大鼠模型中的面神经手术用于研究轴突抑制与再生

摘要

本方案描述了一种在大鼠模型中可重复的面神经外科手术方法，包括各种可诱导性损伤模式的描述。

摘要

本方案描述了在大鼠面神经损伤模型中研究轴突再生与抑制作用的一致且可重复的方法。面神经可沿其全长进行操作，从颅内段至颅外段均可触及。实验研究再生特性的神经损伤主要有三种类型：神经压伤、横断伤和神经缺损伤。可能的干预手段范围广泛，包括对神经的外科操作、神经活性试剂或细胞的递送，以及中枢或终末器官的操作。该模型在研究神经再生方面的优势包括操作简便、可重复性高、跨物种一致性好、大鼠存活率可靠，以及相对于小鼠模型具有更大的解剖尺寸。其局限性在于与小鼠模型相比基因操作手段较为有限，且大鼠本身具有极强的再生能力，因此面神经研究者必须谨慎选择恢复的时间点，并审慎评估将结果外推至更高等动物及人类研究的可行性。大鼠面神经损伤模型可用于功能学、电生理学以及组织形态计量学参数的分析与比较，从而在深入理解人类患者面神经损伤的严重后果及其治疗策略方面具有巨大潜力。

引言

头颈部区域的颅神经损伤可能继发于先天性、感染性、特发性、医源性、创伤性、神经性、肿瘤性或系统性病因¹。其中，第Ⅶ对颅神经（即面神经）最常受累。面神经功能障碍的发生率较高，每年每10万人中有20至30人发病²。面神经的主要运动分支包括颞支、颧支、颊支、下颌缘支和颈支；根据受累分支的不同，可能出现口唇闭合不全或流涎、角膜干燥、因眼睑下垂导致的视野遮挡、构音障碍或面部不对称等后果^2,3。长期并发症包括联带运动现象，即在试图主动收缩某一面部肌群时，引发另一面部肌群的不自主运动。眼-口联带运动是最常见的异常再生表现，为面神经损伤的后遗症之一，可导致功能障碍、尴尬感、自尊心下降以及生活质量降低³。不同分支的损伤决定了特定功能的选择性受损。

面神经损伤的临床治疗尚无统一标准，需要进一步研究以改善治疗效果。类固醇可减轻急性期面神经的肿胀，而肉毒杆菌毒素（Botox）可用于暂时控制联带运动；但临床医生主要的重建治疗手段仍依赖于通过神经修复、替代或功能重建等外科手术干预^3,4,

方案

所有干预均严格遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南进行。实验方案经密歇根大学机构动物护理和使用委员会 & 使用委员会（IACUC）批准后方可实施。实验采用10周龄成年雌性Sprague-Dawley大鼠。

1. 手术日前的准备

1. 手术日前，请确保备有充足的已灭菌外科器械、镇痛药物、麻醉药物和氧气。完整清单请参见材料表。

2. 术前准备

1. 确保有足够的工作空间，包括至少容纳两名人员（外科医生和助手）的空间。
   注意：需要配备专用手术台、麻醉机设备的放置空间，以及用于存放已灭菌物品和备用耗材的充足存储空间。
2. 校准手术显微镜以供操作过程中使用。确保外科医生能够在显微镜手柄和变焦/对焦按钮上覆盖无菌保护套后，仍可正常调节手柄和按钮。
   注意：我们在手柄和按钮上使用了无菌铝箔作为覆盖物。

3. 麻醉与准备

1. 将动物放入麻醉室，通过1.8%异氟烷和0.9 L/min氧气诱导全身麻醉。
   1. 通过评估自主呼吸以及通过脚趾夹捏测试动物的面部痛苦反应来评估意识水平，以确认麻醉深度足够。
2. 双侧眼睛涂抹眼用润滑剂，以防止角膜刺激或干燥。
....

结果

初次手术后，主要有两种类型的结果评估指标：活体动物的系列测量和需要处死动物才能进行的测量。系列测量的例子包括电生理检测，如复合肌肉动作电位测量³⁰，通过激光辅助或视频记录手段对面部肌肉运动的评估⁹，以及在荧光转基因动物中对面神经再生过程进行重复的活体成像^31,32。图1展示了在成年转基因Thy1-GFP大鼠中对面神经主干进行的活体成像。在下颌缘支约距第一分支点远端2-3 mm处实施了压榨损伤。利用MetaMorph成像软件，我们能够量化面神经走行中任意位置的荧光强度。特别是，可以分别量化损伤部位近端和远端的荧光信号，从而通过荧光信号的恢复情况作为神经再生的标志物进行连续评估。图2展示了在Thy1-GFP大鼠中.......

讨论

大鼠面神经损伤模型因其手术可及性、分支模式及生理学意义，已成为评估神经营养因子最通用的系统^{27,29,33,34,35,36}。视频演示与转基因动物数据的应用相结合，为神经再生现象的科学研究开辟了新的可能性。该模型可对神经对创伤的反应、神经营养因子的影响、免疫调节作用以及其他微环境因素进行系统而详细的表征。尽管临床面神经研究的主要目标是运动神经元功能的恢复，但该模型还可用于深入理解神经肌肉接头处的事件、轴突运输的细微机制以及轴突-胶质细胞相互作用的复杂性^27,36,37

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.8% 异氟烷	VetOne	13985-030-40
11-0 尼龙显微缝合线	AROSuture	TK-117038
4-0 单乔缝合线	VWR	75982-084
缓释布托啡诺	ZooPharm	MIF 900-006
卡洛芬	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
氯己定	VWR	IC19135805
珠宝镊	VWR	21909-458
微型韦特兰牵开器	VWR	82030-146
显微剪刀	VWR	100492-348
微型肌腱切断剪刀	VWR	89023-522
15 号手术刀片	VWR	102097-834
手术显微镜	Leica
凡士林眼用凝胶	Pharmaderm	B002LUWBEK
无菌水	VWR	89125-834
组织粘合剂	Vetbond, 3M	NC9259532
导水垫	Aqua Relief System	ARS2000B
布比卡因			用作局部镇痛药