方法文章

重组呼吸道合胞病毒的制备、扩增与滴定

DOI：

10.3791/59218

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2019年4月4日

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1UMR 1173 Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université de Versailles St. Quentin, 2UR892 Institut national de la recherche agronomique (INRA), Unité de virologie et immunologie moléculaires, 3Assistance Publique–Hôpitaux de Paris (AP-HP), Hôpital Ambroise Paré, Laboratoire de Microbiologie

本文内容

摘要

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我们介绍了一种用于产生和扩增基因修饰的呼吸道合胞病毒（RSV）的方法，以及一种优化的RSV蚀斑检测法。我们通过构建两种重组病毒来演示该方案，这两种病毒分别可用于定量检测RSV的复制以及活体分析RSV包涵体及其相关颗粒的动态过程。

摘要

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重组病毒的使用在基础或应用病毒学研究中已变得至关重要。反向遗传学已被证明是一种极为强大的技术，既可用于解析病毒复制机制，也可用于抗病毒药物研究或疫苗开发平台的构建。然而，针对呼吸道合胞病毒（RSV）等负链RNA病毒构建和操作反向遗传系统仍然较为复杂，需要特殊的技术经验。RSV基因组为单链负义RNA，长度约为15 kb，可作为病毒RNA复制和转录的模板。我们的反向遗传系统采用人呼吸道合胞病毒长株（HRSV）基因组的cDNA拷贝。该cDNA以及编码聚合酶复合物病毒蛋白（L、P、N和M2-1）的cDNA均被插入独立的表达载体中，并置于T7聚合酶调控序列的控制之下。将这些元件转染至稳定表达T7聚合酶的BSR-T7/5细胞中，可实现重组RSV在细胞质内的复制和转录，从而产生基因修饰的病毒颗粒。新生成的RSV存在于BSR-T7/5细胞表面及其培养上清液中，收集后用于感染人HEp-2细胞以进行病毒扩增。通常需要经过两到三轮扩增，才能获得滴度为1 × 106 至 1 × 107 空斑形成单位（PFU）/mL的病毒储备液。本文详细描述了病毒储备液的最佳收获、冷冻保存及滴定方法。我们通过构建两种分别表达游离绿色荧光蛋白（GFP）（RSV-GFP）或GFP融合病毒M2-1蛋白（RSV-M2-1-GFP）的重组病毒，来演示本方案的应用。我们展示了如何利用RSV-GFP定量检测RSV的复制水平，以及如何通过视频显微技术利用RSV-M2-1-GFP在活细胞中可视化病毒结构和病毒蛋白的动态行为。

引言

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人呼吸道合胞病毒（RSV）是全球婴幼儿因急性呼吸道感染而住院的首要原因1。此外，RSV在成人中引起的疾病负担与流感相当，其中大部分住院和死亡病例集中在老年人群2。目前尚无针对RSV的疫苗或特异性抗病毒药物，但已有多种前景良好的新药正在研发中3,4。尽管当前已投入大量努力，但RSV增殖定量技术的复杂性和高操作难度仍严重阻碍了抗病毒药物和疫苗的开发。体外定量RSV增殖通常依赖于耗时、费力且昂贵的方法，主要包括显微镜下观察细胞病变效应、免疫染色、空斑减少实验、定量逆转录（qRT）-聚合酶链式反应（PCR）以及酶联免疫吸附测定。携带经修饰基因组并表达报告基因（如编码绿色荧光蛋白GFP的基因）的病毒更适用于此类筛选。结合自动化酶标仪的使用，携带报告基因的重组病毒可使这些检测方法更易于标准化，并适用于高通量筛选。

呼吸道合胞病毒（RSV）是一种有包膜的、非分段的负链RNA病毒，属于Mononegavirales目下的Pneumoviridae科Orthopneumovirus属5。RSV基因组为约15 kb的单链负义RNA，其3'和5'末端分别含有称为Leader和Traile....

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方案

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1. 材料准备

  1. 购买细胞培养基（减血清培养基、最低必需培养基 [MEM]、10x MEM 以及 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 [DMEM]）、转染试剂和微晶纤维素（参见材料表）。
  2. 获取用于反向遗传学的以下载体：基因组载体和编码 N 蛋白及聚合酶复合物蛋白的表达载体。基因组载体包含位于噬菌体 T7 RNA 聚合酶（T7 pol）启动子下游的 RSV-GFP（p-RSV-GFP）和 RSV-M2-1GFP（p-RSV-M2-1GFP）的全长 cDNA 基因组。表达载体（分别命名为 p-N、p-P、p-L 和 p-M2-1）包含 N、P、L 或 M2-1 编码序列，位于 T7 pol 启动子下游（有关质粒构建的详细信息，请参见 Rincheval 等12 和 Rameix-Welti 等21）。
  3. 在无菌环境中配制用于细胞培养、转染和感染的培养基。使用添加了 10% 胎牛血清（FCS）、1,000 单位/mL 青霉素和 1 mg/mL 链霉素（或不含抗生素）的 DMEM，并补充 2 mM L-谷氨酰胺；另配制添加了 2 mM L-谷氨酰胺以及 0%、2% 或 10% FCS、1,000 单位/mL 青霉素和 1 mg/mL 链霉素的 MEM，在后续实验方案中统称为“完全培养基”。
  4. 获取 BSRT7/5

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结果

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本研究中，我们描述了一种产生表达荧光蛋白的重组呼吸道合胞病毒（RSV）的详细方案（图2）。在pRSV-GFP质粒中，GFP基因被插入P基因和M基因之间，其构建方式与先前发表文献中描述的Cherry基因插入方法相同21。在pRSV-M2-1-GFP质粒中，M2基因保持不变，并在SH基因和G基因之间插入一个额外的编码M2-1-GFP的基因12。第一步是在BSRT7/5细胞中拯救病毒，如图2A所示。转染后72小时，在对应于RSV-GFP和RSV-M2-1-GFP拯救的孔中可见少量绿色荧光细胞簇。在RSV-GFP感染的细胞中，荧光信号可同时出现在细胞质和细胞核中，这对应于游离GFP的表达。相比之下，在RSV-M2-1-GFP拯救实验中，仅可见细胞质内少量荧光点状结构，这对应于M2-1-GFP在包涵体（IBs）中的聚集。通常在此阶段不会观察到细胞病变效应（CPE）（如合.......

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讨论

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本文介绍了一种利用五个质粒拯救重组呼吸道合胞病毒（RSV）并进行扩增的方法。对病毒基因组进行操控的能力已彻底改变了病毒学研究，使得研究人员能够检测突变、表达额外基因或带有标签的病毒蛋白。本文描述并用作示例的RSV是一种表达报告基因的病毒，即RSV-GFP（未发表），其表达的M2-1蛋白与GFP标签融合12。RSV的拯救具有挑战性，需要反复实践。转染效率至关重要，取决于转染试剂的合理选择以及转染方案的预先优化。必须使用表达噬菌体T7 RNA聚合酶（T7 pol）的细胞，因为在大多数反向遗传学载体中，病毒cDNA位于T7 pol启动子的下游。另一种方法是通过痘苗病毒辅助病毒来表达T7 pol。然而，使用稳定表达T7 pol的细胞可避免分离两种病毒的需要，并防止痘苗病毒对RSV拯救过程可能产生的干扰。在进行反向遗传学操作的首次传代（P0至P1）时，应避免冻存接种物，以确保最高的拯救效率。这意味着感染复数（MOI）无法精确控制。但在该阶段，病毒滴度仍然非常低，因此首次传代的实际MOI较低。为了获得高感染性滴度（106–107 PFU/mL）的RSV储备液.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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作者感谢阿斯利康（AstraZeneca）的秦宇博士&感谢美国马萨诸塞州波士顿市的 #38;D 公司提供 AZD4316 药物。作者感谢 Cymages 平台提供 ScanR Olympus 显微镜的使用权限，该设备获得了法兰西岛大区（DIM ONE HEALTH）资助项目的经费支持。作者同时感谢法国国家健康与医学研究院（INSERM）和凡尔赛-圣康坦大学的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
用于活细胞成像的 35 mm & 微型培养皿同比迪81156
A549ATCCATCC CCL-185
Avicel RC-591FMC 生物聚合物Avicel RC-591有关 Avicels 的技术和其他信息，请访问 http://www.fmcbiopolymer.com。在室温下储存。步骤 4 中的实验步骤针对该试剂进行了优化。
BSRT7/5未上市参见参考文献 22。Buchholz et al. 1999
结晶紫溶液SigmaHT90132
用于观察的荧光显微镜奥林巴斯IX73 奥林巴斯显微镜
视频显微镜的荧光显微镜奥林巴斯ScanR 奥林巴斯显微镜
HEp-2ATCCATCC CCL-23
HEPES ≥99.5%SigmaH3375
L-谷氨酰胺 （200 mM）ThermoFisher Scientific25030024
LIPOFECTAMINE 2000 试剂ThermoFisher Scientific11668019实验方案针对该试剂进行了优化。
MEM （10x），无谷氨酰胺ThermoFisher Scientific11430030
MEM，GlutaMAX 补充剂ThermoFisher Scientific41090-028
MgSO4 ReagentPlus 和 ge;99.5%SigmaM7506
Opti-MEM I 减血清培养基ThermoFisher Scientific51985-026
多聚甲醛水溶液，32%，EM 级电子显微镜科学15714
青霉素-链霉素 （10,000 U/mL）ThermoFisher Scientific15140122
质粒未上市参见参考文献 21。Rameix-Welti et al. 2014
参见 Saw RockerVWR444-0341
si、RNA、GAPDHDharmaconON-TARGETplus siRNA
D-001810-10-05		SMARTpool 和 Dharmacon 设计的 4 个单个 siRNA 中的 3 个。
Si RNA IMPDH2DharmaconON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human
L-004330-00-0005		Dharmacon 设计的 4 个单独 siRNA 的 SMARTpool.
单个参考和序列
J-004330-06：GGAAAGUUGCCCAUUGUAA;
J-004330-07： GCACGGCGCUUUGGUGUUC;
J-004330-08： AAGGGUCAAUCCACAAAUU;
J-004330-09： GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;
Si RNA RSV NDharmaconON-TARGETplus 定制 siRNAUUCAGAAGAACUAGAGGCUAU 和 UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA
SiRNA NTDharmaconON-TARGETplus 非靶向池
SiRNA 转染试剂DharmaconDharmaFECT 1 参考文献：T-2001-03步骤 5.1.和 5.1.2 中的方案针对该试剂进行了优化。
碳酸氢钠 7.5% 溶液ThermoFisher Scientific25080094
荧光分光光度计TecanTecan 无限M200PRO
用于步骤 2.3 中的 由

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
  2. Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E.

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标签

BSR T7 5 HEp 2 GFP

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