本实验方案的目的是描述一种用于分析成年神经干细胞/祖细胞在特定局部神经环路化学遗传学操控下行为反应的方法。
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摘要
摘要
成年神经发生是一个动态过程，指齿状回（DG）颗粒下区（SGZ）中 newly activated 的神经干细胞（NSCs）生成新的神经元，这些新生神经元整合到已有的神经回路中，并参与特定的海马功能。重要的是，成年神经发生极易受到环境刺激的影响，从而实现对多种认知功能的活动依赖性调控。大量来自不同脑区的神经回路共同协调这些复杂的认知功能。因此，理解特定神经回路如何调控成年神经发生具有重要意义。本文介绍了一种利用仅由设计药物激活的设计受体（DREADDs）技术来操控神经回路活动的实验方案，该技术可用于调控啮齿类动物中的神经干细胞及其新生子代细胞。该综合性方案包括立体定位注射病毒颗粒、化学遗传学激活特定神经回路、胸腺嘧啶类似物给药、组织处理、免疫荧光标记、共聚焦成像以及对各阶段神经前体细胞的成像分析。本方案详细说明了用于可视化神经干细胞及其子代细胞的抗原修复技术，并描述了一种简单而有效的方法，即通过饮用含氯氮平-N-氧化物（CNO）的水或直接注射CNO，结合表达DREADDs的病毒，来调控脑内神经回路。该方案的优势在于其可适应性，可用于研究多种影响源自神经干细胞的成年神经发生的神经回路。
引言
成年神经发生是指在成年个体中产生新神经元并将其整合到现有神经网络中的生物学过程1。在人类中，这一过程发生在海马体的齿状回（DG）区域，每天约有1,400个新细胞在此生成2。这些细胞位于DG的内层区域，该区域包含一个被称为颗粒下区（SGZ）的神经发生微环境。在此区域，海马体成年神经干细胞（NSCs）经历复杂的发育过程，最终转变为功能完整的神经元，参与调控特定的大脑功能，包括学习与记忆、情绪调节以及应激反应3,4,5,6。为了影响行为，成年NSCs受到多种外部刺激的高度调控，其调控方式具有活动依赖性，能够响应来自局部和远端的多种化学信号。这些化学信号包括神经递质和神经调质，它们以回路特异性的方式来自不同脑区。重要的是，这些化学信号在NSCs上的全回路汇聚，使得干细胞的激活、分化及命运决定得以实现独特而精确的调控。
在体内研究成体神经干细胞（NSCs）的环路调控，最有效的方法之一是将免疫荧光分析与全环路水平的干预手段相结合。免疫荧光分析是研究成体神经干细胞的常用技术，通过使用针对特定分子标志物的抗体，来指示成体神经干细胞所处的发育阶段....
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方案
所有涉及动物实验的操作均已获得北卡罗来纳大学教堂山分校机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 病毒颗粒的立体定位注射
- 确定目标神经环路。这将决定后续实验所使用的病毒和小鼠品系。
注意：在本示例中，通过刺激对侧苔藓细胞投射，以分析其对成年神经发生的效应。将编码AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry的病毒颗粒递送至5ht2A-Cre小鼠的齿状回（DG）15。 - 在手术前至少30分钟，对一只8周龄雄性杂合型5ht2A-Cre小鼠皮下注射美洛昔康（5 mg/kg），以提供预先镇痛。
- 使用含4%异氟烷的氧气混合气体对小鼠进行麻醉，直至其呼吸减慢且失去意识。将小鼠置于异氟烷麻醉舱内，并通过脚趾夹捏测试确认其无反应。
- 将小鼠固定于立体定位仪上，并置于小型动物加热垫上以维持体温，同时在每只眼睛上涂抹眼用润滑剂。小鼠进入立体定位仪后，将异氟烷浓度降低至1.5%。
注意：此阶段耳杆的放置至关重要。放置耳杆后应确保头部水平。更详细的说明可参见Geiger等人的研究16。 - 将脱毛剂涂抹于头部，最多停留1分钟。使用乙醇擦拭纸擦拭头部以去除毛发。若毛发未完全清除，重复此过程直至头顶无毛....
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结果
根据上述实验步骤（图1A、B），我们能够确定刺激齿状回（DG）对侧苔藓细胞投射对海马区神经发生微环境的影响。通过使用Cre依赖的Gq偶联刺激型DREADD病毒，并结合标记苔藓细胞的5-HT2A Cre小鼠品系，我们选择性地激活了苔藓细胞向对侧DG的兴奋性投射，结果表明强烈的苔藓细胞刺激促进了神经干细胞的静息状态（图1C）。在组织分析前，我们验证了病毒注射位置的准确性（图2A、B）。此外，我们通过c-fos免疫组织化学实验验证了苔藓细胞的激活（数据未显示）。若病毒注射位置不当，则应将该动物排除在后续分析之外。注射不当是指未能准确靶向目标坐标、大部分表达区域位于目标区域之外，或病毒递送量极少甚至没有。在本实验中，DG门区的苔藓细胞为预期靶点，若注射位置偏离门区，则予以排除。通过使用胸腺嘧啶类似物EdU，并按照第5.2和5.3节所述进行巢蛋白（nestin）染色的抗原修复，我们成功标记了正在增殖的神.......
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讨论
本实验方案的目的是通过一系列免疫组织化学技术，在体内评估操控特定神经环路对成年海马神经发生的调控作用。检测由特定神经环路介导的、依赖于神经活动的成年神经发生调控是一种极具价值的技术，且具有广泛的可修改性，可用于研究多种不同的神经环路。此类实验的成功依赖于多个因素，包括准确的病毒递送、针对所需操控选择合适的病毒类型、正确给予胸腺嘧啶类似物、动物年龄、免疫染色效率、成功的经心灌注以及对图像的无偏定量分析。例如，病毒递送不准确可能导致脱靶效应，从而产生与目标环路无关的表型。此外，低质量的免疫荧光技术可能掩盖实际存在的细胞数量，进而产生无生物学意义的表型。另一个需要严格控制的重要因素是实验小鼠的年龄，因为成年神经发生具有年龄依赖性22。最后，必须对每一部分进行无偏评分。为减少偏差，应采用系统化的方法，并确保评分人员能够熟练地利用形态学信息识别成年神经干细胞（NSC）发育的各个阶段。此外，应对对照组和处理组实行盲法评分，并在完成图像定量后再揭示其分组信息。为进一步减少偏差，可由两名独立的研究人员分别对同一数据集进行定量分析，以验证观察结果的可靠性。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
L.J.Q. 获得了美国国立卫生研究院国家精神卫生研究所的资助，资助项目包括多元化补充基金 R01MH111773 以及 T32 培训基金 T32NS007431-20。本项目获得了 NIH（MH111773、AG058160 和 NS104530）授予 J.S. 的基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24 孔板 | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 孔板 | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| 70% 异丙醇 | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| 酒精消毒片 | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 叠氮化物 | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| 抗鸡 Nestin 抗体 | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| 抗山羊 DCX 抗体 | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| 抗小鼠 Tbr2 抗体 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| 聚维酮碘溶液 (Betadine 溶液) | Amazon | ||
| 柠檬酸储备液 [0.1 M]（21 g/L 柠檬酸） | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 氯氮平-N-氧化物 | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| 共聚焦软件 (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| 五水合硫酸铜(II) | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| 棉签 | Amazon | ||
| 盖玻片 | Denville Scientific | M1100-02 | |
| 精密擦拭纸 (Kimwipes) | Kimtech Science | 7557 | |
| 0.5 mm 钻头 | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| 乙二醇 | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton 2 英寸针头 | Hamilton Company | 7803-05 | |
| Hamilton 5 μL 型号 75 RN 注射器 | Hamilton Company | Ref: 87931 | |
| 高速钻机 | Foredom | 1474 | |
| 输注泵 | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| 注射用生理盐水溶液 | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| 胰岛素注射器 | BD Ultra-Fine 胰岛素注射器 | ||
| 异氟烷 | Henry Schein | 29405 | |
| 小型动物立体定位仪 | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica 切片机 | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair（脱毛产品） | Nair | ||
| 4% 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 带正电荷载玻片 | Denville Scientific | M1021 | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet 软膏 | Puralube | ||
| 20 片式载玻片架 | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| 载玻片架支架 | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| 小型动物加热垫 | K&H | ||
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP 笔（4 mm 笔尖） | PolySciences | 24230 | |
| 手术刀 | MedPride | 47121 | |
| Tris 缓冲液 (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| 三钠柠檬酸储备液 [0.1 M]（29.4 g/L 三钠柠檬酸） | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| 吐温 X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| 镊子 | Amazon | ||
| Vet Bond 组织粘合剂 | 3M | 1469SB |
参考文献
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
- Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R.
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