小鼠玻璃体血管的评估与表征

摘要

本方案描述了体内和离体方法，利用光学相干断层扫描和眼底荧光素血管造影对活体小鼠眼内的玻璃体血管（作为血管退化的一个模型）进行完整可视化和表征，并通过离体分离及后续的玻璃体血管平铺制备，实现定量分析。

摘要

在眼部，胚胎期的玻璃体血管为晶状体和视网膜的发育提供营养，并在视网膜血管发育完成后退化。若玻璃体血管未能正常退化或持续存在，则可见于如持续性原始玻璃体增生症（PHPV）等疾病，导致光路受阻并影响视觉功能。深入了解玻璃体血管退化的分子机制，有助于揭示血管退化过程的分子基础，并为治疗玻璃体血管持续存在的相关疾病提供新的策略。本文描述了在活体小鼠中利用光学相干断层扫描（OCT）和眼底荧光素血管造影（FFA）对玻璃体血管进行成像的方法，以及体外分离并平铺玻璃体血管以进行定量分析的详细技术流程。实验中采用低密度脂蛋白受体相关蛋白5（LRP5）基因敲除小鼠作为玻璃体血管持续存在的模型，以展示这些技术的应用。综合而言，这些技术可促进将玻璃体血管作为血管退化研究的实验模型，并推动对玻璃体血管持续存在机制的深入研究。

引言

眼睛的血液供应对于确保视网膜及周围眼组织的正常发育以及实现正常的视觉功能至关重要。眼睛中存在三个血管床：视网膜血管系统、脉络膜以及一个短暂存在的胚胎期玻璃体血管循环网络。眼内血管系统的发育需要在胚胎发生和组织成熟过程中实现精确的时空协调。在这三个血管床中，玻璃体血管系统是最早发挥功能的血液供应系统，可为新形成的胚胎晶状体和正在发育的视网膜提供营养和氧气。随着视网膜血管的发育与成熟，玻璃体血管同时发生退化¹。玻璃体血管的退化对于形成清晰的视觉通路、促进视觉功能的建立至关重要；因此，这一血管退化过程与视网膜血管的生长同样重要。玻璃体血管退化障碍可能导致眼部疾病。此外，玻璃体血管的退化为研究调控血管退化的细胞与分子机制提供了一个模型系统，相关机制也可能对其他器官的血管生成调控具有借鉴意义。

玻璃体血管系统起源于玻璃体动脉（HA），由玻璃体动脉主干（VHP）、晶状体血管膜（TVL）和瞳孔膜（PM）组成。在胚胎发育过程中，该系统为发育中的视网膜、初级玻璃体以及晶状体提供营养²。VHP 自 HA 发出后，向前穿过玻璃体延伸至晶状体。TVL 包裹晶状体囊的后表面，并与 PM 吻合；PM 连接前睫状动脉，覆盖晶状体的前表面^2,3，从而在 PM 内形成血管网络

方案

所有动物实验均遵循眼科与视觉研究中动物使用的研究视觉协会（ARVO）声明，并遵守美国国立卫生研究院（NIH）关于实验操作中动物护理与使用的指南，以及波士顿儿童医院机构动物护理与使用委员会（IACUC）制定的规定。Lrp5^-/- 小鼠（货号 005823；Jackson Laboratory）及其野生型（WT）对照 C57BL/6J 小鼠（货号 000664；Jackson Laboratory）被用于本研究。

第一部分：利用啮齿类动物视网膜成像系统对玻璃体血管进行活体成像

1. 小鼠麻醉与瞳孔扩张的准备
   1. 选择小鼠。
      1. 用于视网膜成像的小鼠应大于出生后第12天（P12，即睁眼后）；两性均适用。
      2. 可根据需要，在成年期对具有延迟玻璃体动脉退化表型的突变小鼠（及其野生型对照）进行成像。超过3周龄的野生型小鼠可能残留的玻璃体动脉已难以检测，因此P12–P21是成像观察野生型小鼠可见残留玻璃体动脉的理想时期。
   2. 配制用于麻醉的氯胺酮/赛拉嗪混合液。
      1. 取2.3 mL氯胺酮储备液（100 mg/mL）和0.7 mL赛拉嗪储备液（20 mg/mL），加入20 mL无菌生理盐水（0.9%氯化钠），配制成工作浓度为氯胺酮10 mg/mL、赛拉嗪0.6 mg....

结果

活体小鼠玻璃体血管的活体成像
图3A 显示3月龄野生型（WT）和突变型小鼠视网膜及玻璃体组织的OCT图像横截面视图 Lrp5^-/- 小鼠，一种具有持续性玻璃体动脉的动物模型。野生型眼球显示无玻璃体组织残留，而 Lrp5^-/- 眼内可见两条源自视神经乳头的持续性玻璃体血管。 图3B 显示6周龄小鼠荧光视野中持续存在的玻璃体动脉（绿色）的FFA图像 Lrp5^-/- 小鼠。野生型小鼠未见残余的玻璃体血管， Lrp5^-/- 小鼠玻璃体中显示出八支玻璃体动脉分支。

玻璃体血管的离体可视化
图4.......

讨论

评估和表征玻璃体血管的技术是观察动物模型中玻璃体血管退化的直观且必要的方法，有助于研究发育过程中血管退化的潜在机制。尽管活体视网膜成像技术可对同一动物进行玻璃体血管退化的纵向观察，但获取用于光学相干断层扫描（OCT）和荧光素眼底血管造影（FFA）的啮齿类动物眼底成像系统可能受到限制。此外，在小鼠睁眼之前，无法对其实施活体成像，因此该方法不适用于新生儿阶段的眼部发育研究。另一方面，虽然对离体眼球进行切片成像可用于任何年龄段的小鼠，且技术门槛较低，但当可见的玻璃体血管数量较少时，该方法难以实现定量分析，且获得理想图像的概率在很大程度上取决于切片角度（图5）。相比之下，将玻璃体血管分离并进行平铺整体染色成像，可实现对整个玻璃体血管系统的完整成像和精确量化，但由于玻璃体血管结构精细且脆弱，该方法可能存在一定的技术挑战。我们希望本文详述的实验方案有助于克服这些困难。

透明质酸膜分离方案中的几个关键步骤包括明胶溶液的注射、视网膜的去除以及最终的平铺封片。操作透明质酸血管的技术难点在于其结构极为脆弱、血管所处的玻璃体近乎液态，以及其与邻.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AK-Fluor（荧光素注射液，USP）	Akorn	17478-253-10
抗CD31抗体	Abcam	ab28364
抗荧光淬灭封片剂	Thermo Fisher	S2828
含DAPI的抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories	H-1200
人工泪液滴眼液	Systane	N/A
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A2058
C57BL/6J小鼠	杰克逊实验室（The Jackson Laboratory）	库存编号：000664
氯化钙（CaCl₂）	Sigma-Aldrich	C1016
冷冻切片机	Leica	CM3050S
冷冻切片机	Leica	CM3050 S
盐酸环戊通和盐酸去氧肾上腺素滴眼液	Cyclomydril	N/A
明胶	Sigma-Aldrich	G9382
山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488标记	ThermoFisher Scientific	A-11008
加热板	Lab-Line Instruments Inc.	N/A
异凝集素GS-IB4，594标记	ThermoFisher Scientific	I21413
盐酸氯胺酮注射液	KetaVed	NDC 50989-996-06
Lrp5-/-小鼠	杰克逊实验室（The Jackson Laboratory）	库存编号：005823	由美国加利福尼亚州圣马特奥市Deltagen公司研发
Micron IV和OCT	Phoenix Research Labs	N/A	成像软件：InSight
显微镜	Zeiss	discovery v8
显微外科镊	Scanlan International	4004-05
显微外科剪	Scanlan International	6006-44
最佳切割温度包埋剂（OCT）	Tissue-Tek	4583
最佳切割温度包埋剂（OCT）	Agar Scientific	AGR1180
多聚甲醛（16%）	Electron Microscopy Sciences	15710
一次性可剥离包埋模具（组织模具）	Fisher Scientific	12-20
磷酸盐缓冲液（PBS）缓冲液（10X）	Teknova	P0496
载玻片盖玻片	Premiere	94-2222-10
Superfrost载玻片	Fisherbrand	12-550-15
吐温X-100（Triton X-100）	Sigma-Aldrich	X100
无菌赛拉嗪溶液	Akorn: AnaSed	NDC: 59399-110-20