本方案描述了一种从儿童采集呼出气体样本的简单方法。简而言之，在进行气相色谱-质谱分析之前，先将混合空气样本在吸附管中进行预浓缩。利用该呼气采集方法，可鉴定感染性和非感染性疾病的呼气生物标志物。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
呼吸样本的采集与分析可用于发现多种传染性和非传染性疾病（如疟疾、结核病、肺癌和肝病）中的挥发性生物标志物。 本方案描述了一种可重复的儿童呼出气体采样方法，并对采集的样本进行稳定化处理，以便后续采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）进行分析。该方法的目标是建立一套标准化流程，用于采集4至15岁儿童的呼吸样本，以开展进一步的化学分析。首先，使用连接于双向阀门的纸板咬嘴进行呼气采样，阀门再连接至一个3 L的采气袋。随后，将呼吸中的分析物转移至热脱附管中，并在4–5 °C条件下保存直至分析。此前，该技术已成功用于采集患有疟疾儿童的呼出气体，并实现了呼吸生物标志物的有效识别。此后，我们已成功将该技术应用于其他儿科人群队列。该方法的优势在于对受试者的配合度要求极低（在儿科人群中尤为有利），采样时间短，无需专业培训人员操作，且可在资源有限的现场环境中使用便携式设备完成。
引言
生物标志物可提供有关正常和病理生理过程的宝贵信息，这些过程可能与临床可识别的疾病相关。近年来，人们对呼出气体中的挥发性物质作为多种疾病状态（包括感染、代谢紊乱和癌症）生物标志物的评估日益关注1。呼出气体中含有可定量的挥发性有机化合物（VOCs）、半挥发性有机化合物以及微生物来源的物质（例如来自细菌和病毒的核酸）。呼出气体分析的主要目标是无创地了解医学状况和/或环境暴露的情况。根据所关注的成分不同，存在多种收集和分析呼出气体的方法。目前尚无标准化的呼出气体采集方法，这使得不同研究之间的结果难以进行比较。标准化呼出气体采集流程至关重要，因为采样过程本身会对后续气体分析结果产生显著影响。
在许多研究中，采用晚期呼出气采样方法2,3。该方法通过舍弃呼出气的初始部分（"死腔"），优先采集呼吸周期末段的气体。该策略的优势在于可最大限度降低外源性挥发性有机化合物（如环境中的挥发性有机物）的水平，同时富集内源性、个体特异性的挥发性有机物。该方法在采集呼气样本前，会排除个体呼气的最初数秒钟气体。其他研究者则采用压力传感器，在呼气的预设阶段触发采样4,5。由于压力传感器需要复杂的工程设计，这种替代方法....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本研究已获得华盛顿大学医学院机构审查委员会批准（#201709030）。在纳入研究前，已从受试儿童的父母或法定监护人处获得知情同意。图片中 图2 在获得书面知情家长同意后进行复制。
1. 呼吸采样器组装
- 使用一次性手套，将纸板吹嘴连接到呼吸采样器上，如补充文件所示 图1将一段短的粗径管子连接到呼吸采样器的另一端，如图所示 补充图1每次使用新导管连接患者。
- 通过管路将呼吸连接器连接到球囊阀上。参见 图1 呼吸采样器与采样袋连接状态的照片。
- 逆时针旋转进液接头侧面的滚花拇指螺钉以解锁阀门 下压呼吸袋的阀杆，以打开进样接口进行采样。
- 通过顺时针旋转进液接头侧面的滚花拇指螺钉，将阀门锁定在打开状态。
- 确认呼吸采样器上的蓝色阀门已打开（与连接器平行）。
- 在聚合物袋的标签上填写患者编号、日期和时间。
- 按照各制造商推荐的程序对热脱附（TD）吸附管进行预处理。在呼气样本采集前，将热脱附管密封并置于4–5 °C保存，以尽量减少干扰物质的产生。
2. 呼吸样本采....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在本研究中，呼吸样本采集自圣路易斯儿童医院接受评估的10名儿童（8-17岁）。呼吸样本和环境空气样本（n = 10）的采集方法如上所述。样本采用气相色谱-四极杆飞行时间质谱法（GC-QToF-MS）结合热脱附技术进行分析，方法同前文所述9。在去除背景污染物后，所采用的实验方案在每份混合呼出气样本中平均检测到311种挥发性有机化合物（VOCs）。平均而言，呼吸样本中的VOCs数量显著高于环境/对照空气样本（311 ± 11.5 对比 190 ± 12.6， p < 0.0001）（图3A）。与环境空气相比，呼吸气体中VOCs数量的增加可通过代表性总离子流色谱图（TICs）的对比清晰识别（图3B）。
作为成功采集呼出气体的质量控制措施，将两种常见呼出.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
尽管过去十年中呼吸研究取得了显著进展，但呼吸气体挥发物的采样与分析仍缺乏标准化操作10。造成这种标准化缺失的一个主要原因是呼吸样本采集方法的多样性，这些方法直接影响任何特定呼出呼吸样本中所含化学物质的多样性。呼出气体中含有大量浓度差异显著的挥发性有机化合物6。因此，改变采集方法不仅会影响样本中化合物的丰度，还会影响其多样性。
呼出气体采样出人意料地复杂。尽管受试者仅需在分析前将气体呼入呼吸采集器的吹嘴或密闭容器中即可，但采样过程必须考虑并控制多种潜在变量。在本研究中，我们详细描述了一种针对儿童呼出气体采样的特定且经过验证的方案。我们此前已在资源有限的现场环境（马拉维）中，成功地将该方案应用于低至4岁的发热儿童，证明了我们的呼出气体采集与分析流程在生物标志物发现方面的可行性9。随后，我们还进一步在美国一家现代化儿科专科诊所中实施并评估了该方案在儿童呼吸样本采集中的应用。我们的结果表明，对于儿童呼吸生物标志物的发现，混合呼出气体的采集至关重要，.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢圣路易斯儿童医院参与本研究的儿童及其家庭。我们感谢 Stacy Postma 女士和 Janet Sokolich 女士在呼吸样本采集过程中所付出的特殊努力。本工作由圣路易斯儿童医院基金会资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 呼吸袋 | SKC | 237-03 | 这些是3升的袋子 |
| 纸板吹嘴 | A-M 系统 | 161902 | 0.86" OD，2.00" L |
| 大直径管 | Cole Parmer | 95802-11 | 硅胶管，1/4"ID x 5/16"OD， |
| 长期储存盖 | Markes International | C-CF010 | 黄铜储存盖 ¼" & PTFE 套管，每包 10 个 |
| 雄性接头 | Charlotte Pipe | 2109 | 呼吸连接器的1/3部分（1/2" 通用部件编号 436-005 |
| 雄性接头（由聚四氟乙烯制成） | 自制 | 呼吸连接器的第 3/3 部分（1/4" ID × 1/2" MIP）。该部件由纯聚四氟乙烯棒材专门加工而成 | |
| 泵 | SKC | 220-1000TC-C | 带充电器的 Pocket PumpTouch |
| 小直径管 | Supelco | 20533 | 聚四氟乙烯管 L × O.D. × I.D. 25 英尺 × 1/4 英寸（6.35 毫米） × 0.228 英寸（5.8 毫米） |
| 热脱附管 | Markes International | C2-CAXX-5314 | 管，惰性，TnxTA/硫酸碳，带冷凝帽，每包10个 |
| 管盖/开盖工具 | Markes International | C-CPLOK | |
| 双向球阀接头 | Homewerks Worldwide | VBV-P40-E3B | 呼吸连接器的第2/3部分（1/2）") |
参考文献
- Ahmed, W. M., Lawal, O., Nilsen, T. M., Goodacre, R., Fowler, S. J. Exhaled volatile organic compounds of infection: a systematic review. ACS Infectious Diseases. 3 (10), 695-710 (2017).
- Berna, A. Z., et al. Analysis of breath spec....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
