评估人格特质对斑马鱼磁场敏感性的影响

摘要

我们描述了一种行为学实验方案，旨在评估斑马鱼的个性如何影响其对水流和弱磁场的反应。具有相同个性特征的鱼类根据其探索行为被区分开来，随后观察它们在低流速的游泳通道中、不同磁场条件下产生的趋流性定向行为。

摘要

为了在环境中定位自身，动物会整合多种外部线索，这些线索与若干内部因素（如个性）相互作用。本文描述了一种行为学实验方案，旨在研究斑马鱼个性对其响应多种外部环境线索（特别是水流和磁场）时定向行为的影响。该方案旨在探究当周围磁场方向发生变化时，主动型或被动型斑马鱼是否表现出不同的趋流阈值（即鱼类开始逆流游动时的水流速度）。为识别具有相同个性的斑马鱼，将鱼置于一个由狭窄开口连接的双室水箱中，其中一半为黑暗环境，另一半为明亮环境。只有主动型斑马鱼会探索这一新颖的明亮环境，而被动型斑马鱼则不会离开黑暗的一侧。使用低流速的游泳通道来测定趋流阈值。我们介绍了两种可在接近地磁场强度范围内调控通道内磁场的装置：一种可控制沿水流方向的磁场（单维度），另一种则可实现磁场的三轴控制。在不同磁场条件下，通过逐步增加通道内的水流速度并同步录像记录鱼类行为。利用视频追踪程序收集定向行为数据，并将其拟合至逻辑模型，以确定趋流阈值。我们报告了来自群游型斑马鱼的代表性实验结果。具体而言，结果表明仅当磁场方向发生变化时，被动型、谨慎型斑马鱼的趋流阈值会出现变化，而主动型斑马鱼对磁场变化无响应。该方法可广泛应用于研究多种水生动物（无论其为独居或群游游泳策略）的磁敏感性及趋流行为。

引言

在本研究中，我们描述了一种基于实验室的行为学实验方案，可用于探究鱼类个体性格对其在群游过程中对外部定向线索（如水流和磁场）定向反应的影响。

动物的定向决策源于对各种感觉信息的权衡。该决策过程受到动物导航能力（例如选择并保持方向的能力）、内部状态（例如摄食或繁殖需求）、运动能力（例如运动生物力学）以及多种其他外部因素（例如一天中的时间、与同种个体的相互作用）的影响¹。

内在状态或动物个性在定向行为中的作用常常难以被充分理解或尚未得到深入研究²。在研究社会性水生物种的定向行为时，还存在额外的挑战，因为这些物种通常表现出协调且具有方向性的群体运动行为³。

水流在鱼类定向过程中起着关键作用。鱼类通过一种称为趋流性⁴的非条件反应来感知水流方向，这种反应可分为正趋流性（即朝向上游）和负趋流性（即朝向下游），并被用于多种行为活动，从觅食到降低能量消耗不等^5,6。此外，越来越多的研究表明，许多鱼类物种能够利用地磁场进行定向和导航^7,8,9。

对鱼类趋流性及游泳能力的研究通常在流动水槽（flume）中进行，其中鱼类暴露于从低到高逐步增加的水流速度下，通常直至力竭（称为临界速度）^10,11。另一方面，以往研究通过观察动物在静水环境中的游泳行为，探讨了磁场在定向行为中的作用^12,13。本文描述了一种实验室技术，使研究人员能够在同时调控水流和磁场的条件下研究鱼类的行为。该方法在我们先前的研究中首次应用于群游斑马鱼（Danio rerio），结果表明，周围磁场的改变会影响其趋流性阈值（即群游鱼类开始逆流定向的最小水流速度）¹⁴。该方法基于使用低流速水槽，并结合一套可调控水槽内磁场的装置，磁场强度控制在地球磁场强度范围内。

用于观察斑马鱼行为的游泳隧道如图1所示。该隧道由一个无反光的亚克力圆筒制成，直径为7 cm，长度为15 cm，连接至流速控制系统¹⁴。通过该装置，隧道内的流速范围可在0至9 cm/s之间调节。

为了操控游泳隧道中的磁场，我们采用了两种方法学途径：第一种是一维的，第二种是三维的。在任何应用中，这些方法均可调控地磁场，以在特定水体体积内获得特定的磁条件——因此，本研究中报告的所有磁场强度值均包含地磁场。

关于一维方法¹⁵，使用缠绕在游泳通道周围的螺线管沿水流方向（定义为x轴）调控磁场。该螺线管连接至一个电源装置，可产生均匀的静态磁场（图2A）。类似地，在三维方法中，通过使用导线线圈来改变包含游泳通道空间区域的地磁场。然而，为了实现对三维空间中磁场的控制，线圈采用三组正交的亥姆霍兹线圈对设计（图2B）。每组亥姆霍兹线圈对由两个圆形线圈组成，分别沿三个相互正交的空间方向（x、y 和 z）布置，并配备一个在闭环条件下工作的三轴磁力计。该磁力计可在与地球自然磁场强度相当的场强下工作，且位于线圈组几何中心附近（即游泳通道所在位置）。

我们采用上述技术来验证以下假设：组成鱼群的鱼类个体性格特征会影响其对磁场的响应方式¹⁶。我们检验了具有主动型和被动型性格特征的个体^17,18在暴露于水流和磁场时会表现出不同反应的假设。为验证这一点，我们首先使用已建立的方法对斑马鱼进行分类，将具有主动型或被动型性格特征的个体进行识别和分组^17,19,20,21。随后，我们在磁控水槽装置中评估由仅含被动型个体或仅含主动型个体组成的鱼群中斑马鱼的抗流行为，并将结果作为示例数据呈现。

该分选方法基于主动型和被动型个体探索新环境倾向的差异²¹。具体而言，我们使用一个分为明亮区和黑暗区的水箱^17,19,20,21（图3）。动物先在黑暗区适应一段时间。当开放通往明亮区的通道后，主动型个体会迅速离开水箱的黑暗半区以探索新环境，而被动型个体则停留在黑暗区不离开。

方案

本方案已获得意大利那不勒斯费德里科二世大学动物实验伦理委员会（2015年）批准。

1. 动物饲养

1. 使用至少 200 L 的水箱饲养每箱不少于 50 条雌雄个体混合的鱼群。
   注意：水箱中鱼的密度必须控制在每 2 L 水体不超过 1 条鱼。在此条件下，斑马鱼将表现出正常的群游行为。
2. 设定饲养条件如下：温度 27–28 °C；电导率 <500 μS；pH 值 6.5–7.5；NO₃ 浓度 <0.25 mg/L；光照周期为 10 小时光照 : 14 小时黑暗。
   注意：混合种群以及分离开的主动型和被动型种群必须采用相同的饲养条件。

2. 斑马鱼的个性选择

1. 在安静的房间内准备并放置个性选择实验缸（图3），缸内使用与饲养缸相同的水。
2. 将视频摄像机置于实验缸的上方或侧面。将摄像机连接至计算机，并将显示器放置在无法直接看到实验缸的区域。
3. 从饲养缸中随机选取九条鱼，使用无结网将其转移至个性选择实验缸的暗侧。
   注意：尽量减少与鱼缸及鱼类的接触时间，避免噪音和快速移动。如有必要，可使用小体积运输缸（约2 L）转移鱼类，运输缸中应加入饲养缸的水。为避免鱼类暴露于空气中，可使用250 ml烧杯，轻柔引导鱼类进入烧杯。尽量缩短捕获时间，避免一次捕获多条鱼，以防对鱼类造成物理损伤；鱼类在网中停留时间不应超过数秒，以减少应激反应。在转移至实验缸前，应让鱼类自由摄食。这可降低因觅食行为差异而影响后续实验中个体行为的可能性²²。重复实验应在每天的同一时间进行，以最小化因可能存在的昼夜节律导致的实验组行为变异²³。
4. 经过1小时的适应后，打开滑动门。
   注意：在10分钟内从孔洞中离开并探索实验缸明亮一侧的个体被视为主动型个体²¹。
5. 10分钟后，轻柔地将主动型个体从缸中移出，并转移至主动型饲养缸。
6. 15分钟后，收集仍留在暗箱中的鱼类，这些个体被视为被动型个体²¹，并将其转移至被动型饲养缸。
   注意：对于在10分钟后才进入实验缸明亮一侧的鱼类应予以剔除²¹。每次对九条鱼进行个性测试，直至获得第5节所述实验所需的足够数量的主动型和被动型个体。可定期使用相同方法检测主动型和被动型个性的稳定性。

3. 一维磁场操控建立磁场的设置²⁷

1. 打开电源装置（图2A）。
2. 将盘绕的隧道放置在将要进行趋流性实验的位置（第5节），但暂时不要将其连接到游泳装置上（图2A）。将连接至高斯/特斯拉计的磁探头放入隧道内部，并确定沿隧道主轴方向产生所需磁场强度所需的电压。
   注意： 由于螺线管线圈的磁学特性，隧道内部的磁场分布相对均匀；可通过缓慢水平和垂直移动探头来验证这一点。
3. 断开探头连接，并将流动隧道连接至游泳装置。
4. 开始进行趋流性实验（第5节）。

4. 三维磁场操控系统的磁场设置²⁷

1. 打开CPU、DAC和线圈驱动器（图2B）。
2. 在三个轴（x、y和z）上分别设置选定的磁场。
3. 将隧道置于亥姆霍兹线圈组的中心位置。
4. 开始趋流性实验方案（第5节）。

5. 流动室中斑马鱼趋流性的测试

1. 使用一个侧面和底部不透明的2 L水箱，将一至五条鱼转移至流道中。
2. 开启水泵，并将流道中的流速设定为1.7 cm/s。
   注意：这种缓慢流动的水可保持流道内水体的溶氧量，并有助于鱼类恢复。
3. 让鱼类在游泳流道中适应1小时。
4. 开始对流道中鱼类的行为进行视频记录。
   注意：我们使用了一台带远程控制功能（例如蓝牙）的摄像机（如Yi 4K Action），并将视频保存为.mpg格式（30帧/秒）。
5. 根据所选的实验方案逐步增加流速（本研究中为1.3 cm/s；图4）。
   注意：本实验采用较低的流速，对于斑马鱼而言，范围为0至2.8 BL（体长）/s。这些流速处于诱导斑马鱼持续定向游泳的流速范围的较低水平（临界游泳速度[U_crit]的3%–15%）²⁴。采用低流速（遵循Brett的实验方案²⁵）与该物种在水流存在下的特定行为特征相关。斑马鱼倾向于沿实验腔室的长轴方向游动，频繁转弯，即使在有水流的情况下，也常同时向上游和下游游动^24,26。这种行为受水流速度影响，在相对较高的流速（>8 BL/s）下消失²⁶，此时鱼类持续朝向上游方向游动（完全正向趋流反应）。垂直和横向位移极为罕见。
6. 在形态测量室拍摄的鱼类图像上进行动物形态测量（性别及总长度[TL]、叉长[FL]或体长[BL]）。
   1. 选择合适的图像。
   2. 在ImageJ中打开图像。
   3. 记录动物的性别（雄性斑马鱼体型较纤细，通常呈黄褐色；雌性则体型较圆润，通常带有蓝色和白色斑纹）。
   4. 点击 分析 > 设定比例尺，以流道的整个水平长度为参考，将图像的比例尺设定为厘米。
   5. 点击 分析 > 测量，记录动物的线性长度。
   6. 计算其体重（BW）。
      注意：BW根据实验室先前建立的性别-叉长-体重关系或元数据计算得出。整个过程避免了对动物的直接操作，从而减少应激反应。

6. 视频追踪

1. 使用 Tracker 4.84 视频分析与建模工具打开视频文件。
   注意：如有必要，使用透视和径向畸变滤镜校正视频畸变。
2. 在顶部菜单中点击坐标系，并将长度单位设置为厘米，时间单位设置为秒。
3. 点击文件 > 导入 > 视频，在 Tracker 4.84 中打开其中一个视频。
4. 点击“坐标轴”，设置参考系以追踪鱼类随时间的位置变化，其中 x 轴沿通道方向。将原点设在下游末端壁的低角处（即水流出口位置）。
5. 点击轨迹 > 新建 > 质点，并逐条鱼进行追踪。对每条鱼在每个流速下所处的最后 5 分钟进行追踪。
6. 以每五帧（0.5 秒）为间隔手动推进视频，标记动物每次由上游转向下游（UDt；见图 5中的红点）以及由下游转向上游（DUt；见图 5中的蓝点）时的时间和位置。
   注意：以鱼眼位置作为确定鱼体位置的参考点，使用质点法追踪动物位置。排除任何非定向游动阶段（即机动时间）。
7. 每次追踪结束后，从软件窗口右下角的表格中选择 x 值和时间值。右键单击数据，选择复制数据 > 完整精度。
8. 将所有转向点的时间值和 x 值保存至模板电子表格文件中，用于计算每个流速阶段的总上游时间（所有 UDt 与 DUt 之间时间间隔的总和）和总下游时间（所有 DUt 与 UDt 之间时间间隔的总和），以及计算每个流速阶段的趋流指数百分比值（RI%）（见图 5）。
   注意：趋流行为通过鱼类面向上游的时间占总定向时间的比例来量化（包括游动或偶尔静止不动[即停留在通道底部]的状态²⁷）。该比例定义为 RI%（见图 5）。
   

结果

作为样本数据，我们展示了在主动和反应性群游斑马鱼中，沿水流方向控制磁场所获得的结果¹⁶ 使用图示装置 图2A （见方案第3节）。这些结果表明，所描述的方案能够揭示不同个性特征的鱼类对磁场反应的差异。这些试验的整体思路基于以下发现：相对于水流方向的磁场方向会影响群游斑马鱼的定常性阈值。¹⁴因此，由于磁场变化会调节鱼类的趋流性，本实验方案可用于评估斑马鱼对磁场的反应是否因其主动型或被动型个性而存在差异²⁸.

首先，使用如图3所示的明暗穿梭 tank，根据斑马鱼的主动型/被动型个性将其分为不同组。完成该测试后，将五条具有相同个性的斑马鱼组成鱼群，在螺线管式游泳隧道中进行测试（图1和

讨论

本研究中描述的实验方案使科学家能够量化水生物种复杂的定向反应，这些反应源于两种外部线索（水流和地磁场）与动物一种内部因素（如个性）之间的整合。总体思路是设计一种实验方案，使科学家能够区分不同个性的个体，并在分别或同时控制外部环境线索的条件下，研究它们的定向行为。

本研究中描述的实验方案以及流向性指数（rheotactic index, RI）的数学定义，是基于斑马鱼在游泳隧道中的初步行为观察而设计的。当被置于隧道中时，这些动物会表现出两种行为模式，无论是否存在水流：定向游泳和机动运动。它们大部分定向时间（通常，鱼类被视频记录的时间超过95%）都用于沿隧道方向来回游动（即沿长轴方向，角度小于45°），在靠近端壁处转弯，并且经常表现出趋触性（即紧贴隧道壁游动）²⁷。

要使本实验方案成功，操作者必须密切关注动物的应激状态。在不同实验装置之间转移鱼类时，必须小心操作。使用手网的操作应尽可能迅速，由于斑马鱼游泳速度快、在水箱中难以捕捉，因此在正式实验前进行充分训练尤为必要。应激会显著影响这...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
9500 G 磁强计	FWBell	N/A	高斯计，直流-10 kHz；探头分辨率：  0.01 μT
AD5755-1	Analog Devices	EVAL-AD5755SDZ	四通道 16 位数模转换器
ALR3003D	ELC	3760244880031	直流双路稳压电源
BeagleBone Black	Beagleboard.org	N/A	单板计算机
线圈驱动器	自制	N/A	基于商用运算放大器（TI 的 OPA544）的放大器
亥姆霍兹线圈对	自制	N/A	使用标准 AWG-14 导线绕制的线圈
HMC588L	Honeywell	900405 Rev E	数字三轴磁力计
MO99-2506	FWBell	129966	单轴磁场探头
游泳装置	M2M Engineering Custom Scientific Equipment	N/A	由蠕动泵和带数字反馈的 SMC 流量开关流量计组成的游泳装置
TECO 278	TECO	N/A	制冷加热恒温槽