我们介绍了一种用于产生和扩增基因修饰的呼吸道合胞病毒(RSV)的方法,以及一种优化的RSV蚀斑检测法。我们通过构建两种重组病毒来演示该方案,这两种病毒分别可用于定量检测RSV的复制以及活体分析RSV包涵体及其相关颗粒的动态过程。
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我们介绍了一种用于产生和扩增基因修饰的呼吸道合胞病毒(RSV)的方法,以及一种优化的RSV蚀斑检测法。我们通过构建两种重组病毒来演示该方案,这两种病毒分别可用于定量检测RSV的复制以及活体分析RSV包涵体及其相关颗粒的动态过程。
重组病毒的使用在基础或应用病毒学研究中已变得至关重要。反向遗传学已被证明是一种极为强大的技术,既可用于解析病毒复制机制,也可用于抗病毒药物研究或疫苗开发平台的构建。然而,针对呼吸道合胞病毒(RSV)等负链RNA病毒构建和操作反向遗传系统仍然较为复杂,需要特殊的技术经验。RSV基因组为单链负义RNA,长度约为15 kb,可作为病毒RNA复制和转录的模板。我们的反向遗传系统采用人呼吸道合胞病毒长株(HRSV)基因组的cDNA拷贝。该cDNA以及编码聚合酶复合物病毒蛋白(L、P、N和M2-1)的cDNA均被插入独立的表达载体中,并置于T7聚合酶调控序列的控制之下。将这些元件转染至稳定表达T7聚合酶的BSR-T7/5细胞中,可实现重组RSV在细胞质内的复制和转录,从而产生基因修饰的病毒颗粒。新生成的RSV存在于BSR-T7/5细胞表面及其培养上清液中,收集后用于感染人HEp-2细胞以进行病毒扩增。通常需要经过两到三轮扩增,才能获得滴度为1 × 106 至 1 × 107 空斑形成单位(PFU)/mL的病毒储备液。本文详细描述了病毒储备液的最佳收获、冷冻保存及滴定方法。我们通过构建两种分别表达游离绿色荧光蛋白(GFP)(RSV-GFP)或GFP融合病毒M2-1蛋白(RSV-M2-1-GFP)的重组病毒,来演示本方案的应用。我们展示了如何利用RSV-GFP定量检测RSV的复制水平,以及如何通过视频显微技术利用RSV-M2-1-GFP在活细胞中可视化病毒结构和病毒蛋白的动态行为。
人呼吸道合胞病毒(RSV)是全球婴幼儿因急性呼吸道感染而住院的首要原因1。此外,RSV在成人中引起的疾病负担与流感相当,其中大部分住院和死亡病例集中在老年人群2。目前尚无针对RSV的疫苗或特异性抗病毒药物,但已有多种前景良好的新药正在研发中3,4。尽管当前已投入大量努力,但RSV增殖定量技术的复杂性和高操作难度仍严重阻碍了抗病毒药物和疫苗的开发。体外定量RSV增殖通常依赖于耗时、费力且昂贵的方法,主要包括显微镜下观察细胞病变效应、免疫染色、空斑减少实验、定量逆转录(qRT)-聚合酶链式反应(PCR)以及酶联免疫吸附测定。携带经修饰基因组并表达报告基因(如编码绿色荧光蛋白GFP的基因)的病毒更适用于此类筛选。结合自动化酶标仪的使用,携带报告基因的重组病毒可使这些检测方法更易于标准化,并适用于高通量筛选。
呼吸道合胞病毒(RSV)是一种有包膜的、非分段的负链RNA病毒,属于Mononegavirales目下的Pneumoviridae科Orthopneumovirus属5。RSV基因组为约15 kb的单链负义RNA,其3'和5'末端分别含有称为Leader和Trailer的非编码区,并包含10个转录单元,编码11种蛋白质。这些基因的排列顺序如下:3'-NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2(编码M2-1和M2-2蛋白)和L-5'。基因组RNA被核蛋白N紧密包裹。以该包裹后的基因组RNA为模板,病毒依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)负责病毒RNA的转录与复制。病毒RdRp由大蛋白L(具有核苷酸聚合酶活性)、其必需的辅因子磷酸化蛋白P以及作为病毒转录因子发挥作用的M2-1蛋白共同组成6。在感染细胞中,RSV可诱导形成称为包涵体(inclusion bodies, IBs)的胞质内包涵结构。Mononegavirales目中多种病毒也被观察到形态相似的胞质内包涵结构7,8,9,10。近期对狂犬病病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、埃博拉病毒和RSV的研究表明,病毒RNA的合成发生在包涵体内,因此包涵体可被视为病毒工厂8,9,11,12。这些病毒工厂集中了病毒RNA合成所需的RNA和病毒蛋白,同时也包含多种宿主细胞蛋白13,14,15,16,17。包涵体内存在一种功能性的亚结构,称为包涵体相关颗粒(IB-associated granules, IBAGs),其内富集了新合成的病毒mRNA以及M2-1蛋白,而基因组RNA及L、P和N蛋白则不在IBAGs中被检测到。IBAGs是位于包涵体内部的小型动态球状结构,具有液态细胞器的特性12。尽管包涵体在病毒增殖过程中发挥核心作用,但目前对其本质、内部结构、形成机制及功能运作仍知之甚少。
1981年,通过cDNA表达脊髓灰质炎病毒基因组,实现了首个具有感染性病毒克隆的构建18。对于单股负链RNA病毒,直到1994年才首次实现将质粒转染入细胞后产生狂犬病病毒19。基于质粒的呼吸道合胞病毒(RSV)反向遗传学系统的首次报道发表于1995年20。反向遗传学技术推动了病毒学领域的重大进展。通过对病毒基因组引入特定修饰,研究人员得以深入理解RNA病毒的复制机制和致病过程。该技术还通过靶向性的系列修饰实现病毒的特异性减毒,从而极大促进了疫苗的研发。此外,通过基因组改造实现病毒增殖的快速定量,显著提升了抗病毒药物的筛选效率及其作用机制的研究水平。
尽管此前已有描述,获得基因修饰的呼吸道合胞病毒(RSV)仍然十分困难。本文详细阐述了一种用于构建两种表达 RSV-GFP 或 RSV-M2-1-GFP 的重组人呼吸道合胞病毒(HRSV)的实验方案。本方案中,我们描述了拯救新型重组病毒所需的转染条件,以及扩增病毒以获得高滴度病毒储备液的方法,适用于可重复的实验研究。反向遗传学载体本身的构建未在本文中介绍。我们详细说明了病毒储备液的最佳收获与冷冻保存方法。目前最准确的病毒感染性颗粒定量方法仍是空斑实验。将细胞接种于待测悬液的系列稀释液中,并覆盖一层阻止上清液中游离病毒颗粒扩散的覆盖物。在此条件下,病毒仅能感染邻近细胞,每个初始感染性颗粒形成一个"空斑"。在传统的 RSV 滴定实验中,空斑通过免疫染色显色,并在显微镜下计数。该方法成本高且耗时。本文介绍了一种使用微晶纤维素覆盖层的极为简便的 RSV 空斑实验方案,可使形成的空斑肉眼可见。我们展示了如何利用 RSV-GFP 检测 RSV 的复制过程,从而量化抗病毒药物的作用效果。结合反向遗传学与活细胞成像技术,我们证明了 RSV-M2-1-GFP 可使科研人员在活细胞中可视化 M2-1 蛋白,并追踪细胞内病毒结构(如包涵体 IBs)的动态变化。
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1. 材料准备
2. 重组病毒的拯救与初次传代
注意:所有以下步骤均须在无菌环境中进行,并使用II级安全柜。
3. 拯救病毒的扩增
注意:以下方案描述了在75 cm2培养瓶中扩增拯救病毒的步骤。请根据所需体积和感染复数(MOI)调整培养瓶的规格。表1列出了适用于不同培养瓶的体积。所有步骤均须在II级生物安全柜内的无菌环境中进行。
4. 空斑滴定实验


5. 利用HRSV-GFP重组病毒监测经小干扰RNA或抗病毒药物处理细胞中的病毒复制
注意:除步骤 5.1 和 5.2.5 外,所有步骤均须在 II 级安全柜内的无菌环境中进行。
6. 利用 RSV-M2-1-GFP 重组病毒在体内表征 M2-1 的定位
注意: 步骤 6.1 和 6.2 需在无菌环境中进行,使用 II 级生物安全柜。
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本研究中,我们描述了一种产生表达荧光蛋白的重组呼吸道合胞病毒(RSV)的详细方案(图2)。在pRSV-GFP质粒中,GFP基因被插入P基因和M基因之间,其构建方式与先前发表文献中描述的Cherry基因插入方法相同21。在pRSV-M2-1-GFP质粒中,M2基因保持不变,并在SH基因和G基因之间插入一个额外的编码M2-1-GFP的基因12。第一步是在BSRT7/5细胞中拯救病毒,如图2A所示。转染后72小时,在对应于RSV-GFP和RSV-M2-1-GFP拯救的孔中可见少量绿色荧光细胞簇。在RSV-GFP感染的细胞中,荧光信号可同时出现在细胞质和细胞核中,这对应于游离GFP的表达。相比之下,在RSV-M2-1-GFP拯救实验中,仅可见细胞质内少量荧光点状结构,这对应于M2-1-GFP在包涵体(IBs)中的聚集。通常在此阶段不会观察到细胞病变效应(CPE)(如合...
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本文介绍了一种利用五个质粒拯救重组呼吸道合胞病毒(RSV)并进行扩增的方法。对病毒基因组进行操控的能力已彻底改变了病毒学研究,使得研究人员能够检测突变、表达额外基因或带有标签的病毒蛋白。本文描述并用作示例的RSV是一种表达报告基因的病毒,即RSV-GFP(未发表),其表达的M2-1蛋白与GFP标签融合12。RSV的拯救具有挑战性,需要反复实践。转染效率至关重要,取决于转染试剂的合理选择以及转染方案的预先优化。必须使用表达噬菌体T7 RNA聚合酶(T7 pol)的细胞,因为在大多数反向遗传学载体中,病毒cDNA位于T7 pol启动子的下游。另一种方法是通过痘苗病毒辅助病毒来表达T7 pol。然而,使用稳定表达T7 pol的细胞可避免分离两种病毒的需要,并防止痘苗病毒对RSV拯救过程可能产生的干扰。在进行反向遗传学操作的首次传代(P0至P1)时,应避免冻存接种物,以确保最高的拯救效率。这意味着感染复数(MOI)无法精确控制。但在该阶段,病毒滴度仍然非常低,因此首次传代的实际MOI较低。为了获得高感染性滴度(106–107 PFU/mL)的RSV储备液...
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作者无任何利益冲突需要披露。
作者感谢阿斯利康(AstraZeneca)的秦宇博士&感谢美国马萨诸塞州波士顿市的 #38;D 公司提供 AZD4316 药物。作者感谢 Cymages 平台提供 ScanR Olympus 显微镜的使用权限,该设备获得了法兰西岛大区(DIM ONE HEALTH)资助项目的经费支持。作者同时感谢法国国家健康与医学研究院(INSERM)和凡尔赛-圣康坦大学的支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 用于活细胞成像的 35 mm & 微型培养皿 | 同比迪 | 81156 | |
| A549 | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Avicel RC-591 | FMC 生物聚合物 | Avicel RC-591 | 有关 Avicels 的技术和其他信息,请访问 http://www.fmcbiopolymer.com。在室温下储存。步骤 4 中的实验步骤针对该试剂进行了优化。 |
| BSRT7/5 | 未上市 | 参见参考文献 22。Buchholz et al. 1999 | |
| 结晶紫溶液 | Sigma | HT90132 | |
| 用于观察的荧光显微镜 | 奥林巴斯 | IX73 奥林巴斯显微镜 | |
| 视频显微镜的荧光显微镜 | 奥林巴斯 | ScanR 奥林巴斯显微镜 | |
| HEp-2 | ATCC | ATCC CCL-23 | |
| HEPES ≥99.5% | Sigma | H3375 | |
| L-谷氨酰胺 (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| LIPOFECTAMINE 2000 试剂 | ThermoFisher Scientific | 11668019 | 实验方案针对该试剂进行了优化。 |
| MEM (10x),无谷氨酰胺 | ThermoFisher Scientific | 11430030 | |
| MEM,GlutaMAX 补充剂 | ThermoFisher Scientific | 41090-028 | |
| MgSO4 ReagentPlus 和 ge;99.5% | Sigma | M7506 | |
| Opti-MEM I 减血清培养基 | ThermoFisher Scientific | 51985-026 | |
| 多聚甲醛水溶液,32%,EM 级 | 电子显微镜科学 | 15714 | |
| 青霉素-链霉素 (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 质粒 | 未上市 | 参见参考文献 21。Rameix-Welti et al. 2014 | |
| 参见 Saw Rocker | VWR | 444-0341 | |
| si、RNA、GAPDH | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA D-001810-10-05 | SMARTpool 和 Dharmacon 设计的 4 个单个 siRNA 中的 3 个。 |
| Si RNA IMPDH2 | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human L-004330-00-0005 | Dharmacon 设计的 4 个单独 siRNA 的 SMARTpool. 单个参考和序列 J-004330-06:GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG; |
| Si RNA RSV N | Dharmacon | ON-TARGETplus 定制 siRNA | UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU 和 UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA |
| SiRNA NT | Dharmacon | ON-TARGETplus 非靶向池 | |
| SiRNA 转染试剂 | Dharmacon | DharmaFECT 1 参考文献:T-2001-03 | 步骤 5.1.和 5.1.2 中的方案针对该试剂进行了优化。 |
| 碳酸氢钠 7.5% 溶液 | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| 荧光分光光度计 | Tecan | Tecan 无限M200PRO |
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