方法文章

重组呼吸道合胞病毒的制备、扩增与滴定

DOI：

10.3791/59218

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2019年4月4日

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1UMR 1173 Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université de Versailles St. Quentin, 2UR892 Institut national de la recherche agronomique (INRA), Unité de virologie et immunologie moléculaires, 3Assistance Publique–Hôpitaux de Paris (AP-HP), Hôpital Ambroise Paré, Laboratoire de Microbiologie

本文内容

摘要

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我们介绍了一种用于产生和扩增基因修饰的呼吸道合胞病毒（RSV）的方法，以及一种优化的RSV蚀斑检测法。我们通过构建两种重组病毒来演示该方案，这两种病毒分别可用于定量检测RSV的复制以及活体分析RSV包涵体及其相关颗粒的动态过程。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

重组病毒的使用在基础或应用病毒学研究中已变得至关重要。反向遗传学已被证明是一种极为强大的技术，既可用于解析病毒复制机制，也可用于抗病毒药物研究或疫苗开发平台的构建。然而，针对呼吸道合胞病毒（RSV）等负链RNA病毒构建和操作反向遗传系统仍然较为复杂，需要特殊的技术经验。RSV基因组为单链负义RNA，长度约为15 kb，可作为病毒RNA复制和转录的模板。我们的反向遗传系统采用人呼吸道合胞病毒长株（HRSV）基因组的cDNA拷贝。该cDNA以及编码聚合酶复合物病毒蛋白（L、P、N和M2-1）的cDNA均被插入独立的表达载体中，并置于T7聚合酶调控序列的控制之下。将这些元件转染至稳定表达T7聚合酶的BSR-T7/5细胞中，可实现重组RSV在细胞质内的复制和转录，从而产生基因修饰的病毒颗粒。新生成的RSV存在于BSR-T7/5细胞表面及其培养上清液中，收集后用于感染人HEp-2细胞以进行病毒扩增。通常需要经过两到三轮扩增，才能获得滴度为1 × 106 至 1 × 107 空斑形成单位（PFU）/mL的病毒储备液。本文详细描述了病毒储备液的最佳收获、冷冻保存及滴定方法。我们通过构建两种分别表达游离绿色荧光蛋白（GFP）（RSV-GFP）或GFP融合病毒M2-1蛋白（RSV-M2-1-GFP）的重组病毒，来演示本方案的应用。我们展示了如何利用RSV-GFP定量检测RSV的复制水平，以及如何通过视频显微技术利用RSV-M2-1-GFP在活细胞中可视化病毒结构和病毒蛋白的动态行为。

引言

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人呼吸道合胞病毒（RSV）是全球婴幼儿因急性呼吸道感染而住院的首要原因1。此外，RSV在成人中引起的疾病负担与流感相当，其中大部分住院和死亡病例集中在老年人群2。目前尚无针对RSV的疫苗或特异性抗病毒药物，但已有多种前景良好的新药正在研发中3,4。尽管当前已投入大量努力，但RSV增殖定量技术的复杂性和高操作难度仍严重阻碍了抗病毒药物和疫苗的开发。体外定量RSV增殖通常依赖于耗时、费力且昂贵的方法，主要包括显微镜下观察细胞病变效应、免疫染色、空斑减少实验、定量逆转录（qRT）-聚合酶链式反应（PCR）以及酶联免疫吸附测定。携带经修饰基因组并表达报告基因（如编码绿色荧光蛋白GFP的基因）的病毒更适用于此类筛选。结合自动化酶标仪的使用，携带报告基因的重组病毒可使这些检测方法更易于标准化，并适用于高通量筛选。

呼吸道合胞病毒（RSV）是一种有包膜的、非分段的负链RNA病毒，属于Mononegavirales目下的Pneumoviridae科Orthopneumovirus属5。RSV基因组为约15 kb的单链负义RNA，其3'和5'末端分别含有称为Leader和Trailer的非编码区，并包含10个转录单元，编码11种蛋白质。这些基因的排列顺序如下：3'-NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2（编码M2-1和M2-2蛋白）和L-5'。基因组RNA被核蛋白N紧密包裹。以该包裹后的基因组RNA为模板，病毒依赖RNA的RNA聚合酶（RdRp）负责病毒RNA的转录与复制。病毒RdRp由大蛋白L（具有核苷酸聚合酶活性）、其必需的辅因子磷酸化蛋白P以及作为病毒转录因子发挥作用的M2-1蛋白共同组成6。在感染细胞中，RSV可诱导形成称为包涵体（inclusion bodies, IBs）的胞质内包涵结构。Mononegavirales目中多种病毒也被观察到形态相似的胞质内包涵结构7,8,9,10。近期对狂犬病病毒、水疱性口炎病毒（VSV）、埃博拉病毒和RSV的研究表明，病毒RNA的合成发生在包涵体内，因此包涵体可被视为病毒工厂8,9,11,12。这些病毒工厂集中了病毒RNA合成所需的RNA和病毒蛋白，同时也包含多种宿主细胞蛋白13,14,15,16,17。包涵体内存在一种功能性的亚结构，称为包涵体相关颗粒（IB-associated granules, IBAGs），其内富集了新合成的病毒mRNA以及M2-1蛋白，而基因组RNA及L、P和N蛋白则不在IBAGs中被检测到。IBAGs是位于包涵体内部的小型动态球状结构，具有液态细胞器的特性12。尽管包涵体在病毒增殖过程中发挥核心作用，但目前对其本质、内部结构、形成机制及功能运作仍知之甚少。

1981年，通过cDNA表达脊髓灰质炎病毒基因组，实现了首个具有感染性病毒克隆的构建18。对于单股负链RNA病毒，直到1994年才首次实现将质粒转染入细胞后产生狂犬病病毒19。基于质粒的呼吸道合胞病毒（RSV）反向遗传学系统的首次报道发表于1995年20。反向遗传学技术推动了病毒学领域的重大进展。通过对病毒基因组引入特定修饰，研究人员得以深入理解RNA病毒的复制机制和致病过程。该技术还通过靶向性的系列修饰实现病毒的特异性减毒，从而极大促进了疫苗的研发。此外，通过基因组改造实现病毒增殖的快速定量，显著提升了抗病毒药物的筛选效率及其作用机制的研究水平。

尽管此前已有描述，获得基因修饰的呼吸道合胞病毒（RSV）仍然十分困难。本文详细阐述了一种用于构建两种表达 RSV-GFP 或 RSV-M2-1-GFP 的重组人呼吸道合胞病毒（HRSV）的实验方案。本方案中，我们描述了拯救新型重组病毒所需的转染条件，以及扩增病毒以获得高滴度病毒储备液的方法，适用于可重复的实验研究。反向遗传学载体本身的构建未在本文中介绍。我们详细说明了病毒储备液的最佳收获与冷冻保存方法。目前最准确的病毒感染性颗粒定量方法仍是空斑实验。将细胞接种于待测悬液的系列稀释液中，并覆盖一层阻止上清液中游离病毒颗粒扩散的覆盖物。在此条件下，病毒仅能感染邻近细胞，每个初始感染性颗粒形成一个"空斑"。在传统的 RSV 滴定实验中，空斑通过免疫染色显色，并在显微镜下计数。该方法成本高且耗时。本文介绍了一种使用微晶纤维素覆盖层的极为简便的 RSV 空斑实验方案，可使形成的空斑肉眼可见。我们展示了如何利用 RSV-GFP 检测 RSV 的复制过程，从而量化抗病毒药物的作用效果。结合反向遗传学与活细胞成像技术，我们证明了 RSV-M2-1-GFP 可使科研人员在活细胞中可视化 M2-1 蛋白，并追踪细胞内病毒结构（如包涵体 IBs）的动态变化。

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方案

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1. 材料准备

  1. 购买细胞培养基（减血清培养基、最低必需培养基 [MEM]、10x MEM 以及 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 [DMEM]）、转染试剂和微晶纤维素（参见材料表）。
  2. 获取用于反向遗传学的以下载体：基因组载体和编码 N 蛋白及聚合酶复合物蛋白的表达载体。基因组载体包含位于噬菌体 T7 RNA 聚合酶（T7 pol）启动子下游的 RSV-GFP（p-RSV-GFP）和 RSV-M2-1GFP（p-RSV-M2-1GFP）的全长 cDNA 基因组。表达载体（分别命名为 p-N、p-P、p-L 和 p-M2-1）包含 N、P、L 或 M2-1 编码序列，位于 T7 pol 启动子下游（有关质粒构建的详细信息，请参见 Rincheval 等12 和 Rameix-Welti 等21）。
  3. 在无菌环境中配制用于细胞培养、转染和感染的培养基。使用添加了 10% 胎牛血清（FCS）、1,000 单位/mL 青霉素和 1 mg/mL 链霉素（或不含抗生素）的 DMEM，并补充 2 mM L-谷氨酰胺；另配制添加了 2 mM L-谷氨酰胺以及 0%、2% 或 10% FCS、1,000 单位/mL 青霉素和 1 mg/mL 链霉素的 MEM，在后续实验方案中统称为“完全培养基”。
  4. 获取 BSRT7/522 细胞，并用含 10% 二甲基亚砜（DMSO）的完全培养基以每毫升 1 至 2 × 106 个细胞的密度制备细胞冻存液。将细胞冻存于液氮中。获取 HEp-2 细胞。将 BSRT7/5 细胞在完全 DMEM 中、HEp-2 细胞在完全 MEM 中，于 37 °C 和 5% CO2 的无菌环境中进行培养。
  5. 在无菌环境中配制 10 倍浓度的 RSV 保存液（含 0.5 M HEPES 和 1 M MgSO4 [pH 7.5] 的水溶液）。
  6. 准备一台适用于 GFP 荧光检测且支持活细胞成像的倒置荧光显微镜，以便在需要时监测感染过程。同时准备一台适用于 GFP 荧光检测的微孔板读数仪，用于定量检测 RSV-GFP 的复制水平。

2. 重组病毒的拯救与初次传代

注意：所有以下步骤均须在无菌环境中进行，并使用II级安全柜。

  1. 转染前一天，将BSRT7/5细胞系用完全培养基制成浓度为5 × 105 个细胞/mL的细胞悬液。每孔加入2 mL细胞悬液至6孔板中，每个待拯救病毒准备一孔，另设一孔作为阴性对照。将培养板置于37 °C、5% CO2条件下培养。次日观察细胞融合度应达到80%–90%。
  2. 解冻反向遗传学载体（步骤1.2中制备的）p-RSV-GFP和p-RSV-M2-1-GFP，以及p-N、p-P、p-L和p-M2-1。为每种待拯救病毒，在离心管中混合1 µg p-N和p-P、0.5 µg p-L、0.25 µg p-M2-1，以及1.25 µg p-RSV（GFP或M2-1 GFP）。
    注意：可使用不同的N、P、L和M2-1表达载体，但各蛋白之间的比例必须保持不变。阴性对照中用空载体替代p-RSV载体。
  3. 按照转染试剂生产商的操作说明进行转染（参见材料表）。
    1. 向混合好的载体中加入250 µL低血清培养基。另取一管，将10 µL转染试剂溶于250 µL低血清培养基中。轻轻涡旋两管，室温静置5分钟。将两管内容物混合，室温孵育20分钟。
    2. 用1 mL低血清培养基冲洗BSRT7/5细胞，每孔加入1.5 mL含10%胎牛血清（FCS）但不含抗生素的MEM培养基。如有需要，将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中，直至步骤2.3.1的孵育完成。
    3. 20分钟孵育结束后，将步骤2.3.1中制备的500 µL转染混合液加入一孔细胞中。将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中培养3天。转染期间不更换培养基。
  4. 每天使用倒置荧光显微镜（20倍物镜）配合GFP滤光片观察GFP荧光（激发波长488 nm，发射波长515–535 nm），以监测病毒拯救效率。
  5. 转染后第二天，为拯救的病毒进行首次传代接种细胞。将HEp-2细胞用完全培养基制成浓度为5 × 105 个细胞/mL的悬液，每孔加入2 mL至6孔板中（每种待拯救病毒一孔，另设一阴性对照孔）。
  6. 转染第三天，使用不同的细胞刮刀分别刮取转染后的BSRT7/5细胞6孔板中各孔的细胞。将每孔的内容物（细胞和上清液）转移至无菌的2 mL微量离心管中。剧烈涡旋每管至少30秒，以使拯救的病毒从细胞膜上释放。
    注意：此步骤对应拯救病毒的第0代（P0）（图1）。
  7. 使用新鲜的P0代病毒悬液对拯救的病毒进行首次扩增。
    1. 移除前一天接种的HEp-2细胞6孔板中的培养基（见步骤2.5），每孔迅速加入500 µL P0代病毒悬液（来自步骤2.6）。将HEp-2细胞板置于37 °C摇床上轻柔振荡2小时。
    2. 移除并弃去500 µL接种液，每孔加入2 mL含2% FCS的MEM培养基。将培养板置于37 °C、5% CO2条件下培养3天。此即获得拯救病毒的第一代（P1）（图1）。
  8. 向剩余的P0代病毒悬液（来自步骤2.6）中加入其体积1/10的10倍浓缩RSV保存液（0.5 M HEPES和1 M MgSO4 [pH 7.5]）。剧烈涡旋微量管5秒，将液体分装至带有耐酒精标签的冻存管中。将冻存管浸入预冷至-80 °C的酒精中至少1小时，随后于-80 °C保存。
  9. 对每种拯救病毒的P0代病毒储备液（见步骤2.6）进行滴度测定（参见第4节微晶纤维素滴定法）。
  10. 每天使用倒置荧光显微镜（20倍物镜）观察接种P0代病毒悬液的HEp-2细胞的GFP荧光（激发波长488 nm，发射波长515–535 nm），以监测感染情况。同时使用明场显微镜观察细胞是否出现小合胞体及细胞脱落现象，这些是RSV致细胞病变效应（CPE）的表现（参见 图2）。
  11. 若在2–3天后既未观察到荧光也未出现CPE，则表明病毒拯救失败。
  12. 在第3或第4天按照步骤2.6所述方法收集第一代病毒（P1）。简要步骤为：刮取细胞，收集细胞与上清液，涡旋混匀，按步骤2.8所述加入保存液，分装后冷冻保存。
  13. 对第一代病毒（P1）进行滴度测定（参见第4节滴定实验）和扩增（参见第3节扩增方法）。

3. 拯救病毒的扩增

注意：以下方案描述了在75 cm2培养瓶中扩增拯救病毒的步骤。请根据所需体积和感染复数（MOI）调整培养瓶的规格。表1列出了适用于不同培养瓶的体积。所有步骤均须在II级生物安全柜内的无菌环境中进行。

  1. 在扩增前一天，将HEp-2细胞用完全培养基配制成浓度为5 × 105 个细胞/mL的细胞悬液。每只75 cm2培养瓶中加入15 mL细胞悬液，于37 °C、5% CO2条件下培养。每种待扩增病毒准备一瓶。
  2. 培养开始后的第二天，检查细胞融合度是否达到80%–100%。
  3. 将步骤2.12中获得的病毒悬液用不含FCS的MEM稀释，配制成3 mL、浓度为50,000 PFU/mL的病毒悬液（相当于MOI为0.01 PFU/细胞）。
  4. 吸去培养液，迅速加入3 mL病毒悬液。将培养瓶置于37 °C摇床上，以缓慢摆动方式轻柔振荡2小时。
  5. 移除并弃去接种液，加入15 mL含2% FCS的MEM。于37 °C、5% CO2条件下继续培养2–4天。
  6. 在倒置荧光显微镜下以20倍物镜观察细胞形态及GFP荧光（激发波长488 nm，发射波长515–535 nm），以判断最佳收获病毒时间。通常在感染后48至72小时（p.i.），由于RSV引起的细胞病变效应（CPE），HEp-2细胞层中有50%–80%细胞脱落时即为适宜收获时机（见图3）。
  7. 用细胞刮刮下所有细胞，收集细胞与上清液一并转移至50 mL离心管中。
  8. 加入相当于总体积1/10的10倍浓缩RSV保存液（0.5 M HEPES和1 M MgSO4，pH 7.5）。剧烈涡旋振荡5秒，然后在200 × g条件下离心5分钟以澄清悬液。
  9. 将上清液转移至新的50 mL离心管中，短暂涡旋混匀后分装至带有耐酒精标签的冻存管中。将冻存管浸入预冷至-80 °C的酒精中至少1小时，随后于-80 °C保存。
  10. 取其中一份样品解冻，用于测定病毒悬液滴度（见第4节）。

4. 空斑滴定实验

  1. 在进行滴定实验的前一天准备12孔板（每管病毒需要6个孔）。在完全培养基中，每孔接种1 mL HEp-2细胞，细胞密度为5 × 105 个细胞/mL。
  2. 次日，在无菌条件下制备微晶纤维素悬浮液（2.4% [w/v] 水溶液）（参见材料表）。
    1. 使用标准磁力搅拌器将2.4 g微晶纤维素粉末分散于100 mL蒸馏水中，持续搅拌至粉末完全溶解（通常需4–12小时）。将悬浮液在121 °C下高压灭菌20分钟，使用前于室温保存。
      注意：在此条件下，该悬浮液可稳定保存1年。
    2. 溶液在无菌环境中开启后，应于4 °C保存6个月。每次使用前务必充分混匀悬浮液（手动振荡或涡旋），以确保其均匀性。
  3. 在无菌条件下配制2倍浓度的MEM培养基。将商品化的10倍浓缩MEM用无菌水稀释，并加入L-谷氨酰胺、1,000单位/mL青霉素和1 mg/mL链霉素。剧烈振荡混匀后，于4 °C保存。
    注意：步骤4.4–4.10应在II级生物安全柜中无菌操作进行。
  4. 为每种待滴定的病毒准备6个试管，每管含900 µL不含FCS的MEM培养基（滴定管）。将病毒分装样品解冻后，剧烈涡旋5秒，取100 µL加入第一支滴定管中。
  5. 进行6次十倍系列稀释，操作如下：在第一管中加入100 μL病毒液至900 μL培养基中，盖上管盖，涡旋数秒混匀。更换移液器吸头，取100 μL第一管稀释液加入第二管900 μL培养基中，盖上管盖并涡旋混匀。重复此步骤至第六管。
    注意：每次稀释均必须更换吸头。
  6. 在HEp-2 12孔板上标记病毒名称及稀释倍数。在板与盖上做对应标记，以防染色过程中（步骤4.9）板与盖分离。吸除孔内培养基，每孔加入400 µL一种稀释液。将板置于37 °C孵育2小时，以完成病毒吸附。
    注意：每次接种之间应更换移液器吸头，或使用同一吸头从最低浓度向最高浓度依次接种。同时接种的板数应控制在1至2块，以避免细胞干燥。
  7. 在病毒吸附期间（现配现用）制备微晶纤维素覆盖层。为获得100 mL覆盖液，混合10 mL 2.4%微晶纤维素悬浮液、10 mL 2倍浓度MEM和80 mL含2% FCS的MEM。
    1. 根据颜色指示，用7.5%无菌碳酸氢钠溶液将2倍浓度MEM的pH调节至约7.2。加入微晶纤维素悬浮液和MEM，剧烈混匀。
  8. 2小时孵育结束后，不吸除接种液，直接向12孔板每孔加入2至3 mL覆盖液。操作时需小心，避免高病毒滴度的接种液污染相邻孔。将板置于37 °C、5% CO2条件下孵育6天。孵育期间不得移动培养板或培养箱。
  9. 使用结晶紫染色液（8%结晶紫 [v/v]、2%甲醛 [v/v] 和20%乙醇 [v/v] 溶于水）对细胞进行染色。
    1. 在生物安全柜工作台面铺上防护垫（结晶紫会强烈染色台面）。
    2. 轻轻振荡板子以去除微晶纤维素覆盖层。吸除上清液，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞2次。每次处理一块板，避免细胞干燥。每孔加入1–2 mL结晶紫染色液，静置10–15分钟。吸除染色液，该液体可重复用于后续板的染色。
    3. 将板和盖浸入新鲜漂白液中数秒，然后用自来水彻底冲洗。注意：漂白液可对板和盖进行去污处理。
    4. 将板和盖置于纸巾上晾干。水洗后于室温干燥，并在室温下保存。若需长期储存（数月），应避光保存以防止褪色。注意：若细胞染色褪去，可再次用结晶紫染色。
  10. 计算病毒滴度。在干燥的板上直接肉眼计数各孔中的空斑数。检查不同稀释度下的空斑数是否符合预期（各稀释度间相差约10倍）。选择空斑最易计数的孔，根据接种体积和稀释倍数计算病毒滴度。
    注意：如图4所示示例，在10-5稀释度下计数到21个空斑。其对应的滴度为
    figure-protocol-1
    figure-protocol-2

5. 利用HRSV-GFP重组病毒监测经小干扰RNA或抗病毒药物处理细胞中的病毒复制

注意：除步骤 5.1 和 5.2.5 外，所有步骤均须在 II 级安全柜内的无菌环境中进行。

  1. 监测细胞基因沉默对呼吸道合胞病毒增殖的影响
    注意：转染方案取决于所使用的试剂（参见材料表）。
    1. 为GFP检测准备96孔板。在实验前两天，针对特定的小干扰RNA（siRNA），配制含100 nM siRNA和按1/500稀释的siRNA转染试剂的低血清培养基溶液。室温孵育该溶液30分钟。
    2. 将25 µL上述溶液加入5.1.1步骤中准备好的96孔板的各孔中（每组设三个复孔）。向各孔接种75 µL浓度为4 × 105 个细胞/mL的A549细胞悬液（使用不含抗生素的完全培养基），使最终细胞浓度为3 × 105 个细胞/mL。在37 °C、5% CO2条件下孵育48小时。
      注意：最终siRNA浓度为25 nM，每孔转染试剂终体积为0.5 µL。
    3. 按如下步骤感染细胞：吸除各孔中的培养基，加入100 µL浓度为50,000 PFU/mL的RSV-GFP病毒悬液，在37 °C、5% CO2条件下孵育2小时。吸除病毒悬液，加入100 µL不含酚红的含2% FCS的DMEM培养基。将培养板继续在37 °C、5% CO2条件下孵育。
    4. 在感染后24小时和48小时，使用荧光分光光度计分别在激发波长488 nm、发射波长520 nm的条件下测定荧光强度（荧光值以相对荧光单位表示）。以未感染的A549细胞作为荧光和背景水平的对照标准。
      注意：在无盖条件下检测前，需用4%多聚甲醛（PFA）固定细胞。
  2. 利用RSV-GFP评估药物抑制效果
    1. 为GFP检测准备96孔板。在实验前一天，向各孔接种100 µL浓度为5 × 105 个细胞/mL的HEp-2细胞悬液（使用不含酚红的完全培养基）。
    2. 在补充有2% FCS和抗生素的MEM培养基中对测试药物（本例为AZ4316）进行系列稀释（每孔50 µL）。在不含基质血管组分（SVF）且不含酚红的MEM培养基中配制浓度为10,000 PFU/mL的病毒悬液（每孔50 µL）。
    3. 吸除96孔板中HEp-2细胞的培养基，每孔加入50 µL药物悬液和50 µL病毒悬液（每组设三个复孔）。同时平行进行模拟感染作为对照。
      注意：药物稀释液和病毒悬液可在加入细胞前预先混合，也可依次加入。
    4. 在37 °C、5% CO2条件下孵育48小时。
    5. 使用与步骤5.1.4中所述相同的荧光分光光度计测定荧光强度。以模拟感染的HEp-2细胞作为荧光背景水平的对照标准。

6. 利用 RSV-M2-1-GFP 重组病毒在体内表征 M2-1 的定位

注意： 步骤 6.1 和 6.2 需在无菌环境中进行，使用 II 级生物安全柜。

  1. 用完全培养基制备浓度为 5 × 105 个细胞/mL 的 HEp-2 细胞悬液。取 1.5 mL 细胞悬液接种于对 CO2 通透且适用于活细胞成像的 35 mm 培养皿中。
  2. 接种后次日，按步骤 3.3–3.5 所述方法，以 MOI 为 1 的 RSV-M2-1-GFP 病毒进行感染（吸除培养基，加入 500 µL 至 1 mL 接种液，在 37 °C 轻柔振荡孵育 2 h；随后吸除接种液，加入 1.5 mL 含 2% FCS 的 MEM 培养基）。将细胞置于 37 °C 和 5% CO2 条件下培养至所需时间（包涵体自感染后 10 h 开始出现）。
  3. 在将含有感染细胞的培养皿置于显微镜载物台前，预先将配备 40x 至 100x 物镜的倒置显微镜的培养腔加热至 37 °C。打开 CO2 供应，等待焦点稳定。
  4. 使用与 GFP 兼容的滤光片，在低激发强度和低成像频率（每分钟 1 至 0.1 帧）下进行成像，以最大程度减少光毒性。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究中，我们描述了一种产生表达荧光蛋白的重组呼吸道合胞病毒（RSV）的详细方案（图2）。在pRSV-GFP质粒中，GFP基因被插入P基因和M基因之间，其构建方式与先前发表文献中描述的Cherry基因插入方法相同21。在pRSV-M2-1-GFP质粒中，M2基因保持不变，并在SH基因和G基因之间插入一个额外的编码M2-1-GFP的基因12。第一步是在BSRT7/5细胞中拯救病毒，如图2A所示。转染后72小时，在对应于RSV-GFP和RSV-M2-1-GFP拯救的孔中可见少量绿色荧光细胞簇。在RSV-GFP感染的细胞中，荧光信号可同时出现在细胞质和细胞核中，这对应于游离GFP的表达。相比之下，在RSV-M2-1-GFP拯救实验中，仅可见细胞质内少量荧光点状结构，这对应于M2-1-GFP在包涵体（IBs）中的聚集。通常在此阶段不会观察到细胞病变效应（CPE）（如合...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种利用五个质粒拯救重组呼吸道合胞病毒（RSV）并进行扩增的方法。对病毒基因组进行操控的能力已彻底改变了病毒学研究，使得研究人员能够检测突变、表达额外基因或带有标签的病毒蛋白。本文描述并用作示例的RSV是一种表达报告基因的病毒，即RSV-GFP（未发表），其表达的M2-1蛋白与GFP标签融合12。RSV的拯救具有挑战性，需要反复实践。转染效率至关重要，取决于转染试剂的合理选择以及转染方案的预先优化。必须使用表达噬菌体T7 RNA聚合酶（T7 pol）的细胞，因为在大多数反向遗传学载体中，病毒cDNA位于T7 pol启动子的下游。另一种方法是通过痘苗病毒辅助病毒来表达T7 pol。然而，使用稳定表达T7 pol的细胞可避免分离两种病毒的需要，并防止痘苗病毒对RSV拯救过程可能产生的干扰。在进行反向遗传学操作的首次传代（P0至P1）时，应避免冻存接种物，以确保最高的拯救效率。这意味着感染复数（MOI）无法精确控制。但在该阶段，病毒滴度仍然非常低，因此首次传代的实际MOI较低。为了获得高感染性滴度（106–107 PFU/mL）的RSV储备液...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢阿斯利康（AstraZeneca）的秦宇博士&感谢美国马萨诸塞州波士顿市的 #38;D 公司提供 AZD4316 药物。作者感谢 Cymages 平台提供 ScanR Olympus 显微镜的使用权限，该设备获得了法兰西岛大区（DIM ONE HEALTH）资助项目的经费支持。作者同时感谢法国国家健康与医学研究院（INSERM）和凡尔赛-圣康坦大学的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
用于活细胞成像的 35 mm & 微型培养皿同比迪81156
A549ATCCATCC CCL-185
Avicel RC-591FMC 生物聚合物Avicel RC-591有关 Avicels 的技术和其他信息，请访问 http://www.fmcbiopolymer.com。在室温下储存。步骤 4 中的实验步骤针对该试剂进行了优化。
BSRT7/5未上市参见参考文献 22。Buchholz et al. 1999
结晶紫溶液SigmaHT90132
用于观察的荧光显微镜奥林巴斯IX73 奥林巴斯显微镜
视频显微镜的荧光显微镜奥林巴斯ScanR 奥林巴斯显微镜
HEp-2ATCCATCC CCL-23
HEPES ≥99.5%SigmaH3375
L-谷氨酰胺 （200 mM）ThermoFisher Scientific25030024
LIPOFECTAMINE 2000 试剂ThermoFisher Scientific11668019实验方案针对该试剂进行了优化。
MEM （10x），无谷氨酰胺ThermoFisher Scientific11430030
MEM，GlutaMAX 补充剂ThermoFisher Scientific41090-028
MgSO4 ReagentPlus 和 ge;99.5%SigmaM7506
Opti-MEM I 减血清培养基ThermoFisher Scientific51985-026
多聚甲醛水溶液，32%，EM 级电子显微镜科学15714
青霉素-链霉素 （10,000 U/mL）ThermoFisher Scientific15140122
质粒未上市参见参考文献 21。Rameix-Welti et al. 2014
参见 Saw RockerVWR444-0341
si、RNA、GAPDHDharmaconON-TARGETplus siRNA
D-001810-10-05		SMARTpool 和 Dharmacon 设计的 4 个单个 siRNA 中的 3 个。
Si RNA IMPDH2DharmaconON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human
L-004330-00-0005		Dharmacon 设计的 4 个单独 siRNA 的 SMARTpool.
单个参考和序列
J-004330-06：GGAAAGUUGCCCAUUGUAA;
J-004330-07： GCACGGCGCUUUGGUGUUC;
J-004330-08： AAGGGUCAAUCCACAAAUU;
J-004330-09： GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;
Si RNA RSV NDharmaconON-TARGETplus 定制 siRNAUUCAGAAGAACUAGAGGCUAU 和 UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA
SiRNA NTDharmaconON-TARGETplus 非靶向池
SiRNA 转染试剂DharmaconDharmaFECT 1 参考文献：T-2001-03步骤 5.1.和 5.1.2 中的方案针对该试剂进行了优化。
碳酸氢钠 7.5% 溶液ThermoFisher Scientific25080094
荧光分光光度计TecanTecan 无限M200PRO
用于步骤 2.3 中的 由

参考文献

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  1. Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
  2. Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults. The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).
  3. DeVincenzo, J. P., et al. Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).
  4. DeVincenzo, J. P., et al. Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).
  5. Afonso, C. L., et al. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016. Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).
  6. Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).
  7. Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).
  8. Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions. PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958(2010).
  9. Lahaye, X., et al. Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication. Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).
  10. Kolesnikova, L., Mühlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions. Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).
  11. Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment. European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).
  12. Rincheval, V., et al. Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus. Nature Communications. 8 (1), 563(2017).
  13. Santangelo, P. J., Bao, G. Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).
  14. Lifland, A. W., et al. Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS. Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).
  15. Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein. Virology. 195 (1), 243-247 (1993).
  16. Brown, G., et al. Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection. Virology. 338 (1), 69-80 (2005).
  17. Radhakrishnan, A., et al. Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).
  18. Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
  19. Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).
  20. Collins, P. L., et al. Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).
  21. Rameix-Welti, M. -A., et al. Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice. Nature Communications. 5, 5104(2014).
  22. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).
  23. Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).
  24. Derscheid, R. J., et al. Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells. Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).
  25. McKimm-Breschkin, J. L. A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus - direct visualization of plaques without immunostaining. Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).
  26. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 7, 1-7 (2006).
  27. Novina, C. D., Sharp, P. A. The RNAi revolution. Nature. 430 (6996), 161-164 (2004).
  28. Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. The structure of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors. Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).
  29. Beaucourt, S., Vignuzzi, M. Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance. Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).
  30. Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).
  31. Simões, E. A. F., et al. Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children. Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).
  32. Alvarez, R., et al. RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).
  33. DeVincenzo, J., et al. A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).
  34. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  35. Nikolic, J., et al. Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles. Nature Communications. 8 (1), 58(2017).

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