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方法文章

环境动态力学分析预测神经植入物的软化行为

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DOI：

10.3791/59209

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2019年3月1日

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Texas at Dallas, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Texas at Dallas, 3Center for Engineering Innovation, University of Texas at Dallas, 4Department of Bioengineering, University of Texas at Dallas

本文内容

摘要

为了能够可靠地预测用于神经植入物的聚合物基底在体内的软化行为 体内 环境，拥有可靠的 体外 方法。此处介绍了在体温条件下于磷酸盐缓冲盐水中使用动态机械分析的方法。

摘要

使用动态软化基底进行神经植入时，必须具备可靠的 体外 一种用于表征这些材料软化行为的方法。过去，在模拟体内环境的条件下，尚无法简便有效地测量薄膜材料的软化过程。本文介绍了一种新颖且简便的方法，可在相关温度下对聚合物在溶液（如磷酸盐缓冲液，PBS）中的动态力学性能进行动态机械分析（DMA）。采用环境控制型DMA可测量聚合物在不同介质和温度下因增塑作用而产生的软化效应，从而实现对材料在实际使用环境中行为的预测 体内 条件。

引言

用于神经植入物基底材料的新一代材料包括可软化的形状记忆聚合物1,2,3,4,5,6,7,8,9。这些材料在植入过程中具有足够的刚性，以克服临界屈曲力，但在植入体内环境后，其模量可降低至原来的千分之一。据预测，与神经植入物中常用的钨或硅等传统材料相比，由于这类材料的模量失配显著减小，因而有望实现更优的器件-组织相互作用。传统的刚性器件在植入后会引发炎症反应，继而出现组织包封和星形胶质细胞瘢痕，常常导致器件失效10,11。普遍认为，刚性较低的器件可最大程度地减轻异物反应12,13,14。器件的刚度由其横截面积和模量共同决定。因此，降低这两个因素对于提高器件的顺应性以及最终改善器件与组织的相互作用至关重要。

关于聚合物软化的研究受到Nguyen等人15工作的启发，他们证明了机械顺应性皮层内植入物可减轻神经炎症反应。此前，他们曾使用具有力学自适应性的聚醋酸乙烯酯/海鞘纤维素纳米晶体（tCNC）纳米复合材料（NC），该材料在植入后会变得柔韧。

另一方面，Voit 实验室采用高度可调的硫醇-烯烃以及硫醇-烯烃/丙烯酸酯聚合物体系。这类材料的优势在于，通过聚合物设计可以轻松调节其在体内环境中暴露后的软化程度。通过选择合适的聚合物组成和交联密度，可调节聚合物的玻璃化转变温度及杨氏模量2,4,5,6,8。软化现象的根本机制是聚合物在水性环境中的增塑作用。若所用聚合物在干燥状态（即植入时的状态）下的玻璃化转变温度（Tg）高于体温，而在浸入水或磷酸盐缓冲液（PBS）后低于体温，则该聚合物的刚度/模量可在植入后由干燥时的玻璃态（坚硬）转变为湿润后的橡胶态（柔软）16。

然而，过去一直无法精确且可靠地测量因增塑作用导致的材料软化以及玻璃化转变温度（Tg）从干燥状态到湿润状态的偏移。传统的动态力学分析通常在空气或惰性气体中进行，无法用于测量聚合物在溶液内部的热机械性能。在以往的研究中，聚合物被浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中不同时间，随后对溶胀后的样品进行动态力学分析（DMA）6,7,8。然而，由于该过程涉及升温程序，样品在测量过程中会开始干燥，从而无法获得具有代表性的数据。当样品尺寸较小时，这一问题尤为突出。为了准确预测神经探针的软化行为，有必要对厚度为5至50 µm的聚合物薄膜进行测试，而传统DMA因上述测量过程中样品干燥的问题，无法实现这一目标。

Hess 等人17设计了一种定制的微拉伸测试装置，采用环境可控的方法来评估机械适应性材料的力学性能。他们此前在测量过程中使用喷雾器系统向样品喷水，以防止样品干燥。

然而，使用环境DMA（图1）可以在不同温度下对溶液（如水和磷酸盐缓冲液PBS）中的聚合物薄膜进行测量。这不仅能够测量聚合物在溶胀/软化状态下的热机械性能，还可测量其软化动力学。甚至可在该仪器的浸没浴中进行拉伸试验和溶胀度测量。这使得能够精确研究塑化诱导的聚合物基底软化行为，从而预测其在体内的表现（in vivo行为）。

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方案

1. 测试用聚合物样品的制备

  1. 在通风橱内，根据先前的方案合成软化型硫醇-烯烃聚合物。1,2,4,18 简而言之，将定量的巯基与烯烃单体混合，并加入总量为0.1 wt%的光引发剂。
    1. 准备一个20 mL玻璃小瓶用于聚合物混合。用铝箔包裹小瓶，以防止入射光接触单体溶液，并置于室温（RT）下。所有化学品均未经进一步纯化，直接使用。
    2. 为了完全软化聚合物，使用一次性塑料移液管将50 mol%的1,3,5-三烯丙基-1,3,5-三嗪-2,4,6(1H,3H,5H)-三酮（TATATO）、45 mol%的三羟甲基丙烷三（3-巯基丙酸酯）（TMTMP）和5 mol%的异氰尿酸三[2-(3-巯基丙酰氧基)乙基]酯（TMICN）加入带盖的小瓶中。
    3. 向聚合物溶液中加入0.1 wt%的光引发剂2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMPA）。
    4. 将小瓶内的内容物在避光条件下进行行星速度混匀，确保充分混合。
      注意：聚合物溶液对光敏感，即使用铝箔覆盖，也会在45至60分钟后开始聚合。因此，混合后应尽快使用该聚合物溶液。
  2. 按照旋涂曲线，在显微镜载玻片或硅片等载体基底上，将第1.1节制备的聚合物溶液旋涂成厚度为5至50 µm的薄膜图2对于30 µm的薄膜厚度，在600 rpm下旋转30秒。
    注意：使用不同的SMP配方时，离心速度和时间可能因聚合物溶液的黏度而异。
  3. 将聚合物薄膜转移至 将载玻片基底在旋涂后立即转移至交联室。在365 nm紫外灯下光聚合60分钟，随后于120 °C真空烘箱中后固化24小时，以进一步完成转化。
  4. 将固化后的聚合物薄膜切割成用于DMA测试的矩形样品，宽度为4.5 mm，长度为50 mm。厚度可在5至50 µm之间变化。样品可通过两种不同方法装入测量装置（选择步骤1.4.1或1.4.2）。
    1. 使用CO₂激光切割机将固化后的聚合物薄膜切割成矩形2 激光。设置CO₂2 激光微加工参数设置为5.0%功率（2.0 W）和10.0%速度（0.254 m/s）（图3A).
    2. 在十万级洁净室设施中，使用光刻技术定义DMA样品图3B）。在洁净室中，使用玻璃或晶圆基底上的SMP作为起始基底。
      1. 沉积低温氮化硅作为后续等离子体刻蚀工艺的硬掩模。采用标准光刻技术对器件轮廓/形状进行图形化。使用含SF的等离子体刻蚀机6 和 O2 等离子体分别用于去除硬掩模和SMP层。
      2. 在SMP层被等离子体刻蚀至玻璃载片/晶圆后，将剩余的氮化硅硬掩模在稀释的10:1氢氟酸溶液中浸洗去除。
  5. 将测试装置浸入去离子水中，作为最后一步，使其从玻璃载片/晶圆上剥离。

2. 仪器设置

  1. 使用配备浸没系统的动态机械分析仪（DMA），并以拉伸模式安装浸没夹具（图1）。将液氮连接至仪器，并启用液氮/空气作为炉体的气体源。
  2. 使用仪器软件编写干态测量方法，包括以下三个步骤：预调节、振荡温度扫描和测试结束时的调节，然后按如下方式设置参数：
    1. 设置预调节选项的以下参数：模式 = 活跃，选择“拉伸”，轴向力 = 0.05 N，初始值设为“开启”，灵敏度 = 0.0 N，比例力模式 = 力跟踪，模量补偿 = 开启，选择“轴向力”并将动态力设为25.0%，最小轴向力 = 0.05 N，程序设定的延伸低于0.0 Pa，模式启用，应变调节 = 0.05%，最小应变 = 0.1%，最大应变 = 0.5%，最小力 = 0.05 N，最大力 = 0.2 N。
    2. 设置振荡温度扫描的以下参数：起始温度 = 10 °C，继承设定点 = 关闭，浸泡时间 = 0.0 s，等待温度 = 开启，升温速率 = 2.0 °C/min，终止温度 = 100 °C，升温后浸泡时间 = 0.0 s，采样速率 = 1 pts/s，应变% = 0.275%，单点，频率 = 1 Hz。
    3. 设置测试结束时调节的以下参数：环境控制 = 关闭，轴向力调节 = 开启，模式禁用，传感器/电机 = 关闭。
  3. 使用仪器软件编写浸没测试方法，包括以下四个步骤：预调节、振荡-时间扫描、振荡-温度扫描和测试结束时的调节，然后按如下方式设置参数：
    1. 设置预调节选项的以下参数：模式 = 活跃，选择“拉伸”，轴向力 = 0.05 N，初始值设为“开启”，灵敏度 = 0.0 N，比例力模式 = 力跟踪，模量补偿 = 开启，选择“轴向力”并将动态力设为25.0%，最小轴向力 = 0.05 N，程序设定的延伸低于0.0 Pa，模式启用，应变调节 = 0.05%，最小应变 = 0.1%，最大应变 = 0.5%，最小力 = 0.05 N，最大力 = 0.2 N。
    2. 设置振荡-时间扫描的以下参数：温度 = 39.5 °C，继承设定点 = 关闭，浸泡时间 = 0.0 s，等待温度 = 关闭，持续时间 = 3600.0 s，采样速率 = 1 pts/s，应变% = 0.275%，单点，频率 = 1 Hz。
    3. 设置振荡-温度扫描的以下参数：起始温度 = 10 °C，继承设定点 = 关闭，浸泡时间 = 300.0 s，等待温度 = 关闭，升温速率 = 2.0 °C/min，终止温度 = 85 °C，升温后浸泡时间 = 300.0 s，采样速率 = 1 pts/s，应变% = 0.275%，单点，频率 = 1 Hz。
    4. 设置测试结束时调节的以下参数：环境控制 = 关闭，轴向力调节 = 开启，模式禁用，传感器/电机 = 关闭。

3. 干燥测量的样品装载与卸载 用于干燥测量

  1. 使用精度为 0.001 mm 的千分尺测量聚合物样品在干燥（空气中）测试时的实际厚度。
  2. 在软件中输入样品名称、描述和样品几何参数。
  3. 将加载间距设置为 15 mm，并装入样品。确保在用手拧紧夹具或使用 0.1 N 扭矩扳手之前，样品已居中并对齐（图 3C）。
  4. 关闭炉体，并按照第 2.2 节所述方法开始测量。
  5. 等待测量完成。打开炉体，从仪器中取出聚合物样品。

4. 浸泡测试的样品加载与卸载

  1. 使用精度为 0.001 mm 的游标卡尺测量用于 PBS 浸泡测试的聚合物试样的实际厚度。
  2. 在软件中输入样品名称、描述和样品几何参数。
  3. 将浸泡烧杯用夹具固定在上夹持端，完成装置准备（图 4A、B）。
  4. 设置加载间距为 15 mm，并安装样品（图 4C）。在用手拧紧夹具或使用 0.1 N 扭矩扳手之前，确保试样居中并对齐（图 5）。
  5. 将浸泡浴槽安装在底部夹具上并拧紧（图 4D）。用室温 PBS 填充浴槽（图 4E），盖上盖子（图 4F），关闭炉体（图 4G），并立即按照 2.3 节所述方法开始测量。确保排水阀处于关闭状态（图 4H）。
  6. 等待测量结束后，通过排水口排出浸泡浴槽中的 PBS。打开炉体，取下烧杯盖子，松开浸泡烧杯，将其提起，并从设备中取出聚合物样品。
  7. 用去离子水清洗夹具和浸泡烧杯，以去除残留的 PBS 盐分。

5. 测量

  1. 在无浸没烧杯的情况下，在空气中测量聚合物。按照第3节所述的样品装载和卸载步骤进行操作。至少重复测量3次，以获得具有统计学意义的结果。
  2. 按照第4节所述步骤，在浸没浴内测量聚合物。至少重复测量3次，以获得具有统计学意义的结果。

6. 数据解读

  1. 在仪器软件中打开结果选项卡，原始数据可在此以表格形式查看，或绘制为图表。
  2. 将浸没测量的第一部分——即振荡-时间测量——绘制成储能模量随时间变化的曲线，以评估软化动力学。该曲线显示聚合物在磷酸盐缓冲液（PBS）中浸没时模量随时间下降的速度。
  3. 记录模量趋于平稳的时间点，该时间代表聚合物在生理条件下的软化完成时间。
  4. 若聚合物在设定的1小时浸没时间后仍未完全软化，应延长浸没时间并重复测量。
  5. 将空气中和PBS中的振荡-温度扫描测量结果绘制成曲线，左侧纵轴为储能模量，右侧纵轴为tan delta，横轴为温度，以展示聚合物在塑化前（干燥状态）和塑化后（在PBS中）的热机械性能。
  6. 将干燥（空气中）和PBS中测量的数据绘制在同一图中，以便更清晰地展示塑化引起的热机械性能变化。
  7. 记录干燥材料在25 °C时的储能模量以及浸没样品在37 °C时的储能模量，这两个数值对于评估聚合物在植入过程中软化的程度具有重要意义。
  8. 注意干燥样品与浸没样品之间tan delta峰的变化。
  9. 将数据导出为.txt或.csv文件，以便使用其他软件进行进一步的数据分析和绘图。

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结果

使用环境 DMA 可以分析聚合物的软化动力学及其整体软化能力。通过本方案的温度-时间测量模式，可相互比较不同聚合物配方的软化曲线（图6）。该方法还可用于量化聚合物的软化和溶胀速率。从图4可以看出，在37 °C PBS 中浸泡时，不同聚合物配方可能经历不同程度的软化。非软化型聚合物模量保持在 GPa 范围，而半软化型聚合物从 1700 MPa 软化至 370 MPa，完全软化型聚合物则软化至 40 MPa。这三种聚合物配方的软化过程均在 10 至 15 分钟内完成。

结合干态动态机械分析（DMA）测量与磷酸盐缓冲液（PBS）中的测量，可评估不同聚合物配方的水致增塑效应，该效应表现为玻璃化转变温度的降低 Tg 以及模量曲线的整体下移（图7）...

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讨论

使用环境DMA可研究用作神经植入物基底的各种聚合物的行为19 或在溶液中模拟其他生物医学装置 体内 条件。这包括但不限于聚酰亚胺、聚对二甲苯-C、PDMS 和 SU-8。该方法也可用于研究水凝胶和细胞外基质（ECM）材料。不同溶液（包括水、重水和 PBS）中聚合物的整体软化程度及其软化动力学差异均可轻松比较。此外，还可测试不同浸没温度的影响，或由聚合物厚度和组成差异引起的变化。

该方法还可用于研究各种处理对聚合物和水凝胶软化行为的影响。处理方式包括应用不同的灭菌方法、在不同介质中进行加速老化以及表面改性。这种体外方法将帮助研究人员了解这些材料的行为特性和耐久性，获得可靠的体外测量数据，并避免不必要的动物实验。然而，在磷酸盐缓冲液（PBS）中测量仅是模拟生物环境的一种方法。体内环境在许多方面可能存在差异，例如离子浓度以及生物介质/组织中抗体、蛋白质和其他物质的可及性。根据目标应用部位，实验人员还可考虑使用不同的介质进行环境测量，例如三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS）...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者感谢 Taylor Ware 博士允许我们使用他的环境 DMA。

本研究由国防健康事务助理部长办公室通过同行评审医学研究项目资助 [W81XWH-15-1-0607]。观点、解释、结论和建议均为作者意见，不一定代表美国国防部的认可。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,3,5-三烯丙基-1,3,5-三嗪-2,4,6(1H,3H,5H)-三酮（TATATO）Sigma-Aldrich114235-100G
2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMPA）Sigma-Aldrich196118-50G
CO2 激光器 Gravograph LS100Gravotech, Inc.
康宁大型玻璃显微镜载玻片，75 × 50 mmTed Pella26005
环境 DMA：RSA-G2 固体分析仪TA Instruments
防静电塑料镊子，尖端类型：平头鸭嘴型，11.5 cmCole PalmerEW-07387-17
Laurell WS-650-8B 旋涂仪Laurell Technologies Corporation
液氮Air gas
PBS，1× 溶液，Fisher BioReagentsFisher ScientificBP243820
SHEL LAB 真空烘箱VWR International89409-484
硅晶圆University Wafer机械级
RSA-G2 浸入系统TA Instruments
三羟甲基丙烷三(3-巯基丙酸酯)（TMTMP）Sigma-Aldrich381489-100ML
UVP CL-1000 交联室，配备 365 nm 灯管VWR International21474-598

参考文献

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