评估化疗诱导黏膜炎小鼠模型中小肠损伤与适应的重要终点指标和增殖标志物

摘要

本文介绍了一种利用化疗诱导黏膜炎模型来建立小肠损伤及代偿性高增殖的重要终点指标和增殖标志物的实验方案。我们通过细胞周期特异性标记物检测增殖细胞，并采用小肠重量、隐窝深度和绒毛高度作为评估终点指标。

摘要

肠道适应是一种在肠道因创伤而丧失后发生的自然代偿机制。适应性反应（如隐窝细胞增殖和营养吸收增加）在恢复过程中至关重要，但目前对其理解仍不充分。了解这些适应性反应背后的分子机制，对于促进识别能够增强适应性的营养物质或药物具有重要意义。尽管已有多种方法和模型在文献中被描述，但为了获得可重复的数据，仍需要一种详细且具有可操作性的实验操作描述。本文介绍了一种利用化疗诱导小鼠黏膜炎模型来评估小肠损伤及代偿性高增殖的重要终点指标和增殖标志物的方法。我们展示了如何使用细胞周期特异性标记物检测增殖细胞，并以小肠重量、隐窝深度和绒毛高度作为评估终点。该方法中的关键步骤包括小肠的取出与称重，以及建议采用的较为复杂的软件系统进行测量。这些方法具有耗时短、成本低、易于操作和测量的优点。

引言

肠适应是当肠道因疾病或手术而丧失时发生的自然代偿机制^1,2。在受到损伤后，肠道会发生形态计量学和功能上的适应性反应，其特征是隐窝细胞增殖和营养吸收能力增强³。这一过程对恢复至关重要，但目前对其理解仍不充分。关于肠道适应性反应的实验研究主要集中在小肠切除术后小鼠、大鼠和猪体内发生的变化，然而，了解其他类型损伤（如化学性或细菌性损伤）背后适应性反应的分子机制，对于促进识别可增强适应性的营养物质或药物至关重要。实验上，已有多种方法被用于描述小肠病理的复杂分子和细胞指标，包括组织病理学评分和损伤结局的测定。尽管如此，现有文献中仍缺乏对如何执行获得可重复数据所需操作步骤的详细描述。在鉴定参与适应过程的因素（如肠道激素）时，需要一种简便、低成本且可重复的动物模型，本文建议采用化疗诱导的肠黏膜炎（CIM）模型。

测量小肠（SI）质量是评估损伤与适应反应最简单且信息丰富的指标之一。已知黏膜炎的特征包括肠上皮细胞凋亡、时间依赖性的绒毛萎缩以及有丝分裂减少。因此，在临床前模型中观察肠道形态学变化具有重要意义^4,5。在人体中，血浆瓜氨酸（一种功能性肠上皮细胞的标志物）水平下降与毒性评分、炎症标志物⁶以及吸收能力降低相关⁷，提示该氨基酸是黏膜炎的理想生物标志物。瓜氨酸可在小鼠和大鼠中检测，并且已被证实与绒毛长度⁸、隐窝存活率⁹以及辐射诱导的黏膜炎¹⁰具有良好的相关性。

测量血浆瓜氨酸的一个主要优势是能够对同一只动物进行多次重复测量。然而，在小鼠中多次采血受限于每周总采血量不得超过6 µL/g，且需要实施全身麻醉。不幸的是，这同时也限制了瓜氨酸测量在小鼠中的应用。此外，瓜氨酸的检测需要使用高效液相色谱法^11,12，该方法成本较高且耗时较长。最近，我们发现小鼠体内瓜氨酸水平与小肠重量之间存在显著相关性（p < 0.001）（未发表数据），表明瓜氨酸可作为反映肠上皮细胞质量的直接指标。然而，测量小肠重量的局限性在于必须处死小鼠，因此无法在同一只小鼠中进行重复测量。尽管如此，该方法仍可为围绕研究问题开展多种其他组织学分析提供可能，这些优势在一定程度上可弥补额外使用实验动物的不足。因此，我们建议将小肠重量作为小鼠肠道损伤与适应性反应的一种简便、低成本且快速的生物标志物。为确保实验结果的可重复性及可接受的分析变异度，应在取出肠道后仔细分离，用生理盐水冲洗，排空内容物并干燥后再进行称重。本文将详细展示该操作步骤的具体实施过程。

黏膜炎的另一个特征是隐窝中增殖细胞的丢失，以及在再生阶段出现的代偿性过度增殖³。细胞增殖标志物Ki67常通过免疫组织化学方法用于鉴定快速增殖的细胞¹³。尽管Ki67是一种简单的增殖标记物，但其存在一定的不精确性，因为Ki67在细胞周期的所有活跃阶段（G1、S、G2和M期）均有表达¹⁴。为了特异性地检测正在复制的细胞，我们建议采用5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）的原位掺入法，BrdU是胸腺嘧啶的合成类似物，主要仅限于S期复制中的细胞¹⁵。在动物处死前150分钟注射BrdU，随后可利用特异性抗BrdU抗体通过免疫组织化学方法检测标记细胞。在本文中，我们将详细介绍如何使用免费图像软件测量隐窝内BrdU免疫阳性细胞的面积。

在5-FU诱导的黏膜炎模型中，通常研究形态学和功能变化，通过绒毛高度和隐窝深度来评估肠道适应性。在本研究中，我们发现，在黏膜炎的急性期（即损伤期），通过BrdU掺入法测量的细胞增殖与隐窝深度无相关性。与此相反，在黏膜炎修复期（诱导后3至5天），隐窝深度与细胞增殖显著相关。这表明，仅用隐窝深度无法准确反映黏膜炎急性期的变化。我们建议，在以细胞增殖为终点指标研究黏膜炎急性期的小鼠模型时，应优先采用BrdU掺入法；而在定量分析再生阶段后期的过度增殖时，隐窝深度可作为BrdU掺入法的合理替代指标。本研究的目的是对该模型进行详细描述，使其能够被所有研究人员使用，不仅适用于肿瘤学领域的研究者，尤其也适用于对肠道损伤模型不熟悉的科研人员。

该描述的模型可用于根据适应性反应，以体重、小肠重量和隐窝深度作为终点指标，对转基因模型进行表型分析。例如，我们在此展示了如何利用5-氟尿嘧啶（5-FU）诱导的黏膜炎模型，在一种L细胞分泌功能缺陷的细胞敲除模型中进行研究¹⁶。胰高血糖素样肽-1（GLP-1）和胰高血糖素样肽-2（GLP-2）是肠内分泌L细胞在食物摄入后共同分泌的肠道激素^17,18。GLP-2被公认为是肠道修复、调控黏膜细胞凋亡以及改善小肠屏障功能的重要因子^19,20,21,22。基于文献报道，我们提出假设：内源性激素对于损伤后适应性反应中发生的代偿性高增殖至关重要。

方案

所有所述方法均按照丹麦动物实验管理法规（1987年）的指南进行。研究已获得丹麦动物实验监察局（2013-15-2934-00833）和当地伦理委员会的许可。

注意：选用雌性 C57BL/6J 小鼠（约 20−25 g），每笼饲养 8 只，饲养环境为标准的 12 小时光照/12 小时黑暗循环，可自由饮水并摄取标准饲料。动物在实验开始前适应环境一周。

1. 使用5-氟尿嘧啶诱导黏膜炎

1. 获取浓度为 50 mg/mL 的 5-氟尿嘧啶（5-FU）溶液。
2. 称量并记录小鼠的体重。根据体重计算注射用 5-FU 的用量（例如，400 mg/kg）。
3. 准备一支连接 27 G × 30 mm 针头的 1 mL 注射器，并将计算好的 5-FU 注射剂量抽入注射器中。
4. 采用抓颈皮法固定小鼠。操作时，用一只手抓住小鼠尾根部，并将其尾部置于可抓握的表面（如金属网盖）上。在用一只手固定尾部的同时，用另一只手抓住其颈部背侧的皮肤。
5. 用同一只手的拇指和食指尽可能向后伸展，将小鼠身体牢固地固定在手掌上，并将尾部夹在该手的手指之间以稳定小鼠。
6. 在保持小鼠稳固而轻柔抓握的同时，暴露其腹侧面，将针头插入腹部右下或左下象限的腹膜腔内。回抽确认针头位置正确后，注射 400 mg/kg 的 5-FU。

2. 组织采集

1. 通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪（100/10 mg/kg，用生理盐水[0.9% NaCl]稀释）对小鼠进行麻醉。通过观察夹捏回缩反射来监测麻醉深度。
   注意：本麻醉为非复苏性麻醉。
2. 记录麻醉后小鼠的体重。
3. 将小鼠置于仰卧位，行剖腹术以暴露腹腔，随后切开胸腔以造成气胸。
4. 使用剪刀剪开膈肌，处死动物。
5. 取出小肠。在幽门上方切断，小心将小肠从尸体上分离，直至到达盲肠，并在盲肠前稍作切断。
6. 使用镊子轻轻夹闭近端肠腔。用连接25 G针头的1 mL注射器，以生理盐水冲洗小肠以清除粪便。
7. 使用手术器械轻柔地将肠腔内的生理盐水移除。
8. 将小肠置于洁净的吸水纸上，仔细去除多余的生理盐水。
9. 记录冲洗后组织的重量。
10. 计算冲洗后小肠重量占体重的百分比。

3. 小肠组织学

1. 组织准备
   1. 在通风橱内，使用剪刀从每只小鼠的十二指肠、空肠和回肠部位截取已冲洗过的肠组织，每段长约 3 cm，并将组织段置于 10% 福尔马林中，室温固定 24 小时。
      注意：固定液体积应为组织体积的 5−10 倍。
   2. 将固定后的组织转移至切片板上。
   3. 使用手术刀将组织修剪至约 1 cm，并转移至包埋盒中。
      注意：包埋盒应使用铅笔标注样本编号（ID）。
   4. 将包埋盒浸入 70% 乙醇中，并于 4 °C 保存，直至后续处理。
2. 组织石蜡包埋
   1. 通过梯度乙醇溶液对组织进行脱水处理：将包埋盒依次置于 70% 乙醇中 1 小时、80% 乙醇中 1 小时、95% 乙醇中 1 小时、100% 乙醇中 1.5 小时；随后将包埋盒从 100% 乙醇转移至二甲苯中处理 1.5 小时。
   2. 将包埋盒浸入加热至 58−60 °C 的石蜡中。使用镊子将组织调整为横切方向，并使蜡块冷却超过 24 小时，直至完全凝固。
3. 使用切片机进行组织切片
   1. 将蜡块组织面朝下置于冰上 5 分钟。使用切片机将石蜡块修切至 10−30 µm 厚度，以暴露组织表面。
   2. 对组织蜡块进行 3−5 µm 厚度的横切切片，分别获取十二指肠、空肠和回肠的横截面。
   3. 将石蜡带置于 40−45 °C 的水浴中。使用镊子将切片分开。
   4. 用载玻片从水中捞取切片。
   5. 切片在染色前需空气干燥 30 分钟。
      注意：如需长期保存，应将载玻片存放在冰箱中。
4. 组织苏木精-伊红染色
   1. 将载玻片置于组织学染色架中，在设定为 60 °C 的加热烘箱中脱蜡 60 分钟。
      注意：直接从冰箱取出的载玻片应先恢复至室温，再放入加热烘箱。
   2. 在通风橱内，使用三种更换的透明剂（材料表）对组织进行复水处理：在第一个透明剂瓶中浸洗 20 次，随后在另外两个透明剂瓶中各静置 7−8 分钟。将载玻片转移至梯度乙醇溶液中，依次使用 99% 乙醇三次、96% 乙醇两次和 70% 乙醇一次，每个瓶子至少浸洗 20 次。转移至流动水中，静置 5 分钟。
   3. 将载玻片浸入过滤后的 Mayer 苏木精染液中 1 分钟。
   4. 用流动自来水清洗样本 5 分钟。
   5. 将切片浸入伊红染液中染色 1−2 分钟，随后用自来水冲洗。
   6. 通过梯度乙醇溶液进行脱水：先用 70% 乙醇，随后依次使用 96% 乙醇、96% 乙醇，以及四次 99% 乙醇。每个瓶子至少浸洗 20 次，并将染色架保留在 99% 乙醇中，直至封片。
   7. 在载玻片表面滴加少量封片剂，盖上盖玻片，注意避免产生气泡。室温干燥 24 小时。
   8. 使用连接相机的光学显微镜观察组织，获取组织学图像。使用 10 倍物镜拍摄照片，直至覆盖整个组织切片区域。

4. 隐窝深度和/或绒毛高度的测量

1. 下载并安装分析软件（例如，Zen Lite，材料表）。
2. 在软件中打开图像并连接相机。使用 20 倍物镜在相机模式下拍摄快照。
3. 在处理模式下，打开快照。
4. 测量隐窝深度：在 2D 视图 中，从图形选项卡中选择线条工具。选择一个方向良好的隐窝，将线条起点置于绒毛底部，终点置于隐窝底部。对 20 个方向良好的隐窝重复此操作（补充图 1）。
5. 测量绒毛高度：在 2D 视图 中，从图形选项卡中选择线条工具。选择一个方向良好的绒毛，将线条起点置于管腔突起的末端，终点置于隐窝起始处。对 20 个方向良好的绒毛重复此操作（补充图 1）。
6. 从 2D 视图 切换至 测量视图 以显示测量结果。
7. 导出测量数据，并计算隐窝深度和绒毛高度的平均值。

5. 通过免疫组织化学法对 BrdU 进行定量（增殖）

1. BrdU 溶液的注射
   1. 称量并记录小鼠的体重。
   2. 在通风橱中，配制适量的 0.5% w/v 溴脱氧尿苷（BrdU）磷酸盐缓冲液（PBS）溶液。
   3. 在通风橱中，以 50 mg/kg 剂量进行腹腔注射。
      注意：为确保每只小鼠均在注射 BrdU 后恰好 150 分钟处死，请依次对每只小鼠注射，间隔 10−20 分钟，以便正确完成组织采集。
   4. 记录注射时间。
   5. 等待 150 分钟后，麻醉小鼠并按照步骤 2.1−2.7 所述方法采集组织。按照第 5.2 节所述方法进行 BrdU 免疫组织化学染色。
2. BrdU 免疫组织化学染色
   1. 按照步骤 3.1.1−3.3.4 所述方法制备组织。
   2. 抗原修复：将载玻片架连同切片放入玻璃组织学染色缸中，加入 EDTA 缓冲液（pH 9），置于微波炉中，先以 750 W 加热 1 分钟，再以 350 W 加热 9 分钟。重复此循环一次。
      注意：确保组织不干燥，必要时在加热间隔向染色缸中补充缓冲液。
   3. 用含吐温 20 的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS-T）缓冲液洗涤切片 2−3 次，每次 3 分钟。
   4. 每张切片滴加 5 滴过氧化物阻断剂（材料表），室温孵育 10−15 分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。随后用 TBS-T 缓冲液洗涤切片 2−3 次，每次 3 分钟。
   5. 每张切片滴加 5 滴啮齿类阻断缓冲液（材料表），室温孵育 30 分钟，以阻断非特异性结合。随后用 TBS-T 缓冲液洗涤切片 2−3 次，每次 3 分钟。
   6. 加入单克隆小鼠抗 BrdU 抗体，按 1:500 稀释，室温孵育 1 小时。随后用 TBS-T 缓冲液洗涤切片 2−3 次，每次 3 分钟。
   7. 使用 3,3’-二氨基联苯胺（DAB）显色：每张切片滴加 5 滴辣根过氧化物酶，室温孵育 15 分钟。将切片转移至通风橱，加入 150 µL DAB，孵育 5 分钟。
      注意：操作 DAB 时务必佩戴手套，并妥善处理废弃物。
   8. 用去离子水冲洗切片。
   9. 按照步骤 3.4.6 和 3.4.7 所述方法脱水并封片。
3. 免疫反应的观察
   1. 使用连接相机的光学显微镜观察组织样本。
   2. 使用分析软件，以 20 倍物镜获取所有切片的显微图像，并将文件保存为 .JPG 格式。
   3. 使用 20 倍物镜拍摄台式显微测微尺的图像，用于 ImageJ 软件中的校准。
4. 测量 BrdU 免疫阳性细胞的面积
   1. 安装 ImageJ 软件（材料表）。
   2. 在 ImageJ 中为图像设定标尺：使用 ImageJ 的 文件 | 打开 菜单命令打开显微测微尺图像。选择直线选择工具。
   3. 选择直线工具，在测微尺图像上画一条直线以定义已知距离。
   4. 在 分析 菜单下选择 设定标尺。
   5. 在 已知距离 框中输入数值，并在 长度单位 框中定义长度单位。选择 全局，使此校准适用于本次 ImageJ 会话中打开的所有图像。
   6. 使用 ImageJ 的 文件 | 打开 菜单命令打开待测图像，用于测量每个隐窝中 BrdU 免疫阳性细胞的面积。
   7. 在 图像/类型 菜单下将彩色图像设置为 8 位。
   8. 在 处理/增强对比度 中提高图像对比度，并将饱和像素设置为 0.4%。
   9. 对图像应用阈值以分割免疫阳性区域。在菜单中选择 图像/调整，然后选择 阈值，并选择颜色 红色（红色显示深色区域）。通过移动阈值滑块，选择约 10−20% 的阈值。
      注意：选择的阈值应包含所有 BrdU 阳性细胞，同时背景尽可能少。所选百分比应适用于所有切片。
   10. 选择一个方向良好的隐窝，即来自完整组织的完整隐窝，使用自由手绘选择工具标记其周围区域。
   11. 测量阈值区域：选择 分析 选项卡，然后选择 分析颗粒。在 分析颗粒 窗口中，将 大小 设置为 20-无穷大，勾选 像素单位，将 圆度 设置为 0.00−1.00，将 显示 设置为 轮廓。勾选 显示结果、汇总 和 包含孔洞。
       注意：BrdU 阳性细胞的数值将自动在结果窗口中生成，显示每个 BrdU 阳性细胞的单独测量值。此外，系统将自动生成汇总窗口，显示计数数量、总面积、平均大小以及 BrdU 阳性细胞所占面积百分比。
   12. 重复步骤 5.4.10 和 5.4.11，测量新的隐窝。所有测量隐窝的结果将在 汇总 窗口中显示。

结果

在第一个实验中，我们在第0天诱导小鼠发生黏膜炎，并在随后连续5天内每天处死一组小鼠。在测量小肠重量时，我们发现该参数从第2天持续下降至第4天，提示肠上皮细胞质量减少。我们还发现，在第5天时，小肠重量与第0天（未处理小鼠）相比无显著差异（图1）。通过BrdU掺入法测定的细胞增殖在第1天和第2天几乎完全被抑制，但在第4天和第5天，增殖分别增加了约4倍和5倍（Figure 2）。这种高增殖状态在隐窝深度的测量中也得到了体现（Figure 3）。然而，仅通过隐窝深度的测量无法反映第1天和第2天增殖细胞的丢失情况，此时隐窝深度减少了约13%，但与健康小鼠相比无显著差异。我们证实，在黏膜炎的再生阶段，BrdU掺入量与隐窝深度之间存在强相关性，但在急性期则不存在这种相关性，表明隐窝深度作为检测指标在黏膜炎急性期可能并不适用（Figure 4）。

讨论

在此，我们展示了一种易于实施的方法，用于在小鼠模型中研究小肠（SI）损伤与再生。目前存在多种用于肠道损伤研究的临床前动物模型，但必须认识到每种模型均具有独特性，且实验终点的选择必须与研究问题相匹配。该模型非常适合研究损伤后的适应性反应，但在将其作为黏膜炎的临床前模型使用时，应调整相应的实验终点。然而，将动物模型的研究结果转化为临床应用仍面临挑战²³。我们建议的小肠重量和细胞增殖等终点指标，应仅限于适应性反应的研究。研究内源性因素通常需要使用转基因小鼠；即使小肠切除术在小鼠中可行¹，本模型仍可作为一种替代方案，以避免术后死亡。当在转基因小鼠中应用该模型时，需密切观察动物状态，并每日监测其体重变化。在本研究过程中，部分小鼠体重下降高达30%，属于显著减轻。为避免敏感表型小鼠出现高死亡率，建议在转基因小鼠中先行预实验，因为可能需要调整照射剂量。

所述方法中的一个关键步骤是回肠（SI）的切除与称重。每次切除和处理操作应采用相同的方式，并由同一名研究人员完成，以避免不同实验批次之间出现较大差异。<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-氟尿嘧啶	Hospira Nordic AB, 瑞典	137853
Ketaminol®Vet	Merck, 新泽西州, 美国	511485
Rompun®Vet 赛拉嗪	Rompunvet, Bayer, 勒沃库森, 德国	148999
10% 中性缓冲福尔马林	Cell Path Ltd, 波伊斯, 英国	BAF-5000-08A
HistoClear	National Diagnostics, 英国	HS-200
Pertex	HistoLab®, 瑞典	840
BrdU	Sigma-Aldrich, 德国	B5002
Tris/EDTA pH 9 缓冲液	Thermofisher Scientific, 丹麦	TA-125-PM4X
过氧化物阻断剂	Ultravision Quanto 小鼠对小鼠试剂盒, Thermofisher Scientific, 丹麦	TL-060-QHDM
啮齿类阻断缓冲液	Ultravision Quanto 小鼠对小鼠试剂盒, Thermofisher Scientific, 丹麦	TL-060-QHDM
单克隆小鼠抗 BrdU 抗体	Thermofisher Scientific, 丹麦	MA1-81890
Lab Vision 抗体稀释液 OP Quanto	Thermofisher Scientific, 丹麦	TA-125-ADQ
辣根过氧化物酶	Ultravision Quanto 小鼠对小鼠试剂盒, Thermofisher Scientific, 丹麦	TL-060-QHDM
DAB Quanto 底物	DAB 底物试剂盒, Thermofisher Scientific, 丹麦	TA-125-QHDX
DAB Quanto 发色原	DAB 底物试剂盒, Thermofisher Scientific, 丹麦	TA-125-QHDX
Zen Lite 软件（蓝色版）	Carl Zeiss A/S		https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html
ImageJ 软件	LOCI, 威斯康星大学		https://imagej.nih.gov/ij/