本方案描述了体内和离体方法，利用光学相干断层扫描和眼底荧光素血管造影对活体小鼠眼内的玻璃体血管（作为血管退化的一个模型）进行完整可视化和表征，并通过离体分离及后续的玻璃体血管平铺制备，实现定量分析。
本文内容
摘要
摘要
在眼部，胚胎期的玻璃体血管为晶状体和视网膜的发育提供营养，并在视网膜血管发育完成后退化。若玻璃体血管未能正常退化或持续存在，则可见于如持续性原始玻璃体增生症（PHPV）等疾病，导致光路受阻并影响视觉功能。深入了解玻璃体血管退化的分子机制，有助于揭示血管退化过程的分子基础，并为治疗玻璃体血管持续存在的相关疾病提供新的策略。本文描述了在活体小鼠中利用光学相干断层扫描（OCT）和眼底荧光素血管造影（FFA）对玻璃体血管进行成像的方法，以及体外分离并平铺玻璃体血管以进行定量分析的详细技术流程。实验中采用低密度脂蛋白受体相关蛋白5（LRP5）基因敲除小鼠作为玻璃体血管持续存在的模型，以展示这些技术的应用。综合而言，这些技术可促进将玻璃体血管作为血管退化研究的实验模型，并推动对玻璃体血管持续存在机制的深入研究。
引言
眼睛的血液供应对于确保视网膜及周围眼组织的正常发育以及实现正常的视觉功能至关重要。眼睛中存在三个血管床：视网膜血管系统、脉络膜以及一个短暂存在的胚胎期玻璃体血管循环网络。眼内血管系统的发育需要在胚胎发生和组织成熟过程中实现精确的时空协调。在这三个血管床中，玻璃体血管系统是最早发挥功能的血液供应系统，可为新形成的胚胎晶状体和正在发育的视网膜提供营养和氧气。随着视网膜血管的发育与成熟，玻璃体血管同时发生退化1。玻璃体血管的退化对于形成清晰的视觉通路、促进视觉功能的建立至关重要；因此，这一血管退化过程与视网膜血管的生长同样重要。玻璃体血管退化障碍可能导致眼部疾病。此外，玻璃体血管的退化为研究调控血管退化的细胞与分子机制提供了一个模型系统，相关机制也可能对其他器官的血管生成调控具有借鉴意义。
玻璃体血管系统起源于玻璃体动脉（HA），由玻璃体动脉主干（VHP）、晶状体血管膜（TVL）和瞳孔膜（PM）组成。在胚胎发育过程中，该系统为发育中的视网膜、初级玻璃体以及晶状体提供营养2。VHP 自 HA 发出后，向前穿过玻璃体延伸至晶状体。TVL 包裹晶状体囊的后表面，并与 PM 吻合；PM 连接前睫状动脉，覆盖晶状体的前表面2,3，从而在 PM 内形成血管网络3,4,5。有趣的是，玻璃体血管系统中不存在静脉，其静脉回流依赖脉络膜静脉完成。
在人类胚胎中，玻璃体血管系统大约在妊娠第九周时基本发育完全，当视网膜血管在妊娠第四个月开始出现时，该系统即启动退化过程2。退化过程首先从玻璃体动脉（VHP）萎缩开始，随后依次发生临时玻璃体层（TVL）、晶状体后膜（PM）的毛细血管网以及最后是玻璃体动脉（HA）的退化2,3。与此同时，初级玻璃体发生回缩，次级玻璃体开始形成，其主要成分为包括胶原纤维在内的细胞外基质。至妊娠第六个月时，初级玻璃体退化为一条从视神经盘延伸至晶状体的细小透明管道，称为Cloquet管或玻璃体管，而次级玻璃体则成为眼后段的主要组成部分2,3。玻璃体循环系统大多在妊娠35至36周、出生前基本消失3。
与出生时玻璃体血管系统已完全退化的人类不同，小鼠的玻璃体血管系统在出生后才开始退化。由于小鼠视网膜出生时无血管，视网膜血管在出生后发育，而玻璃体血管则从出生后第4天（P4）开始同时退化，并在P21时基本完全退化6（图1）。初级玻璃体膜（PM）首先在P10至P12之间消失，次级玻璃体血管丛（VHP）在P12至P16之间消失，而少数终末玻璃体小动脉（TVL）和玻璃体动脉（HA）细胞即使在P16时仍可残留，到P21时玻璃体血管系统的退化已基本完成6。与此同时，视网膜血管系统在出生后开始发育：血管丛的表层在P7–P8时完全延伸至周边视网膜，深层（位于外丛状层）在P7–P12期间发育，最终中间层（位于内丛状层）在P12至P15之间形成7。随着视网膜血管的发育，其逐渐取代了同步退化的玻璃体血管功能，为发育中的眼球提供营养和氧气。小鼠出生后玻璃体血管退化的这一过程为研究玻璃体血管系统以及生理性与病理性条件下调控血管退化的分子机制提供了一个易于操作的实验模型8。
玻璃体动脉退化失败可见于永存原始玻璃体增生症（PHPV）等疾病，PHPV 是一种罕见的先天性眼部发育异常，由胚胎期初级玻璃体及玻璃体动脉系统退化失败或不完全退化所致9。调控玻璃体血管系统退化过程的机制十分复杂，且已被广泛研究。其中，Wnt 信号通路是介导玻璃体血管正常退化的关键分子通路之一10，因为该通路中 Wnt 配体及其受体的基因突变已被证实与人类 PHPV 相关9。实验研究发现，一种 Wnt 配体 Wnt7b 由发育中眼球内玻璃体血管周围的巨噬细胞产生，通过与邻近内皮细胞上的受体 frizzled4（FZD4）/LRP5 结合，激活 Wnt 信号通路，诱导细胞凋亡，从而启动玻璃体血管的退化过程10。因此，Wnt7b 缺陷型小鼠表现出玻璃体血管持续存在10。类似地，一种非经典 Wnt 配体 Norrin（由 Ndp 基因编码）也可与 FZD4/LRP5 受体结合，在发育过程中诱导玻璃体血管退化。Ndpy/-、Lrp5-/- 和 Fzd4-/- 小鼠均表现出玻璃体血管退化延迟，进一步支持 Wnt 信号通路在该过程中的关键调控作用11,12,13,14,15,16。此外，另一种 Wnt 共受体 LRP6 在玻璃体血管内皮细胞中调节 Wnt 信号通路的功能上与 LRP5 存在功能重叠17。其他可能参与玻璃体血管退化的因素还包括缺氧诱导因子18,19、血管内皮生长因子20,21、胶原蛋白-1822,23、Arf24、血管生成素-225 和骨形态发生蛋白-426。本文中，我们采用 Lrp5-/- 小鼠作为玻璃体血管持续存在的模型，展示通过活体（in vivo）和离体（ex vivo）方法评估与表征玻璃体血管系统的实验技术。
活体及离体可视化玻璃体血管系统对于研究玻璃体血管退化机制至关重要。目前观察玻璃体血管系统的方法主要集中在通过光学相干断层扫描（OCT）和荧光素眼底血管造影（FFA）图像、眼球横切片以及玻璃体血管平铺标本对玻璃体动脉（VHP）和玻璃体动脉（HA）进行可视化与分析。OCT与FFA是强大的活体成像工具，可在动物睁眼后对其在活体状态下进行纵向观察。此外，分离制备的玻璃体血管平铺标本可实现对整个玻璃体血管系统的可视化，并为血管数量的精确量化提供手段。然而，由于玻璃体血管结构精细且脆弱，其分离技术难度较高，这在一定程度上限制了该方法在眼科研究中的广泛应用。10,17,27本文提供了一种可视化玻璃体血管的详细方案，结合活体视网膜成像与离体玻璃体平铺标本技术，以提高这些技术的可行性。本方案在既往关于活体眼底成像及光学相干断层扫描（OCT）成像方法的基础上进行了修改与拓展。28 和 的 离体分离玻璃体扁平铺片法11.
方案
所有动物实验均遵循眼科与视觉研究中动物使用的研究视觉协会（ARVO）声明，并遵守美国国立卫生研究院（NIH）关于实验操作中动物护理与使用的指南，以及波士顿儿童医院机构动物护理与使用委员会（IACUC）制定的规定。Lrp5-/- 小鼠（货号 005823；Jackson Laboratory）及其野生型（WT）对照 C57BL/6J 小鼠（货号 000664；Jackson Laboratory）被用于本研究。
第一部分：利用啮齿类动物视网膜成像系统对玻璃体血管进行活体成像
- 小鼠麻醉与瞳孔扩张的准备
- 选择小鼠。
- 用于视网膜成像的小鼠应大于出生后第12天（P12，即睁眼后）；两性均适用。
- 可根据需要，在成年期对具有延迟玻璃体动脉退化表型的突变小鼠（及其野生型对照）进行成像。超过3周龄的野生型小鼠可能残留的玻璃体动脉已难以检测，因此P12–P21是成像观察野生型小鼠可见残留玻璃体动脉的理想时期。
- 配制用于麻醉的氯胺酮/赛拉嗪混合液。
- 取2.3 mL氯胺酮储备液（100 mg/mL）和0.7 mL赛拉嗪储备液（20 mg/mL），加入20 mL无菌生理盐水（0.9%氯化钠），配制成工作浓度为氯胺酮10 mg/mL、赛拉嗪0.6 mg/mL的混合溶液。
- 通过腹腔注射给予氯胺酮/赛拉嗪混合液，剂量为每克体重8 μL（例如，一只20 g的小鼠需注射160 μL工作液，以达到氯胺酮80 mg/kg体重、赛拉嗪4.8 mg/kg体重的给药剂量）。
- 麻醉后立即在每只眼睛中滴加一滴扩瞳药物溶液（见材料表），以扩张小鼠瞳孔。
- 通过足底反射（用力捏后肢脚趾）评估麻醉深度。待小鼠完全麻醉（无足底反射）且瞳孔充分散大后方可进行后续操作。
- 选择小鼠。
- 玻璃体动脉的光学相干断层扫描成像
- 使用人工泪液润湿小鼠角膜，然后将小鼠放置于定位台上。
- 轻柔地将OCT探头镜头接触小鼠角膜。调整小鼠与探头位置，使视神经乳头位于眼底图像视野中央，以引导OCT成像。
注：有关啮齿类动物视网膜成像系统（见材料表）的一般设置及小鼠体位调整的更多细节，请参阅Gong等人的研究28。 - 调节焦距，以获得最佳OCT图像。
- 调整OCT成像软件中指示线的角度（见材料表），以清晰显示持续存在的玻璃体动脉，随后采集图像。
- 玻璃体动脉的眼底荧光素血管造影成像
- 配制荧光素溶液：将1 mL荧光素原液（储备浓度：100 mg/mL）加入9 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，最终工作液浓度为10 mg/mL。
- 按每克体重5 μL的剂量腹腔注射荧光素工作液。
- 使用人工泪液润湿小鼠角膜，然后将小鼠放置于定位台上。
- 将Micron IV视网膜成像显微镜的镜头轻柔直接接触小鼠角膜。轻微调整对位，使视神经乳头位于视野中心。
- 将显微镜滤光片切换至绿色荧光通道。
- 聚焦于持续存在的玻璃体动脉并采集图像。
- 在注射后1分钟、3分钟、5分钟和10分钟（不超过10分钟）时多次拍摄图像，以确定观察玻璃体动脉的最佳时间点（信噪比最高）。FFA操作应在10分钟内完成，否则荧光素扩散过度将导致血管不可见。
- 小鼠麻醉后的恢复
- 操作结束后，将小鼠置于温热的加热垫上保温。
- 待小鼠恢复自主活动能力后，将其放回饲养笼中。
2. 第二部分：玻璃体血管的离体可视化
- 固定小鼠眼球的制备
- 选择合适年龄的小鼠。
注意：新生小鼠通常在出生后第8天（P8）处死以进行玻璃体动脉系统（hyaloid）解剖。雌雄小鼠均可使用。对于玻璃体动脉退化延迟的突变小鼠（及其相应的野生型对照），可在成年期持续进行解剖与分析。 - 通过暴露于CO2处死小鼠。
- 通过钝性解剖摘除小鼠眼球。
- 使用显微外科镊子充分打开眼睑，以便接触眼球。将弯曲的显微外科镊子置于眼眶内的眼球下方，夹住视神经，避免挤压眼球。轻柔地用镊子拉出并移除眼球。
- 或者，使用显微外科剪刀沿眼球四侧向眼眶后方小心地平行剪切，将眼球与其周围的结缔组织分离。
- 将眼球浸入含4%多聚甲醛的PBS缓冲液中，在室温下固定30分钟。
- 将固定后的眼球转移至冰上预冷的PBS缓冲液中。
注意：眼球可在4 °C的PBS中保存最多1周。
- 选择合适年龄的小鼠。
- 通过明胶注射包埋玻璃体动脉系统
- 配制5%（w/v）的明胶溶液。
- 称取50 mg明胶。
- 将明胶溶解于1 mL蒸馏水中。
- 将明胶溶液置于37 °C水浴中孵育至完全溶解。使用前保持溶液在37 °C水浴中。
注意：可配制更大批次的溶液，分装后于4 °C保存。每次使用前需在37 °C水浴中加热，使其恢复澄清状态。
- 在解剖显微镜下，于角膜缘处向玻璃体腔内注射50 μL明胶溶液；在角膜缘周围不同位置重复注射3次，共进行4次注射，确保注射点均匀分布（图2A）。
- 将眼球置于4 °C冰箱或冰上孵育30分钟，使注入的明胶在玻璃体腔内凝固。
- 配制5%（w/v）的明胶溶液。
- 玻璃体动脉系统的解剖与分离
注意：参见图2B-E。- 将眼球置于含有PBS的培养皿中，防止组织干燥。在角膜缘处用显微外科剪刀做切口，移除角膜。
- 剪断并移除视神经。
- 在解剖显微镜下，使用两对镊子剥离并弃去巩膜、脉络膜和视网膜色素上皮（RPE）层，并移除虹膜。
- 将视网膜的视神经侧朝上、晶状体侧朝下，向视网膜杯下方注射50 μL PBS，使PBS缓冲液积聚在明胶化的玻璃体与视网膜之间。
- 用显微外科镊子轻柔地剥离并移除视网膜杯和睫状体。
- 使用移液器将含有浸于PBS中的玻璃体动脉组织的明胶杯转移至载玻片上。
- 将剩余组织（晶状体/玻璃体动脉）翻转，使晶状体侧朝上。
- 提起晶状体，轻柔松解晶状体/晶状体悬韧带（TVL）与玻璃体动脉壶腹（VHP）之间的连接，然后用显微外科剪刀剪断玻璃体动脉（HA），移除晶状体-TVL复合体。保留VHP部分的玻璃体动脉杯用于平铺制片。
- 玻璃体动脉系统的平铺与染色
- 在载玻片上用PBS轻柔冲洗玻璃体动脉杯，去除所有解剖残留物。
- 确保玻璃体动脉杯在载玻片上浮于足量的PBS溶液中。
- 用显微外科镊子轻柔调整明胶化玻璃体动脉杯的位置，使其杯缘朝下载玻片下方，以确保融化后获得最佳形态。
- 将含有浸于PBS中的玻璃体动脉杯的载玻片置于37 °C的加热板上，等待明胶融化、玻璃体动脉展平，当载玻片即将干燥时（切勿过度干燥）取出。
- （可选）对玻璃体动脉进行免疫染色
- 配制封闭与通透缓冲液（例如含5%牛血清白蛋白[BSA]和0.1% Triton X-100的PBS缓冲液）。在平铺的玻璃体动脉样本上加入50 μL封闭缓冲液，室温孵育30分钟。
- 在玻璃体动脉平铺样本上加入50 μL一抗（例如CD31）（以封闭缓冲液按1:100稀释），然后在湿盒中4 °C孵育过夜。
- 用PBS轻柔冲洗3次，每次5分钟。
- 在玻璃体动脉平铺样本上加入50 μL二抗（例如山羊抗兔二抗-Alexa 488，1:100稀释），室温孵育1小时。
- 用PBS轻柔冲洗3次，每次5分钟。
- 加入一滴含DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚）的抗荧光淬灭封片剂，以染色玻璃体动脉中的细胞核。
- 轻柔地盖上盖玻片，完成平铺制片。
- 平铺玻璃体动脉的成像与定量分析
- 使用荧光显微镜对玻璃体动脉的DAPI染色进行成像，确保中央玻璃体动脉（HA）可见（排除无HA的样本）。
- 识别直接源自HA的血管分支，并手动计数血管分支数量以进行定量分析。
- 眼球横切面中玻璃体动脉的可视化
- 将固定后的眼球包埋于适宜组织模具中的最佳切割温度（OCT）包埋剂中，然后将包埋的眼球置于干冰上冷冻，或保存于-20 °C冰箱中。
- 使用冷冻切片机在-20 °C条件下将包埋的眼球切成12 μm厚的横切面。
- 通过轻轻接触组织切片，将其收集到室温的载玻片上，切片会自然黏附于载玻片。
- 空气干燥约30分钟以脱水组织切片，之后可保存于-20 °C冰箱中，待染色时取出。
- 用PBS冲洗载玻片1次，去除残留的OCT包埋剂。
- （可选）如需额外固定，可在室温下将载玻片浸入适当的固定缓冲液（例如含4%多聚甲醛的PBS）中15分钟。
- 在室温下用含0.1% Triton X-100的PBS对组织进行通透处理30分钟。
- 配制用于血管染色的异凝集素-IB4染色缓冲液。
- 在50 mL离心管中，将异凝集素-IB4（500 μg）粉末用50 mL PBS溶解并重悬。
- 将50 μL的1 M CaCl2溶液逐滴缓慢加入50 mL PBS/异凝集素-IB4混合液中。此步骤需缓慢进行，以防沉淀。最终CaCl2浓度为1 μM。Ca2+的存在是异凝集素-IB4染色所必需的。
- 在载玻片上的眼球横切面上加入30 μL异凝集素-IB4染色缓冲液，在湿盒中4 °C孵育过夜。
- 用PBS冲洗3次，每次5分钟。
- 加入一滴含DAPI的抗荧光淬灭封片剂，以染色切片中的细胞核。
- 轻柔地盖上盖玻片，完成平铺制片。
- 在显微镜下观察组织，确认眼杯内玻璃体动脉的存在。
结果
活体小鼠玻璃体血管的活体成像
图3A 显示3月龄野生型（WT）和突变型小鼠视网膜及玻璃体组织的OCT图像横截面视图 Lrp5-/- 小鼠，一种具有持续性玻璃体动脉的动物模型。野生型眼球显示无玻璃体组织残留，而 Lrp5-/- 眼内可见两条源自视神经乳头的持续性玻璃体血管。 图3B 显示6周龄小鼠荧光视野中持续存在的玻璃体动脉（绿色）的FFA图像 Lrp5-/- 小鼠。野生型小鼠未见残余的玻璃体血管， Lrp5-/- 小鼠玻璃体中显示出八支玻璃体动脉分支。
玻璃体血管的离体可视化
图4A,B 展示了在平铺标本中观察到的分离玻璃体血管，其中血管细胞及相关巨噬细胞的细胞核经DAPI染色呈蓝色。每张图像中央为玻璃体动脉（HA），玻璃体血管则表现为DAPI染色形成的不连续线条，每条线代表一条玻璃体血管丛（VHP）的血管。在Lrp5-/-小鼠中，于出生后第8天（P8）的平铺标本中可见更多的残留玻璃体血管（图4A）。野生型（WT）小鼠在P8时平均有12支玻璃体血管分支，而同龄的Lrp5-/-幼鼠则约有25支玻璃体血管分支，表明玻璃体血管系统退化显著受阻（图4B）。此外，在Lrp5-/-幼鼠中还观察到视网膜血管发育延迟且不完全，这是常与持续存在的玻璃体血管相关的另一特征（图4C,D）。图5 显示了在P8时Lrp5-/-眼球横切面上残留的玻璃体血管，而野生型眼球中则未见玻璃体血管。
图1：小鼠眼球中玻璃体血管系统发育退化的示意图。玻璃体血管及其分支，包括VHP、TVL和PM，均起源于HA，在出生时（P0）占据晶状体与未成熟视网膜之间的大部分空间。小鼠玻璃体血管的退化最早始于P4，此时PM毛细血管开始退化。到P8时，PM、VHP和TVL各层持续退化，与此同时视网膜表层血管已完全形成。到P12时，PM层的退化已完成，而VHP和TVL的萎缩仍在进行中。在此期间，视网膜深层血管开始于P7至P12之间形成。到P16时，玻璃体系统的退化部分完成（仅残留TVL血管和HA），视网膜中间层血管丛继续发育。到P21时，视网膜血管系统完全成熟，取代玻璃体血管承担滋养视网膜组织的功能，此时玻璃体血管已基本退化。P21时，玻璃体在无玻璃体血管的情况下形成清晰的视觉通路。红色虚线表示正在退化的血管。VHP = vasa hyaloidea propria；TVL = tunica vasculosa lentis；PM = pupillary membrane；HA = hyaloid artery。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：体外平铺观察透明质血管系统分离的连续操作示意图。（A）通过角膜缘四个注射点（红点）向摘除的眼球内注射明胶，以固化玻璃体。（B）去除角膜和视神经，小心解剖并移除虹膜，并剥离巩膜-脉络膜-RPE复合体。（C）将残留的视网膜杯连同晶状体翻转，使视网膜面朝上；然后在视网膜与玻璃体之间注入PBS以分离两者，随后剥离视网膜层。（D）再次将剩余组织（包含晶状体及其周围透明质膜）翻转，轻轻提起晶状体以松解TVL与VHP之间的连接。（E）在TVL与VHP之间的HA处进行剪切，并移除晶状体及TVL，平铺VHP层。VHP = vasa hyaloidea propria；TVL = tunica vasculosa lentis；PM = pupillary membrane；HA = hyaloid artery。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：利用光学相干断层扫描（OCT）和眼底荧光血管造影（FFA）对玻璃体动脉进行活体成像。 A：3月龄野生型（WT）和Lrp5-/-小鼠的代表性OCT图像，显示Lrp5-/-小鼠眼内玻璃体腔中存在持续残留的玻璃体动脉。B：6周龄野生型（WT）和Lrp5-/-小鼠的代表性FFA图像。小鼠在麻醉后每只注射0.1 ml生理盐水中含1 mg荧光素钠，注射后5分钟拍摄图像，聚焦于Lrp5-/-小鼠的玻璃体动脉或野生型小鼠的玻璃体（因野生型小鼠无玻璃体动脉）。持续存在的玻璃体动脉仅在Lrp5-/-小鼠眼中可见，而野生型小鼠中未见。红色箭头指示玻璃体动脉。两个比例尺均为100 μm（A）。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：延迟的玻璃体血管退化与视网膜血管发育延迟的可视化 Lrp5-/- 小鼠 (A) 野生型（WT）和突变型中经 DAPI（蓝色）染色的平铺玻璃体血管的代表性图像 Lrp5-/- P8时期的眼睛。白色箭头指示玻璃体动脉。B) 对野生型（WT）和突变型中从玻璃体动脉分支出的玻璃体血管数量进行定量分析 Lrp5-/- 眼睛。 (C) 野生型（WT）和突变型小鼠视网膜平铺标本经异凝集素-IB4（isolectin-IB4，红色）染色显示血管结构的代表性图像 Lrp5-/- P8时期的眼睛。白色虚线表示视网膜边缘，黄色线条表示血管化区域边缘。D) 对野生型（WT）和突变型小鼠浅层视网膜血管丛血管覆盖率的定量分析 Lrp5-/- 眼睛 n = 8–12/组。图中比例尺 A 和 C = 1 mm。数据以均值 ± 标准误表示。采用双尾 Student’s t采用检验进行统计分析。**P < 0.01. 本图经王等人许可修改。27. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图5：玻璃体血管在横切面中的可视化 Lrp5-/- 眼睛 野生型和突变型小鼠眼球横切面的代表性图像 Lrp5-/- P8小鼠的眼球被摘除后包埋于最佳切割温度介质中，使用冷冻切片机进行切片。横切片用DAPI（蓝色）染色以显示细胞核，用凝集素IB4（红色）染色以显示血管。白色箭头指示玻璃体血管。比例尺 = 500 μm。该图经Chen等许可改编。16. 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
评估和表征玻璃体血管的技术是观察动物模型中玻璃体血管退化的直观且必要的方法，有助于研究发育过程中血管退化的潜在机制。尽管活体视网膜成像技术可对同一动物进行玻璃体血管退化的纵向观察，但获取用于光学相干断层扫描（OCT）和荧光素眼底血管造影（FFA）的啮齿类动物眼底成像系统可能受到限制。此外，在小鼠睁眼之前，无法对其实施活体成像，因此该方法不适用于新生儿阶段的眼部发育研究。另一方面，虽然对离体眼球进行切片成像可用于任何年龄段的小鼠，且技术门槛较低，但当可见的玻璃体血管数量较少时，该方法难以实现定量分析，且获得理想图像的概率在很大程度上取决于切片角度（图5）。相比之下，将玻璃体血管分离并进行平铺整体染色成像，可实现对整个玻璃体血管系统的完整成像和精确量化，但由于玻璃体血管结构精细且脆弱，该方法可能存在一定的技术挑战。我们希望本文详述的实验方案有助于克服这些困难。
透明质酸膜分离方案中的几个关键步骤包括明胶溶液的注射、视网膜的去除以及最终的平铺封片。操作透明质酸血管的技术难点在于其结构极为脆弱、血管所处的玻璃体近乎液态，以及其与邻近晶状体和视网膜的紧密连接。将明胶溶液注入玻璃体腔是固定含透明质酸血管的玻璃体组织的关键步骤，从而使组织质地更坚实，便于解剖和操作。明胶是一种可形成透明、弹性、热可逆凝胶的凝胶剂。通过在室温或37 °C下将液态明胶注入玻璃体腔，并随后冷却至较低温度（4 °C），可使玻璃体转变为更坚实的凝胶杯状结构。对眼球进行多次明胶注射，有助于足量明胶充分分散至整个玻璃体腔，从而形成均匀且呈圆形的明胶化透明质酸组织杯。另一个技术难点是在不损伤透明质酸组织的前提下去除视网膜。与较易分离的脉络膜不同，含有透明质酸血管的明胶化玻璃体组织很难在不破坏透明质酸结构的情况下与邻近视网膜分离。我们发现，在玻璃体与视网膜之间的间隙注入PBS可形成一层液体缓冲层，从而显著促进两种组织的分离。这一方法在原理上类似于白内障手术中用于分离晶状体囊膜与皮质的水分离技术。最后的平铺封片是该方案中最后一个技术难点。将明胶化的透明质酸组织置于载玻片加热台上的一滴PBS中加热，可使其重新转变为较接近液态的形式，从而更易于实现平整铺展。在融化和干燥过程中，明胶杯的合理摆放与方向定位仍然至关重要，以确保其均匀展平。
分离玻璃体血管的方案可通过多种方式进一步改进。我们使用的明胶溶液浓度为5%，但根据研究者对操作时组织硬度或柔软度的偏好，更高或更低的浓度也可能适用。细胞核的DAPI染色也可改用isolectin-IB4或其他内皮细胞或巨噬细胞标记物，以更清晰地区分血管内皮细胞与巨噬细胞。需要特别注意的是：平铺的玻璃体血管非常脆弱，且仅松散地附着于载玻片上；因此，若染色过程中需要清洗，必须极其轻柔、小心地处理玻璃体载玻片。该分离方案也存在一定的局限性，包括精细解剖操作的复杂性，以及由于组织本身脆弱，难以长期保存样本。尽管如此，分离并平铺玻璃体血管仍是研究玻璃体血管系统的最全面且最直观的方法，有助于推动眼科学和血管生成研究10,17,27,29,30,31。
玻璃体血管系统为研究发育过程中的血管生长与退化提供了极佳的实验模型，相关研究领域包括眼科学、血管生成以及程序性细胞死亡，本文旨在为此类研究提供帮助。未来可针对分离方案进行改进，以提高技术解剖操作的可行性。总体而言，体内成像与体外分离玻璃体血管的联合方法是一种优势显著的技术，可实现对小鼠玻璃体血管的全面评估与特征分析，从而作为血管退化研究的有用模型。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金（R01 EY024963 和 EY028100）对 J.C. 的资助。Z.W. 获得了骑士圣殿眼科基金会职业启动基金的支持。本研究中描述的玻璃体动脉隔离操作步骤经修改后改编自 Richard Lang 博士、Toshihide Kurihara 博士和 Lois Smith 博士慷慨分享的实验方案，作者对此表示衷心感谢。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AK-Fluor（荧光素注射液，USP） | Akorn | 17478-253-10 | |
| 抗CD31抗体 | Abcam | ab28364 | |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Thermo Fisher | S2828 | |
| 含DAPI的抗荧光淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-1200 | |
| 人工泪液滴眼液 | Systane | N/A | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J小鼠 | 杰克逊实验室（The Jackson Laboratory） | 库存编号：000664 | |
| 氯化钙（CaCl₂） | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| 冷冻切片机 | Leica | CM3050S | |
| 冷冻切片机 | Leica | CM3050 S | |
| 盐酸环戊通和盐酸去氧肾上腺素滴眼液 | Cyclomydril | N/A | |
| 明胶 | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| 山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488标记 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| 加热板 | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| 异凝集素GS-IB4，594标记 | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| 盐酸氯胺酮注射液 | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/-小鼠 | 杰克逊实验室（The Jackson Laboratory） | 库存编号：005823 | 由美国加利福尼亚州圣马特奥市Deltagen公司研发 |
| Micron IV和OCT | Phoenix Research Labs | N/A | 成像软件：InSight |
| 显微镜 | Zeiss | discovery v8 | |
| 显微外科镊 | Scanlan International | 4004-05 | |
| 显微外科剪 | Scanlan International | 6006-44 | |
| 最佳切割温度包埋剂（OCT） | Tissue-Tek | 4583 | |
| 最佳切割温度包埋剂（OCT） | Agar Scientific | AGR1180 | |
| 多聚甲醛（16%） | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 一次性可剥离包埋模具（组织模具） | Fisher Scientific | 12-20 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS）缓冲液（10X） | Teknova | P0496 | |
| 载玻片盖玻片 | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost载玻片 | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| 吐温X-100（Triton X-100） | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 无菌赛拉嗪溶液 | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
参考文献
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