评估化疗诱导黏膜炎小鼠模型中小肠损伤与适应的重要终点指标和增殖标志物

摘要

本文介绍了一种利用化疗诱导黏膜炎模型来建立小肠损伤及代偿性高增殖的重要终点指标和增殖标志物的实验方案。我们通过细胞周期特异性标记物检测增殖细胞，并采用小肠重量、隐窝深度和绒毛高度作为评估终点指标。

摘要

肠道适应是一种在肠道因创伤而丧失后发生的自然代偿机制。适应性反应（如隐窝细胞增殖和营养吸收增加）在恢复过程中至关重要，但目前对其理解仍不充分。了解这些适应性反应背后的分子机制，对于促进识别能够增强适应性的营养物质或药物具有重要意义。尽管已有多种方法和模型在文献中被描述，但为了获得可重复的数据，仍需要一种详细且具有可操作性的实验操作描述。本文介绍了一种利用化疗诱导小鼠黏膜炎模型来评估小肠损伤及代偿性高增殖的重要终点指标和增殖标志物的方法。我们展示了如何使用细胞周期特异性标记物检测增殖细胞，并以小肠重量、隐窝深度和绒毛高度作为评估终点。该方法中的关键步骤包括小肠的取出与称重，以及建议采用的较为复杂的软件系统进行测量。这些方法具有耗时短、成本低、易于操作和测量的优点。

引言

肠适应是当肠道因疾病或手术而丧失时发生的自然代偿机制^1,2。在受到损伤后，肠道会发生形态计量学和功能上的适应性反应，其特征是隐窝细胞增殖和营养吸收能力增强³。这一过程对恢复至关重要，但目前对其理解仍不充分。关于肠道适应性反应的实验研究主要集中在小肠切除术后小鼠、大鼠和猪体内发生的变化，然而，了解其他类型损伤（如化学性或细菌性损伤）背后适应性反应的分子机制，对于促进识别可增强适应性的营养物质或药物至关重要。实验上，已有多种方法被用于描述小肠病理的复杂分子和细胞指标，包括组织病理学评分和损伤结局的测定。尽管如此，现有文献中仍缺乏对如何执行获得可重复数据所需操作步骤的详细描述。在鉴定参与适应过程的因素（如肠道激素）时，需要一种简便、低成本且可重复的动物模型，本文建议采用化疗诱导的肠黏膜炎（CIM）模型。

测量小肠（SI）质量是评估损伤与适应反应最简单且信息丰富的指标之一。已知黏膜炎的特征包括肠上皮细胞凋亡、时间依赖性的绒毛萎缩以及有丝分裂减少。因此，在临床前模型中观察肠道形态学变化具有重要意义^4,5。在人体中，血浆瓜氨酸（一种功能性肠上皮细胞的标志物）水平下降与毒性评分、炎症标志物

方案

所有所述方法均按照丹麦动物实验管理法规（1987年）的指南进行。研究已获得丹麦动物实验监察局（2013-15-2934-00833）和当地伦理委员会的许可。

注意：选用雌性 C57BL/6J 小鼠（约 20−25 g），每笼饲养 8 只，饲养环境为标准的 12 小时光照/12 小时黑暗循环，可自由饮水并摄取标准饲料。动物在实验开始前适应环境一周。

1. 使用5-氟尿嘧啶诱导黏膜炎

1. 获取浓度为 50 mg/mL 的 5-氟尿嘧啶（5-FU）溶液。
2. 称量并记录小鼠的体重。根据体重计算注射用 5-FU 的用量（例如，400 mg/kg）。
3. 准备一支连接 27 G × 30 mm 针头的 1 mL 注射器，并将计算好的 5-FU 注射剂量抽入注射器中。
4. 采用抓颈皮法固定小鼠。操作时，用一只手抓住小鼠尾根部，并将其尾部置于可抓握的表面（如金属网盖）上。在用一只手固定尾部的同时，用另一只手抓住其颈部背侧的皮肤。
5. 用同一只手的拇指和食指尽可能向后伸展，将小鼠身体牢固地固定在手掌上，并将尾部夹在该手的手指之间以稳定小鼠。
6. 在保持小鼠稳固而轻柔抓握的同时，暴露其腹侧面，将针头插入腹部右下或左下象限的腹膜腔内。回抽确认针头位置正确后，注射 400 mg/kg 的 5-FU。

结果

在第一次实验中，我们在第0天诱导小鼠发生黏膜炎，并在随后连续5天内每天处死一组小鼠。在测量小肠（SI）重量时，我们发现该参数从第2天持续下降至第4天，提示肠上皮细胞质量减少。我们还发现，在第5天时，小肠重量与第0天（未处理小鼠）相比无显著差异（图1）。通过BrdU掺入法测定的细胞增殖在第1天和第2天几乎完全被抑制，但在第4天和第5天，增殖分别增加了约4倍和5倍（Figure 2）。这种高增殖状态在隐窝深度的测量中也得到了体现（Figure 3）。然而，仅通过隐窝深度的测量无法反映第1天和第2天增殖细胞的丢失情况，此时隐窝深度减少了约13%，但与健康小鼠相比无显著差异。我们证实，在黏膜炎的再生阶段，BrdU掺入量与隐窝深度之间存在强相关性，但在急性期则不存在这种相关性，表明隐窝深度作为检测指标在黏膜炎急性期可能并不适用（Figure 4）.......

讨论

在此，我们展示了一种易于实施的方法，用于在小鼠模型中研究小肠（SI）损伤与再生。目前存在多种用于肠道损伤研究的临床前动物模型，但必须认识到每种模型均具有独特性，且实验终点的选择必须与研究问题相匹配。该模型非常适合研究损伤后的适应性反应，但在将其作为黏膜炎的临床前模型使用时，应调整相应的实验终点。然而，将动物模型的研究结果转化为临床应用仍面临挑战²³。我们建议的小肠重量和细胞增殖等终点指标，应仅限于适应性反应的研究。研究内源性因素通常需要使用转基因小鼠；即使小肠切除术在小鼠中可行¹，本模型仍可作为一种替代方案，以避免术后死亡。当在转基因小鼠中应用该模型时，需密切观察动物状态，并每日监测其体重变化。在本研究过程中，部分小鼠体重下降高达30%，属于显著减轻。为避免敏感表型小鼠出现高死亡率，建议在转基因小鼠中先行预实验，因为可能需要调整照射剂量。

所述方法中的一个关键步骤是回肠（SI）的切除与称重。每次切除和处理操作应采用相同的方式，并由同一名研究人员完成，以避免不同实验批次之间出现较大差异。<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-氟尿嘧啶	Hospira Nordic AB, 瑞典	137853
Ketaminol®Vet	Merck, 新泽西州, 美国	511485
Rompun®Vet 赛拉嗪	Rompunvet, Bayer, 勒沃库森, 德国	148999
10% 中性缓冲福尔马林	Cell Path Ltd, 波伊斯, 英国	BAF-5000-08A
HistoClear	National Diagnostics, 英国	HS-200
Pertex	HistoLab®, 瑞典	840
BrdU	Sigma-Aldrich, 德国	B5002
Tris/EDTA pH 9 缓冲液	Thermofisher Scientific, 丹麦	TA-125-PM4X
过氧化物阻断剂	Ultravision Quanto 小鼠对小鼠试剂盒, Thermofisher Scientific, 丹麦	TL-060-QHDM
啮齿类阻断缓冲液	Ultravision Quanto 小鼠对小鼠试剂盒, Thermofisher Scientific, 丹麦	TL-060-QHDM
单克隆小鼠抗 BrdU 抗体	Thermofisher Scientific, 丹麦	MA1-81890
Lab Vision 抗体稀释液 OP Quanto	Thermofisher Scientific, 丹麦	TA-125-ADQ
辣根过氧化物酶	Ultravision Quanto 小鼠对小鼠试剂盒, Thermofisher Scientific, 丹麦	TL-060-QHDM
DAB Quanto 底物	DAB 底物试剂盒, Thermofisher Scientific, 丹麦	TA-125-QHDX
DAB Quanto 发色原	DAB 底物试剂盒, Thermofisher Scientific, 丹麦	TA-125-QHDX
Zen Lite 软件（蓝色版）	Carl Zeiss A/S		https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html
ImageJ 软件	LOCI, 威斯康星大学		https://imagej.nih.gov/ij/