli）系统相比，Sniper-screen应具有更高的灵敏度：在我们的系统中，基因组DNA仅有一个拷贝，因此错配位点也只有一个拷贝，而在单个大肠杆菌（E. coli）细胞内则存在大量质粒。

其他可诱导双链断裂（DSBs）的DNA内切酶（如SaCas9或Cpf1）的特异性也可通过使用Sniper-screen进行优化。然而，Sniper-screen无法直接用于提高碱基编辑器的特异性，因为碱基编辑器不会在大肠杆菌（E. coli）的基因组DNA中诱导双链断裂。由于碱基编辑器在其系统核心中使用Cas9的切口酶或失活版本，因此可通过利用Sniper-screen筛选获得的阳性结果来提高碱基编辑器的特异性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小牛肠道碱性磷酸酶（CIP）	NEB	M0290L
氨苄青霉素钠盐	Fisher Chemical	BP1760-25
盐酸无水四环素	Sigma Aldrich	37919 或 94664
抗生素-抗真菌素溶液	Welgene	LS203-01	培养基组分
BamHI	Enzynomics	R003L
氯霉素	Sigma Aldrich	R4408
Diversify PCR 随机诱变试剂盒	Clontech	630703	易错 PCR 试剂盒
DNA 打散试剂盒	Jena Bioscience	PP-103
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Welgene	LM001-17	培养基
Endura 电转感受态细胞（DUO）	Lucigen	60242-2	E. coli 文库构建用电转感受态细胞
胎牛血清（FBS）	Welgene	S101-01	培养基组分
Gene Pulser II	Bio-Rad		E. coli 电穿孔设备
GeneMorph II 随机诱变试剂盒	Agilent	200550	易错 PCR 试剂盒
基因组 DNA 提取试剂盒	GenAll	106-152	gDNA 提取试剂盒
甘油	BioShop	GLY001.1
GP/MP 电穿孔杯，0.1 cm	Bio-Rad	BR165-2089	E. coli 电穿孔设备
HEK293T 细胞	ATCC	CRL-11268	人源细胞系
硫酸卡那霉素	Acros Organics	450810500
L-(+)-阿拉伯糖	Sigma Aldrich	A3256-25G
LaboPass PCR 纯化试剂盒	Cosmogenetech	CMR0112
LaboPass 质粒小提试剂盒	Cosmogenetech	CMP0112	小提试剂盒
LB 琼脂 Miller	Formedium	LMM0202
LB 肉汤 Miller	Formedium	LMM0102
Lipofectamine	Invitrogen	11668019	转染试剂
NEBuilder HiFi DNA 组装预混液	NEB	E2621L	吉布森组装（等温 in vitro 重组）混合液
Neon 转染系统	Thermo	MPK5000	RNP 电穿孔设备
Neon 转染系统 10 µL 试剂盒	Thermo	MPK1096	RNP 电穿孔设备
NucleoBond Xtra Midi EF	Macherey-Nagel	740420.50	中提试剂盒
Oligo Clean & Concentrator	Zymo Research	D4061	可实现低洗脱体积的 DNA 纯化试剂盒
Opti-MEM	Gibco	LS31985070	转染培养基
p11-lacY-wtx1	Addgene	#123945
pgrg36	Addgene	#16666	E. coli 诱变菌株
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	NEB	M0530L
焦磷酸酶	NEB	M2403L
核糖核苷酸溶液套装	NEB	N0450L
RNase 抑制剂	NEB	M0314L
T7 RNA 聚合酶	NEB	M0251L
Turbo Dnase	Ambion	AM2238
XbaI	Enzynomics	R013L
XL1-Red 感受态细胞	Agilent	200129