我们提出了一种用于确定从考拉毛发中提取皮质醇最佳溶剂的实验方案。本方案中使用的溶剂包括甲醇、乙醇和异丙醇。确定最佳提取溶剂将有助于可靠地测量毛发中的皮质醇水平，从而评估慢性应激对考拉的影响。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
针对不同样本类型，用于测量动物应激水平的激素提取最佳方法并不总是相同。澳大利亚标志性的有袋类物种考拉（Phascolarctos cinereus）长期暴露于人为因素引起的应激源中，因此迫切需要对野生种群的慢性应激状况进行评估。测量慢性应激最有效的方法之一是分析毛发或皮毛中的糖皮质激素皮质醇，因为该激素参与调节生理和行为反应。本实验室验证研究旨在检验现有技术，以验证一种适用于考拉皮毛中皮质醇非侵入性检测的最优激素提取方法。目前公认，相较于传统的侵入性技术，非侵入性技术在实践操作和伦理层面更具优势，因而更受青睐。此外，获取考拉皮毛样本比获取其血液样本更为简便。本研究使用来自阿德莱德考拉与野生动物医院的考拉皮毛样本，开展多种激素提取技术实验，以期验证最优的皮质醇提取方法。结果表明，基于平行性实验结果，100%甲醇相较于100%乙醇或100%异丙醇，提供了最优的溶剂提取效果。综上所述，该考拉皮毛中皮质醇提取方法提供了一种可靠的非侵入性检测手段，可用于考拉慢性应激的研究。
引言
澳大利亚生态系统通过提供食物和纤维等多种动态相互作用，维持着人类的生存1。具有讽刺意味的是，人类活动却成为导致生态系统破坏的主要驱动力，其途径是改变生物多样性2。生境破碎化，即把大片连续的生境分割成彼此隔离的小块土地的过程，是威胁澳大利亚生态系统最主要的由人类引起的大规模生物多样性变化2。生境破碎化会改变特定区域内物种组成的结构和多样性，从而减少物种维持可存活种群所需的栖息地面积2。其结果是物种之间对食物、燃料、纤维和水等资源的竞争加剧3。由于生物多样性的改变而导致的澳大利亚生态系统破坏，已对许多澳大利亚本土物种造成了灾难性的影响1。
考拉（Phascolarctos cinereus）是澳大利亚最具代表性的有袋类物种，其生存依赖于澳大利亚生态系统的健康状况4。欧洲殖民者的到来导致考拉种群数量迅速下降，当时为了获取毛皮并从中牟利，大量考拉被猎杀，形成了大规模的出口贸易5。这一行为在20世纪80年代被禁止，此后考拉种群数量才得以稳定5。然而，人类人口的指数级增长使得该物种的栖息地大幅减少，其生存再次面临威胁6。根据国际自然保护联盟（IUCN）的评估，所有澳大利亚考拉种群均被列为易受灭绝威胁的物种，且种群数量呈下降趋势7。这一评估结果源于对该物种相关种群参数的不确定性以及种群趋势存在显著差异7。作为最具代表性且仅分布于澳大利亚的特有动物，考拉通过旅游业为澳大利亚经济带来显著收益（NSW Office of Environment and Heritage 2018）。据估计，与考拉相关的旅游业创造了约9,000个就业岗位，每年为经济贡献11亿至25亿美元（NSW Office of Environment and Heritage 2018）。任何一个物种的消失都可能带来灾难性后果，这一点已体现在澳大利亚本土野生动物数量的持续下降中6。此外，如果澳大利亚考拉种群继续以当前速度减少，澳大利亚经济也将受到深远影响6。
已有研究表明，栖息地破碎化导致的死亡与疾病发生率升高是慢性应激的结果8。目前，由于栖息地破碎化，澳大利亚已有24种有袋类动物被宣布灭绝，而考拉也正呈现类似趋势8。栖息地破碎化与生物系统的复杂性具有协同效应，但可通过对应激反应的分析加以解析6。通常情况下，动物自然环境中的任何干扰都会激活一系列复杂的神经内分泌事件，即所谓的“战斗或逃跑”反应9,10。这种应激反应起始于大脑，下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴被激活11。大脑中一个称为下丘脑的区域释放促肾上腺皮质激素释放激素（CRH），进而促使垂体前叶释放促肾上腺皮质激素（ACTH）11。后者继而刺激肾上腺髓质分泌糖皮质激素。糖皮质激素通过血液在体内循环，促使葡萄糖不再以糖原形式储存，并将储存的糖原动员转化为葡萄糖11。这一系列神经内分泌事件是动物应对不可预测刺激的反应机制11。然而，当糖皮质激素持续释放并长期处于高水平时，动物即被认为处于慢性应激状态12,13。该过程涉及将能量从其他生理功能中转移，以维持持续的糖皮质激素生成13。因此，慢性应激可能抑制生长、繁殖和免疫功能，而这些均为生存所必需的关键适应性特征14。
测量动物的糖皮质激素生成是判断其是否处于生理应激状态的常用指标15。为此，糖皮质激素可在血液血浆、血清、唾液、尿液或粪便中进行测定16。然而，有证据表明，与上述样本相比，毛发是反映慢性应激更为有效的指标16。这是因为毛发在生长期被认为会整合血液中的激素；其成分相对稳定；且毛发中检测到的皮质醇反映了毛发生长期间所经历的生理应激，这一时间段可长达数周至数月16。此外，皮质醇的采集应尽可能无创，以最大限度减少因捕捉和操作带来的应激16。然而，此类操作过程中产生的应激不会影响毛发中的糖皮质激素水平16。已有大量研究探讨了利用毛发测量多种动物长期应激的有效性，其中包括驯鹿、灰熊、恒河猴、麝牛和棕熊的研究17,18,19,20,21。毛发皮质醇的提取通常首先通过清洗样本，以确保不会将沉积在毛发表面的汗液和皮脂来源的皮质醇一同提取出来，随后使用珠磨仪将样本粉碎22。清洗后，样本需干燥以确保溶剂完全蒸发22。最后，使用溶剂对样本进行提取并重新溶解，以便进行皮质醇测定22。从毛发中提取皮质醇最常用的溶剂是甲醇21,23；但也有部分研究在其皮质醇提取过程中使用乙醇或异丙醇。例如，有研究成功使用乙醇从人羊水样本中提取皮质醇24。此外，有研究证实异丙醇可有效从人毛发和指甲中提取皮质醇25,26。基于此，本研究测试了三种溶剂（甲醇、乙醇和异丙醇），以确定哪一种对考拉毛发样本中皮质醇的提取效果最佳。
本研究的主要目的是利用现有技术验证一种从考拉毛发中非侵入性提取皮质醇的最佳激素提取方法。为此，我们测试了三种提取溶剂（甲醇、乙醇和异丙醇）。我们假设甲醇是提取考拉毛发中皮质醇的最佳溶剂，因为Arbor Assay皮质醇检测试剂盒推荐使用甲醇作为提取溶剂27。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本项目严格遵循动物和人类护理指南进行。动物伦理许可由西悉尼大学批准（A12373）。此外，实验室风险评估以及生物安全与辐射申请表已提交并获西悉尼大学批准，以确保本研究的安全实施（B12366）。
注意：本项目所用的考拉毛发样本来自位于澳大利亚南澳大利亚州普林普顿安扎克公路282号的阿德莱德考拉与野生动物医院。毛发取自一只因严重受伤被收治后实施安乐死的考拉。该考拉死亡后不久即被装入尸袋并存放在冷冻柜中。取出尸袋中的考拉尸体后，使用标准动物剪毛器从其颈背部剃下1.2 g毛发。剃毛时尽可能贴近皮肤，以确保不损伤皮肤。剃毛完成后，将考拉尸体重新放回尸袋并送回冷冻柜。毛发则被置于铝箔袋中，并在低于-20 °C的条件下保存。运输过程中，毛发保持在环境温度下；抵达实验室后，毛发被储存于-80 °C环境中。
1. 考拉毛发皮质醇提取
- 从 -80 °C 的储存环境中取出毛发，静置使其充分解冻。
- 使用实验室分析天平称量毛发。
- 将 60 mg 毛发放入已预先称重并标记的 1.5 mL 离心管中，重复操作直至装满 18 支离心管。
注意：本验证研究使用了 18 份毛发亚样品。 - 使用移液器向每支离心管中加入 1 mL 100% 高效液相色谱（HPLC）级异丙醇。
- 涡旋振荡样品 30 秒。
- 使用 0.5 mm 微型精密筛网过滤每份样品，以实现液体与毛发的分离。
- 将滤液弃入废液容器中。
- 将每份毛发样品转移至已标记的塑料称量舟中，然后放入真空干燥器中，干燥 3 天。
- 待样品完全干燥后，将每份样品转移至已标记的 1.5 mL 微量离心管中。
- 将每份样品放入珠磨机中，加入 3 颗铬钢珠（3.2 mm），以每秒 30 次震动频率研磨 2 分钟。
- 使用移液器将第一种提取方法所用试剂（100% 分析纯乙醇）1.5 mL 加入含毛发样品的 6 支 1.5 mL 微量离心管中。
- 对 100% 分析纯甲醇和 100% 分析纯异丙醇进行相同操作，直至共装满十八支 1.5 mL 微量离心管。
- 盖紧每支 1.5 mL 微量离心管，于室温（RT）在摇床上以持续脉冲振荡方式孵育 3 小时。
- 取出样品，使用 0.5 mm 微型精密筛网进行过滤。
- 使用移液器将滤液转移至新的、已标记的 1.5 mL 微量离心管中，同时确保毛发残渣被妥善弃置。
- 在通风橱中，用氮气（N2）气流将溶剂提取物完全吹干。
- 用 400 µL 检测缓冲液（成分见商用皮质醇检测试剂盒；参见 材料表）和 100 µL 100% 分析纯乙醇重新溶解干燥的样品提取物。
注意：样品提取物可于 -80 °C 保存。
2. 内参对照
- 为了制备对照，需制备一个激素水平较高的提取样本混合液。为此，选择已知暴露于应激源的动物样本进行混合。例如，选择从环境创伤中被救助的考拉样本，因为这些样本通常表现出较高的皮质醇激素水平6。
- 制备提取混合液时，从每个样本（n = 10）中各取 20 µL 提取物，直至总体积达到 200 µL。该提取混合液可保存在 -80 °C，直至进行检测。在每次检测中将该混合液作为低值或高值内部对照使用（见步骤 2.2）。
- 在检测中，使用该混合液制备低值和高值对照品，使其结合率分别为 70%（C1）和 30%（C2）。根据提取物与皮质醇标准品的平行性曲线图（图 1），确定 30% 和 70% 结合点的稀释倍数。使用检测缓冲液对样本混合液进行稀释。例如，取 60 µL 混合提取液与 60 µL 检测缓冲液混合，得到 1:2 稀释液。
注：对于甲醇提取物，30% 结合点对应原液（未稀释），而 70% 结合点约为 1:2 稀释，如 图 1 所示。因此，这些稀释比例可作为检测中内部对照（分别为 C1 和 C2）的稀释因子。
3. 考拉毛发提取物中皮质醇的分析
- 使用市售皮质醇检测试剂盒（材料表），按照供应商说明设置96孔条板，包括样本、对照、皮质醇标准品、非特异性结合孔和最大结合孔。使用试剂盒手册中提供的板布局表，列出样本、对照和标准品在板图上的位置。
注意：建议所有样本、对照和标准品均设复孔，以确保结果的准确性。 - 准备样本。按照毛发激素提取步骤（第1节）操作，获得100%甲醇提取的考拉毛发样本。
- 配制试剂。根据市售皮质醇检测试剂盒中的说明，配制以下试剂：(1) 检测缓冲液，(2) 洗涤缓冲液，以及 (3) 标准品（成分见皮质醇检测试剂盒，材料表）。
- 根据皮质醇检测试剂盒说明书，向各孔中加入50 µL样本或标准品。向非特异性结合（NSB）孔中加入75 µL检测缓冲液，向最大结合（B0或零标准）孔中加入50 µL检测缓冲液。
- 使用重复加样器向每孔加入25 µL皮质醇偶联物。除NSB孔外，向其余各孔加入25 µL皮质醇抗体。轻轻敲击板壁，确保试剂充分混匀。
- 用板封膜覆盖板孔，置于轨道摇床上，室温（低速）振荡孵育1小时。
- 移除板封膜，用洗板机或手动操作，每孔加入300 µL洗涤缓冲液，洗涤4次，吸去孔内液体。
- 将板置于洁净的吸水纸上轻拍，使孔内残留液体被吸干。
- 向每孔加入100 µL四甲基联苯胺（TMB）底物（成分见皮质醇检测试剂盒，材料表）。
- 盖上板封膜，于室温避光孵育30分钟。
- 向每孔加入50 µL终止液。
- 将板放入可读取450 nm吸光度的酶标仪中进行检测。
- 计算最终激素浓度时，将测得的激素浓度（pg/mL）乘以最终提取体积（0.5 mL），再除以毛发样本质量（60 mg），得到最终毛发皮质醇浓度（ng/mg样本）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
通过平行性分析确定目标激素代谢物的检测。利用平行性曲线，50%结合点还可确定在标准曲线上的样品稀释倍数（图1）。如平行性图所示（图1），100%乙醇和100%异丙醇提取物与皮质醇标准品之间未呈现平行性位移。然而，100%甲醇提取物与皮质醇标准品之间表现出良好的平行性位移。干燥后的提取物直接用分析缓冲液稀释后进行检测（100 µL 100%乙醇加400 µL分析缓冲液）。
在所有检测中，使用高结合率（约70%）和低结合率（约30%）的样品提取物测定批内和批间变异系数（CV）。根据平行性曲线图（图1），30%（低结合）内参对照为纯的考拉提取物混合液，而70%（高结合）内参对照为1:2稀释的考拉提取物混合液。高值和低值内参对照的变异系数（CV%）为 <15%.
通过使用质量控制方法，包括批内和批间变异系数，可确定该检测的误差范围，其应为 <15%。检测灵敏度定义为零结合对照样本响应值的平均值加2个标准差，表示为81.26...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
已有许多研究采用多种技术来检测哺乳动物毛发中的皮质醇。本研究展示了从一只暴露于当前人为压力下的野生考拉所采集毛发中检测皮质醇的结果。这项开创性研究利用毛发，比较了三种常用溶剂中哪一种最适合从考拉毛发中提取作为慢性压力指标的皮质醇。结果表明，100%甲醇是此类哺乳动物毛发中皮质醇提取的推荐溶剂。
乙醇、甲醇和异丙醇均为通过氢分子键合的伯醇，常用于激素提取实验中的溶剂28。通常情况下，极性物质最易溶于其他极性物质，而非极性物质则最易溶于其他非极性物质。含有甲醇的醇基具有很强的极性，而含有异丙醇的醇基则具有很强的非极性。由于其分子结构特点，含有乙醇的醇基兼具极性和非极性溶剂的特性。皮质醇等类固醇激素被认为是非极性物质，这意味着皮质醇应与极性溶剂具有较强的结合能力。
为了更全面地分析用于评估考拉毛发生理应激的提取溶剂，未来的研究项目应按照文中所述顺序采用相同的方法。 图3类似的研究通常在研磨前进行洗涤步骤22
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由西悉尼大学科学与健康学院为Edward Narayan提供的启动研究经费资助。作者感谢Jack Nakhoul在样品处理方面的协助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 离心管 | n/a | n/a | 1.5 mL |
| 铬钢珠 | n/a | n/a | 3.2 mm x 3 |
| 皮质醇检测试剂盒 | Arbor Assays | K003-H1W | 美国密歇根州生产 |
| DetectX 皮质醇酶免疫检测试剂盒 | Arbor Assays | K003-H5 | 首次用于考拉毛发皮质醇检测 |
| 乙醇 | n/a | n/a | HPLC 级 |
| 异丙醇 | n/a | n/a | HPLC 级 |
| 甲醇 | n/a | n/a | HPLC 级 |
| 微量移液器 | n/a | n/a | n/a |
| 微型精密筛 | n/a | n/a | 0.5 mm |
| 酶标仪 | Bio Radi | n/a | n/a |
| 洗板机 | Bio Radi | n/a | n/a |
| 轨道摇床 | Bio Line | n/a | n/a |
| 塑料称量舟 | n/a | n/a | n/a |
| 酶标板封板膜 | n/a | n/a | n/a |
| 精密天平 | n/a | n/a | n/a |
| 涡旋混合器 | Eppendorf | n/a | n/a |
参考文献
- Sandhu, H. S., Crossman, N. D., Smith, F. P. Ecosystem services and Australian agricultural enterprises. Ecological Economics. 74, 19-26 (2012).
- Martinez-Ramos, M., Ortiz-Rodriguez, I. A., Pinero, D., Dirzo, R., Sarukhan, J. Anthropogenic disturbances jeopardize biodiversity conservation within tropical rainforest reserves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5323-5328 (2016).
- Aukema, J. E., Pricope, N. G., Husak, G. J., Lopez-Carr, D. Biodiversity Areas under Threat: Overlap of Climate Change and Population Pressures on the World's Biodiversity Priorities. PLoS ONE. 12 (1), 0170615(2017).
- MacDougall, A. S., McCann, K. S., Gellner, G., Turkington, R. Diversity loss with persistent human disturbance increases vulnerability to ecosystem collapse. Nature. 494 (7435), 86-89 (2013).
- Hrdina, F., Gordon, G. The Koala and Possum Trade in Queensland, 1906-1936. Australian Zoologist. 32 (4), 543-585 (2004).
- Narayan, E. J., Williams, M. Understanding the dynamics of physiological impacts of environmental stressors on Australian marsupials, focus on the koala (Phascolarctos cinereus). BMC Zoology. 1 (1), (2016).
- Woinarski, J., Burbidge, A. Phascolarctos cinereus. The IUCN Red List of Threatened Species 2016. , (2016).
- Gonzalez-Astudillo, V., Allavena, R., McKinnon, A., Larkin, R., Henning, J. Decline causes of Koalas in South East Queensland, Australia: a 17-year retrospective study of mortality and morbidity. Scientific Reports. 7, 42587(2017).
- Hing, S., Narayan, E. J., Thompson, R. C. A., Godfrey, S. S. The relationship between physiological stress and wildlife disease: consequences for health and conservation. Wildlife Research. 43 (1), 51-60 (2016).
- Whirledge, S., Cidlowski, J. Glucocorticoids, stree, and fertility. Minerva Endocrinologica. 35 (2), 109(2010).
- Romero, L. M. Physiological stress in ecology: lessons from biomedical research. Trends in Ecology & Evolution. 19 (5), 249-255 (2004).
- McEwen, B. S., Wingfield, J. C. What is in a name? Integrating homeostasis, allostasis and stress. Hormones and Behavior. 57 (2), 105-111 (2010).
- Wingfield, J. C. The comparative biology of environmental stress: behavioural endocrinology and in ability to cope with novel, changing environments. Animal Behaviour. 85 (5), 1127-1133 (2013).
- Chrousos, G. P. Stress and disorders of the stress system. Nature Reviews Endocrinology. 5 (1), 374-381 (2009).
- Narayan, E. J., Webster, K., Nicolson, V., Mucci, A., Hero, J. M. Non-invasive evaluation of physiological stress in an iconic Australian marsupial: the Koala (Phascolarctos cinereus). General and Comparative Endocrinology. 187, 39-47 (2013).
- Mastromonaco, G. F., Gunn, K., McCurdy-Adams, H., Edwards, D. B., Schulte-Hostedde, A. I. Validation and use of hair cortisol as a measure of chronic stress in eastern chipmunks (Tamias striatus). Conservation Physiology. 2 (1), 055(2014).
- Ashley, N. T., et al. Glucocorticosteroid concentrations in feces and hair of captive caribou and reindeer following adrenocorticotropic hormone challenge. General and Comparative Endocrinology. 172 (3), 382-391 (2011).
- Macbeth, B. J., Cattet, M. R. L., Stenhouse, G. B., Gibeau, M. L., Janz, D. M. Hair cortisol concentration as a noninvasive measure of long-term stress in free-ranging grizzly bears (Ursus arctos): considerations with implications for other wildlife. Canadian Journal of Zoology. 88 (10), 935-949 (2010).
- Dettmer, A. M., Novak, M. A., Suomi, S. J., Meyer, J. S. Physiological and behavioral adaptation to relocation stress in differentially reared rhesus monkeys: hair cortisol as a biomarker for anxiety-related responses. Psychoneuroendocrinology. 37 (2), 191-199 (2012).
- Di Francesco, J., et al. Qiviut cortisol in muskoxen as a potential tool for informing conservation strategies. Conservation Physiology. 5 (1), 052(2017).
- Cattet, M., et al. Quantifying long-term stress in brown bears with the hair cortisol concentration: a biomarker that may be confounded by rapid changes in response to capture and handling. Conservation Physiology. 2 (1), 026(2014).
- Meyer, J., Novak, M., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882(2014).
- Carlitz, E. H., et al. Measuring Hair Cortisol Concentrations to Assess the Effect of Anthropogenic Impacts on Wild Chimpanzees (Pan troglodytes). PLoS ONE. 11 (4), 0151870(2016).
- Aderjan, R., Rauh, W., Vecsei, P., Lorenz, U., Ruttgers, H. Determination of cortisol, tetrahydrocortisol, tetrahydrocortisone, corticosterone, and aldosterone in human amniotic fluid. Journal of Steroid Biochemistry. 8 (1), 525-528 (1977).
- Nejad, J. G., Ghaseminezhad, M. A Cortisol Study; Facial Hair and Nails. Journal of Steroids & Hormonal Science. 7 (2), 177(2016).
- Palme, R., Touma, C., Arias, N., Dominchin, M., Lepschy, M. Steroid extraction: get the best out of faecal samples. Veterinary Medicine Australia. 7 (2), 1-5 (2013).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147 (3), 255-261 (2006).
- Kanse, K. S., Joshi, Y. S., Kumbharkhane, A. C. Molecular interaction study of ethanol in non-polar solute using hydrogen-bonded model. Physics and Chemistry of Liquids. 52 (6), 710-716 (2014).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
