儿童呼吸样本采集用于疾病生物标志物发现

摘要

本方案描述了一种从儿童采集呼出气体样本的简单方法。简而言之，在进行气相色谱-质谱分析之前，先将混合空气样本在吸附管中进行预浓缩。利用该呼气采集方法，可鉴定感染性和非感染性疾病的呼气生物标志物。

摘要

呼吸样本的采集与分析可用于发现多种传染性和非传染性疾病（如疟疾、结核病、肺癌和肝病）中的挥发性生物标志物。 本方案描述了一种可重复的儿童呼出气体采样方法，并对采集的样本进行稳定化处理，以便后续采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）进行分析。该方法的目标是建立一套标准化流程，用于采集4至15岁儿童的呼吸样本，以开展进一步的化学分析。首先，使用连接于双向阀门的纸板咬嘴进行呼气采样，阀门再连接至一个3 L的采气袋。随后，将呼吸中的分析物转移至热脱附管中，并在4–5 °C条件下保存直至分析。此前，该技术已成功用于采集患有疟疾儿童的呼出气体，并实现了呼吸生物标志物的有效识别。此后，我们已成功将该技术应用于其他儿科人群队列。该方法的优势在于对受试者的配合度要求极低（在儿科人群中尤为有利），采样时间短，无需专业培训人员操作，且可在资源有限的现场环境中使用便携式设备完成。

引言

生物标志物可提供有关正常和病理生理过程的宝贵信息，这些过程可能与临床可识别的疾病相关。近年来，人们对呼出气体中的挥发性物质作为多种疾病状态（包括感染、代谢紊乱和癌症）生物标志物的评估日益关注¹。呼出气体中含有可定量的挥发性有机化合物（VOCs）、半挥发性有机化合物以及微生物来源的物质（例如来自细菌和病毒的核酸）。呼出气体分析的主要目标是无创地了解医学状况和/或环境暴露的情况。根据所关注的成分不同，存在多种收集和分析呼出气体的方法。目前尚无标准化的呼出气体采集方法，这使得不同研究之间的结果难以进行比较。标准化呼出气体采集流程至关重要，因为采样过程本身会对后续气体分析结果产生显著影响。

在许多研究中，采用晚期呼出气采样方法^2,3。该方法通过舍弃呼出气的初始部分（"死腔"），优先采集呼吸周期末段的气体。该策略的优势在于可最大限度降低外源性挥发性有机化合物（如环境中的挥发性有机物）的水平，同时富集内源性、个体特异性的挥发性有机物。该方法在采集呼气样本前，会排除个体呼气的最初数秒钟气体。其他研究者则采用压力传感器，在呼气的预设阶段触发采样^4,5。由于压力传感器需要复杂的工程设计，这种替代方法需要专用且相对昂贵的采样装置。

儿童呼吸样本采集可能尤为困难。一个关键问题是，年幼儿童可能无法配合主动呼气的采样流程 "死腔" 空气。因此，从儿童获取混合呼出气体样本相对更容易。然而，混合呼出气体样本存在环境和材料污染风险，这是该方法的主要局限。因此，儿童样本采集的可行性是当前领域内的主要关注点。

此外，除了采集方法外，呼吸样本的储存方式也会影响样本质量。呼吸气体中较高的湿度以及挥发性有机化合物极低的浓度（万亿分之一）使得呼吸样本在储存过程中特别容易出现问题^6,7。尽管质子转移反应-质谱法（PTR-MS）等实时检测技术具有巨大潜力，气相色谱-质谱法（GC-MS）仍是分析呼吸样本的金标准。由于GC-MS分析呼吸样本属于离线技术，因此需结合热脱附（TD）管、固相微萃取和针式捕集装置等预浓缩方法。在预浓缩之前，呼吸样本需要暂时储存在聚合物袋中⁸。聚合物袋因其价格适中、耐用性相对较好且可重复使用而广受欢迎。虽然袋子可以重复使用，但需要投入时间和精力以确保其有效清洁^7,8。每种特定类型的袋子还需通过实验确定并标准化其质量控制、可重复使用性及回收率的操作流程。

热脱附管（TD管）因能够捕获大量挥发性物质且可定制化，被广泛用于呼出气预富集。填充热脱附管的吸附材料可根据特定应用及目标挥发性物质进行选择和调整。热脱附管显著提高了呼气生物标志物研究的便利性，尤其是在偏远野外现场，因为热脱附管可安全保存呼出气中的挥发性物质至少两周，且便于运输³。

为了标准化儿童呼出气体采集以用于生物标志物的发现，本文介绍了一种采集年幼儿童呼出气体的简便方法。为展示所实施方案的代表性结果，我们呈现了来自一项正在进行的儿童队列（年龄8-17岁）的去标识化数据，这些儿童正在接受非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的评估。本研究的完整结果和分析将在后续出版物中报告。在本工作中，我们报告了一部分数据以演示本方案的应用。简言之，指导儿童通过咬嘴经口正常呼气至聚合物袋中，如同"吹气球"一般。该过程重复2-4次，直至收集到1 L呼出气体。随后将样本转移至TD管中，并在5 °C下保存，以待进行气相色谱-质谱（GC-MS）分析。

方案

本研究已获得华盛顿大学医学院机构审查委员会批准（#201709030）。在纳入研究前，已从受试儿童的父母或法定监护人处获得知情同意。图片中 图2 在获得书面知情家长同意后进行复制。

1. 呼吸采样器组装

1. 使用一次性手套，将纸板吹嘴连接到呼吸采样器上，如补充文件所示 图1将一段短的粗径管子连接到呼吸采样器的另一端，如图所示 补充图1每次使用新导管连接患者。
2. 通过管路将呼吸连接器连接到球囊阀上。参见 图1 呼吸采样器与采样袋连接状态的照片。
3. 逆时针旋转进液接头侧面的滚花拇指螺钉以解锁阀门 下压呼吸袋的阀杆，以打开进样接口进行采样。
4. 通过顺时针旋转进液接头侧面的滚花拇指螺钉，将阀门锁定在打开状态。
5. 确认呼吸采样器上的蓝色阀门已打开（与连接器平行）。
6. 在聚合物袋的标签上填写患者编号、日期和时间。
7. 按照各制造商推荐的程序对热脱附（TD）吸附管进行预处理。在呼气样本采集前，将热脱附管密封并置于4–5 °C保存，以尽量减少干扰物质的产生。

2. 呼吸样本采集

1. 使用呼吸采样器（不带采气袋）向儿童演示呼气动作。向儿童解释，他们应像“吹气球”一样呼气，并尽可能持续地完全呼出气体。将纸板吹嘴置于嘴唇之间，并尽可能完全地呼气。
2. 为儿童提供一个连接采气袋的全新呼吸采样器，要求其按照上述演示方式进行呼气，如图2所示。
3. 儿童完成呼气后，立即关闭呼吸采样器上的蓝色阀门。如需进行额外呼气，可重新打开阀门。
4. 重复步骤2.2和2.3，直至至少收集到1 L呼出气体。对于健康儿童，可能需要2次呼气；对于患病或年龄较小的儿童，则可能需要2–4次呼气。1 L呼出气体为最低分析需求量。在采气袋标签上注明从患者收集的呼气次数。不同呼气体积的采气袋示例见补充图2。
5. 在将采气袋从呼吸采样器上拆下之前，务必通过逆时针旋转进样接头侧面的滚花手拧螺钉来松开，并将阀门杆向上推，以关闭进样接头。采气袋阀门处于开启和关闭状态的照片见补充图3。
6. 通过顺时针旋转进样接头侧面的滚花手拧螺钉，将采气袋阀门锁紧关闭。
7. 将采气袋从呼吸采样器上拆下。
8. 丢弃使用过的吹嘴，并将呼吸采样器妥善放置，待为不同患者使用前进行清洁。

3. 呼出气体转移至热脱附管

1. 从冰箱中取出热脱附（TD）管。使用制造商提供的管帽工具取下吸附管的长期储存帽。
2. 使用软管将TD吸附管的带槽端连接至采样袋。请注意管子的方向至关重要，因为TD管设计为气体仅能从带槽端单向流入。请注意，呼出气从采样袋转移至TD管的过程应在呼气采集后1小时内完成。
3. 将TD管的另一端插入连接至泵的软管中。
4. 启动泵，并设置流速为100 mL/min，运行10分钟。
5. 通过逆时针旋转进样接头侧边的滚花拇指螺钉来打开采样袋阀门，并下压阀杆以打开进样接头。该操作如补充图4所示，图中展示了使用泵将呼出气转移至TD吸附管的过程。
6. 启动泵，采集10分钟后泵将自动停止。
7. 取下TD吸附管，并使用管帽工具将两端的帽拧紧。长期储存帽必须牢固拧紧，以确保密封不漏气。
8. 在其中一端管帽上贴上标签，标明该管已被使用。在标签上注明患者研究编号（ID）及日期。
9. 将吸附管放入一个小的可重复密封的塑料袋中。将吸附管储存于4–5 °C环境中。将采样袋中剩余气体挤出后丢弃采样袋。记录患者研究ID、TD管序列号、采集日期、呼气采集时间、呼气转移时间以及饮食情况（呼气采集前的进食时间及所摄入的食物种类）。

4. 环境空气采集

1. 在采集患者呼出气体后，立即采集其周围环境中的空气样本。
   1. 使用管路将采样袋连接至泵的出口端口，如补充图5所示。
   2. 下压采样袋阀门的阀杆，以打开进样接头进行采样。
   3. 顺时针旋转进样接头侧面的滚花拇指螺钉，将阀门固定在打开状态。
2. 启动泵，并设置其以100 mL/min的流速运行12分钟。泵将采集1,200 mL的环境空气。
3. 当达到所需采集体积后，逆时针旋转进样接头侧面的滚花拇指螺钉以松开固定，然后上推阀门阀杆，关闭进样接头。
4. 顺时针旋转进样接头侧面的滚花拇指螺钉，将采样袋阀门锁紧关闭。
5. 将采样袋从泵上拆下。
6. 操作步骤与第3节相同，唯一区别是此处转移的是环境空气中的挥发性有机物（VOCs），而非呼出气体中的挥发性有机物。

5. 样品与数据分析

注意：呼出气体和空气样本的分析条件此前已有描述⁹。

1. 分析采集的数据，并在色谱图中检测化合物。使用典型的软件程序来查找并识别仪器检测到的所有化合物（图3A）。例如，使用解卷积功能来鉴定化合物。通过设置保留时间窗口因子为80、质谱峰强度过滤器≥100计数、化合物绝对峰面积过滤器≥500计数，对数据进行筛选。
2. 使用化学标准品鉴定呼出气和空气样品中的化合物。提取目标化合物的基峰峰面积，例如异戊二烯和β-蒎烯（图4），并比较呼出气与空气中挥发性化合物的含量水平。

结果

在本研究中，呼吸样本采集自圣路易斯儿童医院接受评估的10名儿童（8-17岁）。呼吸样本和环境空气样本（n = 10）的采集方法如上所述。样本采用气相色谱-四极杆飞行时间质谱法（GC-QToF-MS）结合热脱附技术进行分析，方法同前文所述⁹。在去除背景污染物后，所采用的实验方案在每份混合呼出气样本中平均检测到311种挥发性有机化合物（VOCs）。平均而言，呼吸样本中的VOCs数量显著高于环境/对照空气样本（311 ± 11.5 对比 190 ± 12.6， p < 0.0001）（图3A）。与环境空气相比，呼吸气体中VOCs数量的增加可通过代表性总离子流色谱图（TICs）的对比清晰识别（图3B）。

作为成功采集呼出气体的质量控制措施，将两种常见呼出...

讨论

尽管过去十年中呼吸研究取得了显著进展，但呼吸气体挥发物的采样与分析仍缺乏标准化操作¹⁰。造成这种标准化缺失的一个主要原因是呼吸样本采集方法的多样性，这些方法直接影响任何特定呼出呼吸样本中所含化学物质的多样性。呼出气体中含有大量浓度差异显著的挥发性有机化合物⁶。因此，改变采集方法不仅会影响样本中化合物的丰度，还会影响其多样性。

呼出气体采样出人意料地复杂。尽管受试者仅需在分析前将气体呼入呼吸采集器的吹嘴或密闭容器中即可，但采样过程必须考虑并控制多种潜在变量。在本研究中，我们详细描述了一种针对儿童呼出气体采样的特定且经过验证的方案。我们此前已在资源有限的现场环境（马拉维）中，成功地将该方案应用于低至4岁的发热儿童，证明了我们的呼出气体采集与分析流程在生物标志物发现方面的可行性⁹。随后，我们还进一步在美国一家现代化儿科专科诊所中实施并评估了该方案在儿童呼吸样本采集中的应用。我们的结果表明，对于儿童呼吸生物标志物的发现，混合呼出气体的采集至关重要，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
呼吸袋	SKC	237-03	这些是3升的袋子
纸板吹嘴	A-M 系统	161902	0.86" OD，2.00" L
大直径管	Cole Parmer	95802-11	硅胶管，1/4"ID x 5/16"OD，
长期储存盖	Markes International	C-CF010	黄铜储存盖 ¼" & PTFE 套管，每包 10 个
雄性接头	Charlotte Pipe	2109	呼吸连接器的1/3部分（1/2" 通用部件编号 436-005
雄性接头（由聚四氟乙烯制成）	自制		呼吸连接器的第 3/3 部分（1/4" ID × 1/2" MIP）。该部件由纯聚四氟乙烯棒材专门加工而成
泵	SKC	220-1000TC-C	带充电器的 Pocket PumpTouch
小直径管	Supelco	20533	聚四氟乙烯管  L × O.D. × I.D. 25 英尺 × 1/4 英寸（6.35 毫米） × 0.228 英寸（5.8 毫米）
热脱附管	Markes International	C2-CAXX-5314	管，惰性，TnxTA/硫酸碳，带冷凝帽，每包10个
管盖/开盖工具	Markes International	C-CPLOK
双向球阀接头	Homewerks Worldwide	VBV-P40-E3B	呼吸连接器的第2/3部分（1/2）")