考拉（Phascolarctos cinereus）毛发中皮质醇的测定

摘要

我们提出了一种用于确定从考拉毛发中提取皮质醇最佳溶剂的实验方案。本方案中使用的溶剂包括甲醇、乙醇和异丙醇。确定最佳提取溶剂将有助于可靠地测量毛发中的皮质醇水平，从而评估慢性应激对考拉的影响。

摘要

针对不同样本类型，用于测量动物应激水平的激素提取最佳方法并不总是相同。澳大利亚标志性的有袋类物种考拉（Phascolarctos cinereus）长期暴露于人为因素引起的应激源中，因此迫切需要对野生种群的慢性应激状况进行评估。测量慢性应激最有效的方法之一是分析毛发或皮毛中的糖皮质激素皮质醇，因为该激素参与调节生理和行为反应。本实验室验证研究旨在检验现有技术，以验证一种适用于考拉皮毛中皮质醇非侵入性检测的最优激素提取方法。目前公认，相较于传统的侵入性技术，非侵入性技术在实践操作和伦理层面更具优势，因而更受青睐。此外，获取考拉皮毛样本比获取其血液样本更为简便。本研究使用来自阿德莱德考拉与野生动物医院的考拉皮毛样本，开展多种激素提取技术实验，以期验证最优的皮质醇提取方法。结果表明，基于平行性实验结果，100%甲醇相较于100%乙醇或100%异丙醇，提供了最优的溶剂提取效果。综上所述，该考拉皮毛中皮质醇提取方法提供了一种可靠的非侵入性检测手段，可用于考拉慢性应激的研究。

引言

澳大利亚生态系统通过提供食物和纤维等多种动态相互作用，维持着人类的生存¹。具有讽刺意味的是，人类活动却成为导致生态系统破坏的主要驱动力，其途径是改变生物多样性²。生境破碎化，即把大片连续的生境分割成彼此隔离的小块土地的过程，是威胁澳大利亚生态系统最主要的由人类引起的大规模生物多样性变化²。生境破碎化会改变特定区域内物种组成的结构和多样性，从而减少物种维持可存活种群所需的栖息地面积²。其结果是物种之间对食物、燃料、纤维和水等资源的竞争加剧³。由于生物多样性的改变而导致的澳大利亚生态系统破坏，已对许多澳大利亚本土物种造成了灾难性的影响¹。

考拉（Phascolarctos cinereus）是澳大利亚最具代表性的有袋类物种，其生存依赖于澳大利亚生态系统的健康状况⁴。欧洲殖民者的到来导致考拉种群数量迅速下降，当时为了获取毛皮并从中牟利，大量考拉被猎杀，形成了大规模的出口贸易⁵。这一行为在20世纪80年代被禁止，此后考拉种群数量才得以稳定⁵。....

方案

本项目严格遵循动物和人类护理指南进行。动物伦理许可由西悉尼大学批准（A12373）。此外，实验室风险评估以及生物安全与辐射申请表已提交并获西悉尼大学批准，以确保本研究的安全实施（B12366）。

注意：本项目所用的考拉毛发样本来自位于澳大利亚南澳大利亚州普林普顿安扎克公路282号的阿德莱德考拉与野生动物医院。毛发取自一只因严重受伤被收治后实施安乐死的考拉。该考拉死亡后不久即被装入尸袋并存放在冷冻柜中。取出尸袋中的考拉尸体后，使用标准动物剪毛器从其颈背部剃下1.2 g毛发。剃毛时尽可能贴近皮肤，以确保不损伤皮肤。剃毛完成后，将考拉尸体重新放回尸袋并送回冷冻柜。毛发则被置于铝箔袋中，并在低于-20 °C的条件下保存。运输过程中，毛发保持在环境温度下；抵达实验室后，毛发被储存于-80 °C环境中。

1. 考拉毛发皮质醇提取

1. 从 -80 °C 的储存环境中取出毛发，静置使其充分解冻。
2. 使用实验室分析天平称量毛发。
3. 将 60 mg 毛发放入已预先称重并标记的 1.5 mL 离心管中，重复操作直至装满 18 支离心管。
   注意：本验证研究使用了 18 份毛发亚样品。
4. 使用移液器向每支离心管中加入 1 mL 100% 高效液相色谱（HPLC）级异丙醇。
5. 涡旋振荡样品 30 秒。
6. 使用 0.5 mm 微....

结果

通过平行性分析确定目标激素代谢物的检测。利用平行性曲线，50%结合点还可确定在标准曲线上的样品稀释倍数（图1）。如平行性图所示（图1），100%乙醇和100%异丙醇提取物与皮质醇标准品之间未呈现平行性位移。然而，100%甲醇提取物与皮质醇标准品之间表现出良好的平行性位移。干燥后的提取物直接用分析缓冲液稀释后进行检测（100 µL 100%乙醇加400 µL分析缓冲液）。

在所有检测中，使用高结合率（约70%）和低结合率（约30%）的样品提取物测定批内和批间变异系数（CV）。根据平行性曲线图（图1），30%（低结合）内参对照为纯的考拉提取物混合液，而70%（高结合）内参对照为1:2稀释的考拉提取物混合液。高值和低值内参对照的变异系数（CV%）为 <15%.

通过使用质量控制方法，包括批内和批间变异系数，可确定该检测的误差范围，其应为 <15%。检测灵敏度定义为零结合对照样本响应值的平均值加2个标准差，表示为81.26.......

讨论

已有许多研究采用多种技术来检测哺乳动物毛发中的皮质醇。本研究展示了从一只暴露于当前人为压力下的野生考拉所采集毛发中检测皮质醇的结果。这项开创性研究利用毛发，比较了三种常用溶剂中哪一种最适合从考拉毛发中提取作为慢性压力指标的皮质醇。结果表明，100%甲醇是此类哺乳动物毛发中皮质醇提取的推荐溶剂。

乙醇、甲醇和异丙醇均为通过氢分子键合的伯醇，常用于激素提取实验中的溶剂²⁸。通常情况下，极性物质最易溶于其他极性物质，而非极性物质则最易溶于其他非极性物质。含有甲醇的醇基具有很强的极性，而含有异丙醇的醇基则具有很强的非极性。由于其分子结构特点，含有乙醇的醇基兼具极性和非极性溶剂的特性。皮质醇等类固醇激素被认为是非极性物质，这意味着皮质醇应与极性溶剂具有较强的结合能力。

为了更全面地分析用于评估考拉毛发生理应激的提取溶剂，未来的研究项目应按照文中所述顺序采用相同的方法。 图3类似的研究通常在研磨前进行洗涤步骤²²

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
离心管	n/a	n/a	1.5 mL
铬钢珠	n/a	n/a	3.2 mm x 3
皮质醇检测试剂盒	Arbor Assays	K003-H1W	美国密歇根州生产
DetectX 皮质醇酶免疫检测试剂盒	Arbor Assays	K003-H5	首次用于考拉毛发皮质醇检测
乙醇	n/a	n/a	HPLC 级
异丙醇	n/a	n/a	HPLC 级
甲醇	n/a	n/a	HPLC 级
微量移液器	n/a	n/a	n/a
微型精密筛	n/a	n/a	0.5 mm
酶标仪	Bio Radi	n/a	n/a
洗板机	Bio Radi	n/a	n/a
轨道摇床	Bio Line	n/a	n/a
塑料称量舟	n/a	n/a	n/a
酶标板封板膜	n/a	n/a	n/a
精密天平	n/a	n/a	n/a
涡旋混合器	Eppendorf	n/a	n/a