本实验方案的目的是描述一种用于分析成年神经干细胞/祖细胞在特定局部神经环路化学遗传学操控下行为反应的方法。
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摘要
摘要
成年神经发生是一个动态过程，指齿状回（DG）颗粒下区（SGZ）中 newly activated 的神经干细胞（NSCs）生成新的神经元，这些新生神经元整合到已有的神经回路中，并参与特定的海马功能。重要的是，成年神经发生极易受到环境刺激的影响，从而实现对多种认知功能的活动依赖性调控。大量来自不同脑区的神经回路共同协调这些复杂的认知功能。因此，理解特定神经回路如何调控成年神经发生具有重要意义。本文介绍了一种利用仅由设计药物激活的设计受体（DREADDs）技术来操控神经回路活动的实验方案，该技术可用于调控啮齿类动物中的神经干细胞及其新生子代细胞。该综合性方案包括立体定位注射病毒颗粒、化学遗传学激活特定神经回路、胸腺嘧啶类似物给药、组织处理、免疫荧光标记、共聚焦成像以及对各阶段神经前体细胞的成像分析。本方案详细说明了用于可视化神经干细胞及其子代细胞的抗原修复技术，并描述了一种简单而有效的方法，即通过饮用含氯氮平-N-氧化物（CNO）的水或直接注射CNO，结合表达DREADDs的病毒，来调控脑内神经回路。该方案的优势在于其可适应性，可用于研究多种影响源自神经干细胞的成年神经发生的神经回路。
引言
成年神经发生是指在成年个体中产生新神经元并将其整合到现有神经网络中的生物学过程1。在人类中，这一过程发生在海马体的齿状回（DG）区域，每天约有1,400个新细胞在此生成2。这些细胞位于DG的内层区域，该区域包含一个被称为颗粒下区（SGZ）的神经发生微环境。在此区域，海马体成年神经干细胞（NSCs）经历复杂的发育过程，最终转变为功能完整的神经元，参与调控特定的大脑功能，包括学习与记忆、情绪调节以及应激反应3,4,5,6。为了影响行为，成年NSCs受到多种外部刺激的高度调控，其调控方式具有活动依赖性，能够响应来自局部和远端的多种化学信号。这些化学信号包括神经递质和神经调质，它们以回路特异性的方式来自不同脑区。重要的是，这些化学信号在NSCs上的全回路汇聚，使得干细胞的激活、分化及命运决定得以实现独特而精确的调控。
在体内研究成体神经干细胞（NSCs）的环路调控，最有效的方法之一是将免疫荧光分析与全环路水平的干预手段相结合。免疫荧光分析是研究成体神经干细胞的常用技术，通过使用针对特定分子标志物的抗体，来指示成体神经干细胞所处的发育阶段。这些标志物包括：nestin，作为放射状胶质细胞和早期神经前体细胞的标志物；Tbr2，作为中间前体细胞的标志物；以及dcx，作为成神经细胞和未成熟神经元的标志物7。此外，通过给予胸腺嘧啶类似物（如BrdU、CldU、IdU和EdU），可以对处于S期的细胞群体进行单独标记和可视化观察8,9,10。结合这两种方法，可探讨一系列科学问题，从特定发育阶段中增殖过程的调控机制，到不同信号如何影响神经干细胞的分化及神经发生过程。
目前有多种方法可用于有效调控神经环路，包括电刺激、光遗传学和化学遗传学，每种方法都有其各自的优缺点。电刺激需要进行复杂的手术，将电极植入特定脑区，随后通过电极传递电信号以调控目标脑区。然而，该方法缺乏细胞和环路水平的特异性。光遗传学涉及递送编码光敏受体的病毒颗粒，并通过植入的光纤传递激光来激活该受体，但该技术需要大量操作，成本高昂，且手术复杂11。化学遗传学则涉及递送编码仅由设计药物激活的设计受体（DREADDs）的病毒颗粒，随后通过一种特定且生物学惰性的配体——氯氮平-N-氧化物（clozapine N-oxide, CNO）进行激活12。利用DREADDs调控调控成年神经干细胞（NSCs）的局部神经环路的优势在于CNO给药方式简便且途径多样，这使得实验操作更省时，减少对动物的干预，且易于适用于长期研究以调控神经环路。
本方案所述方法是一套综合性的实验流程，用于成功探究成年海马神经发生的环路调控机制，结合了免疫荧光技术与利用化学遗传学进行的神经环路操控。以下方案适用于在体内同时刺激或抑制一个或多个神经环路，以确定其对成年神经发生的调控功能。若研究问题不需要高时间分辨率，则该方法尤为适用。对于需要在特定频率下精确控制刺激/抑制时间的研究问题，光遗传学方法更为合适13,14。本文所述方法易于应用于长期研究，且对动物干预较少，尤其适用于应激因素为主要关注点的实验条件。
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方案
所有涉及动物实验的操作均已获得北卡罗来纳大学教堂山分校机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 病毒颗粒的立体定位注射
- 确定目标神经环路。这将决定后续实验所使用的病毒和小鼠品系。
注意：在本示例中，通过刺激对侧苔藓细胞投射，以分析其对成年神经发生的效应。将编码AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry的病毒颗粒递送至5ht2A-Cre小鼠的齿状回（DG）15。 - 在手术前至少30分钟，对一只8周龄雄性杂合型5ht2A-Cre小鼠皮下注射美洛昔康（5 mg/kg），以提供预先镇痛。
- 使用含4%异氟烷的氧气混合气体对小鼠进行麻醉，直至其呼吸减慢且失去意识。将小鼠置于异氟烷麻醉舱内，并通过脚趾夹捏测试确认其无反应。
- 将小鼠固定于立体定位仪上，并置于小型动物加热垫上以维持体温，同时在每只眼睛上涂抹眼用润滑剂。小鼠进入立体定位仪后，将异氟烷浓度降低至1.5%。
注意：此阶段耳杆的放置至关重要。放置耳杆后应确保头部水平。更详细的说明可参见Geiger等人的研究16。 - 将脱毛剂涂抹于头部，最多停留1分钟。使用乙醇擦拭纸擦拭头部以去除毛发。若毛发未完全清除，重复此过程直至头顶无毛。
- 使用聚维酮碘溶液对无毛区域至少消毒3次。
- 将利多卡因局部溶液涂抹于头部无毛皮肤，静置1分钟。清除头部的利多卡因后，使用手术刀从眼睛起始处至耳部起始处做一长约2 mm的小切口。
注意：在进行任何切口前，需通过脚趾夹捏测试确认小鼠完全处于麻醉状态。 - 牵开头皮，并使用无菌棉签清理头部表面的结缔组织，直至前囟清晰可见。
- 定位前囟，并通过将钻头置于前囟和后囟坐标处并确认二者对齐，调整头部位置使前囟与后囟处于同一水平面。此外，将钻头置于前囟与后囟之间区域的左侧或右侧，以对齐左右半脑。
注意：此步骤极为关键；头部位置未正确对齐将影响立体定位坐标准确性。 - 使用0.5 mm钻头从前囟开始，按以下坐标钻孔：前后轴（AP）-2.00 mm，内外轴（ML）+1.50 mm，钻出直径为0.5 mm至1 mm的孔。
注意：应根据目标神经环路的具体情况调整坐标。本示例旨在靶向单侧含有苔藓细胞的齿状回，以研究其对对侧成年神经干细胞的影响。 - 更换为5 μL注射器和26–33 G针头。以前囟为零点，在以下坐标处进行注射：将针头插入钻孔，前后轴-2.00 mm，内外轴-1.50 mm，背腹轴-2.3 mm。
- 使用输注泵（材料表），以50–100 nL/min 的速度向目标半脑注入500 nL腺相关病毒（AAV）（来自病毒核心库或商业来源）。注射完成后，至少等待5分钟，再缓慢将针头从脑组织中撤出。
注意：这些坐标可能需要根据小鼠的年龄和体型进行调整。不同血清型的病毒具有不同的扩散模式，建议在正式实验前进行预实验以检测病毒扩散范围。 - 使用生理盐水清洁切口周围的头皮和皮肤，然后用镊子夹合皮肤，同时使用组织粘合剂（材料表）封闭切口。术后所有操作，包括在加热垫上监测恢复情况直至小鼠恢复活动能力、对伤口施用镇痛剂以及连续两天给予止痛药，均应执行。
注意：许多实验在病毒注射后需等待2–4周，以确保病毒充分表达。
2. 氯氮平-N-氧化物给药
- 通过将 10 mg CNO 溶解于 100 µL 二甲基亚砜（DMSO）中并涡旋振荡，制备 CNO 储存液。
注意：如果溶液未完全溶解，可增加 DMSO 体积，但过多 DMSO 可能使饮水变苦。CNO 水溶液中 DMSO 浓度不得超过 0.1%，200 mL 溶液中 DMSO 总体积不得超过 200 µL。CNO 储存液可在 -20 °C 下保存最多两周。 - 每 200 mL 饮水中加入 10–50 µL 的 10 mg/100 µL CNO 储存液，使终浓度达到 1–5 mg/200 mL。CNO 水溶液需每日新鲜配制。
注意：若小鼠因苦味拒饮，部分研究组已在饮水中添加高达 1% 的糖精以掩盖苦味。所研究的神经环路响应程度取决于激活水平。通常情况下，1 mg CNO/200 mL 即足以激活大多数神经环路17。 - 在立体定位注射后恢复两周的小鼠中，将 CNO 溶液置于铝箔包裹或避光容器中，在 4 天内给予给药（参见步骤 1.13）。
注意：CNO 对光敏感，整个操作过程中应尽量减少光照暴露。 - 每日配制新鲜 CNO 溶液时，测量并记录小鼠消耗的 CNO 水溶液体积。成年小鼠平均每日消耗约 4 mL CNO 水溶液。此外，需每日记录小鼠体重，以确保其正常饮水。
- 确保每个实验均设置适当的对照组。应包括 CNO 对照和 DREADD 对照。实验设计示例如下：（1）载体对照 + 携带病毒报告基因但不含 DREADD 的自主水陆两用载体（AAV）；（2）CNO + 携带病毒报告基因但不含 DREADD 的 AAV；（3）CNO + 携带 DREADD 的 AAV。
注意：所有实验组溶液中均含有 DMSO。由于各组中 DMSO 含量低于 0.1%，已证实该浓度对成年小鼠神经干细胞无不良影响，因此未设置单独的 DMSO 对照组。若对饮水中使用 DMSO 存有疑虑，可额外增设无 DMSO 和生理盐水对照组。
3. 胸腺嘧啶类似物标记
- 在给予CNO后第4天进行组织采集时，通过一系列胸苷类似物5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（Edu）腹腔注射标记增殖细胞。
注意：本方案使用Edu。然而，还有其他几种胸苷类似物可有效标记增殖细胞群体，包括Brdu、Idu和Cidu8。- 称取Edu，用兽用级0.9%氯化钠注射液配制成4 mg/mL溶液，通过涡旋振荡并置于旋转仪上15分钟使其溶解。
注意：胸苷类似物具有毒性且对光敏感。操作时应遵循材料安全数据表（MSDS）的要求，并用铝箔包裹溶液以避免光照。 - 以40 mg/kg剂量或按每10 g体重注射0.1 mL的4 mg/mL Edu溶液，每隔2小时腹腔注射一次，共注射4次。
注意：剂量超过50 mg/kg时接近饱和水平，不会显著增加被标记的增殖细胞数量18。所有小鼠必须接受相同剂量的Edu注射，因为标记不当可能导致结果偏差。
- 称取Edu，用兽用级0.9%氯化钠注射液配制成4 mg/mL溶液，通过涡旋振荡并置于旋转仪上15分钟使其溶解。
4. 组织制备与处理
- 在最后一次EdU注射后2小时，使用异氟烷麻醉舱对小鼠进行麻醉，直至呼吸明显减慢，并通过脚趾夹捏确认小鼠已完全镇静。
- 用针头将小鼠固定于操作台面，做一小切口暴露心脏。将25 G针头插入左心室主动脉，剪开右心室，以磷酸盐缓冲液（PBS）进行经心灌注，流速为1−4 mL/min，直至肝脏组织变白透明。
- 将灌注液更换为4%多聚甲醛（PFA），继续灌注约15−20 mL以固定脑组织。
注意：有关灌注过程的更详细说明可参见Gage等人的研究19。操作正确时可观察到动物出现轻微震颤。 - 使用大剪刀剪下头部，随后进行一系列精细切口以分离脑组织与颅骨。将脑组织置于4% PFA中，4 °C条件下保存过夜，继续固定。
- 将脑组织从4% PFA溶液中取出，转移至含10%蔗糖的PBS溶液中，4 °C下冷冻保护24小时。随后将组织转入30%蔗糖PBS溶液中，4 °C下再孵育24小时，之后进行切片。
注意：当脑组织在蔗糖溶液中下沉时，表明其已适合进行切片机切片。脑组织可在30%蔗糖溶液中长期保存。 - 使用切片机将脑组织进行冠状面切片，厚度为40 µm。从齿状回起始处开始收集切片，位置约为前囟后-1.20 mm，至终板完全结束为止，第一张切片为最前部，最后一张为最后部。参考小鼠脑图谱以准确定位齿状回（DG）及起始切片收集坐标。
- 将每张切片按顺序每6张排成一行，置于盛有防冻液（表1）的48孔板中保存。
| 抗冻液 | 乙二醇 150 mL + 蔗糖 150 g + 用 0.1 M 磷酸缓冲液定容至 500 mL，配制 500 mL 溶液 |
| 柠檬酸盐缓冲液 | 9 mL 柠檬酸贮存液 + 41 mL 三钠柠檬酸缓冲液 + 450 mL ddH₂O2O |
| 柠檬酸储备液 | [0.1 M] 柠檬酸 21 g/1 L ddH₂O2O |
| 三水合柠檬酸钠储备液 | [0.1 M] 三水合柠檬酸钠 29.4 g/1 L ddH₂O2O |
| Tris缓冲盐水-吐温（TBS-吐温） | TBS 中含 0.05% 100-x Triton |
| 通透缓冲液 | TBS 中含 0.5% 100-x Triton |
| 封闭缓冲液 | 0.33 mL 驴血清加入 10 mL TBS-Triton 中 |
| Edu反应溶液 | 制备 CuSO₄ 溶液4·5H2通过加入1 mg的CuSO₄来制备O溶液4·5H2O 在 4 mL 的 [0.1 M] Tris（pH 8.5）溶液中。然后加入 600 µM Alexa488-叠氮化物溶液的 1:40 稀释液以及 10 mg/mL 的 L-Na+ 抗坏血酸加入至 CuSO₄4·5H2在应用于组织前，将O溶液进行预处理。 |
表1：免疫组织化学所用溶液。
5. 免疫组织化学
- 基础漂浮法染色步骤
注意：若进行巢蛋白（nestin）染色，请跳过第5.1节，直接进入第5.2节。本基础漂浮法仅适用于Tbr2或双皮质素（doublecortin, DCX）染色，不包含胸腺嘧啶类似物Edu的染色。- 将组织切片按顺序从抗冻液转移至48孔板中的Tris缓冲盐水（TBS）中。
- 用TBS-吐温溶液（0.05% TBS-triton，表1）洗涤切片两次，每次5分钟，每次更换溶液时轻轻吸除液体，并在摇床或振荡器上以低速振荡。
- 使用通透缓冲液（0.5% TBS-triton，表1）对切片进行通透处理，持续20−30分钟，同时在低速下振荡。
- 在10 mL TBS-triton中加入0.33 µL驴血清配制封闭缓冲液。现配现用，且在3天内使用完毕。
- 吸除通透缓冲液，将切片在封闭缓冲液中于室温（RT）孵育30分钟至1小时。
- 将一抗用封闭缓冲液稀释后加入各孔中。每孔加入500 µL足以完全浸没所有组织切片。在摇床或振荡器上于室温孵育过夜。
- 吸除溶液，用TBS-triton洗涤切片3次，每次10分钟，以彻底去除残留的一抗。
- 将切片在含封闭缓冲液的荧光标记二抗溶液中孵育2小时，于室温在摇床上进行。
- 用TBS-triton洗涤切片3次，每次5分钟，随后将切片在DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）溶液（300 µM溶液按1:100稀释于PBS中）中孵育15分钟。
- 用PBS洗涤切片3次，然后按从前到后的顺序将切片转移至带正电荷的载玻片上贴片。在室温下晾干至肉眼不可见水分，通常约需2−5分钟，之后用封片剂加盖盖玻片。
- 抗原修复
注意：本步骤仅针对巢蛋白（nestin）染色所需。若进行巢蛋白染色，应在胸腺嘧啶类似物染色（第5.3节）之前完成本步骤。若进行Tbr2或DCX与Edu联合染色，则跳过此步骤。- 将组织切片置于PBS中，按从前到后的顺序在带正电荷的载玻片上贴附5−8个切片。于室温下晾干约2−5分钟，直至切片完全附着于载玻片，且肉眼不可见水分。
- 在容器（通常为1,000 µL移液枪头盒）中配制柠檬酸盐缓冲液（表1）。
- 将柠檬酸盐缓冲液放入微波炉（1,000 W）加热5分钟，直至溶液沸腾。加热期间，将已贴片的切片放入可容纳20张载玻片的玻璃架中。5分钟后，小心将载玻片架连同切片放入移液枪头盒中。
- 将微波炉功率设为50%，加热时间设为7分钟。启动7分钟计时器并密切观察微波炉运行情况。在7分钟内，当溶液开始沸腾时暂停加热，待沸腾停止后继续加热。
注意：本步骤的目标是使溶液温度维持在接近但低于沸点的状态持续7分钟。计时器结束即停止加热，即使微波炉设定的加热时间尚未完成。更详细的说明可参见Hussaini等人的研究20。 - 将含有柠檬酸盐缓冲液和组织切片的温热容器取出，放入冰桶中冷却。加盖以防冰屑或其他杂质进入溶液。静置约30分钟，或直至溶液冷却至可触碰温度。
- 若使用胸腺嘧啶类似物，请继续进行第5.3.2步的染色操作。
- 胸腺嘧啶类似物染色
注意：若进行Edu与Tbr2或Edu与DCX的联合染色，请从此步骤开始。- 将组织切片置于PBS中，按从前到后且方向一致的顺序在带正电荷的载玻片上贴附5−8个切片。晾干使切片牢固附着后，使用疏水笔或PAP笔在组织周围画出封闭圈。
- 使用通透缓冲液（0.5% TBS-triton）对切片进行20−30分钟的通透处理，随后用TBS-triton洗涤2次，每次5分钟。
注意：通透处理有助于抗体进入细胞内。通透时间可根据组织厚度和抗体效率进行调整。也可通过提高去垢剂浓度来增强通透效果。但需注意避免通透时间过长，因长时间通透会增加组织脆性。 - 根据表1配制Edu反应液。最终反应体系中Alexa488-叠氮化物的浓度为15 µM（总体积1 mL）。
- 将切片在Edu反应液中孵育30分钟至1小时，随后用TBS-triton洗涤3次，每次5分钟。此后用铝箔包裹载玻片以避光。此时可使用荧光显微镜检测Edu反应是否成功：Edu标记的细胞在落射荧光显微镜下会发出荧光。
- 已贴片组织切片染色步骤
- 对第5.3.4步中已贴片的组织切片使用与二抗来源动物相同的封闭缓冲液（如驴血清）进行封闭，室温孵育30分钟至1小时，随后用TBS-triton洗涤2次，每次5分钟。
- 在封闭过程中，将一抗（例如鸡抗nestin）按1:200比例溶于封闭缓冲液中配制抗体溶液。每张载玻片加入250 µL即可确保组织完全浸没。
- 封闭洗涤后，将组织切片在含一抗的溶液中于室温孵育过夜。根据所用一抗的特性可对此步骤进行调整。
注意：若抗体背景较高或存在非特异性结合，改用4 °C孵育可能改善结果。对于组织穿透性较差的抗体，可根据需要延长至2天孵育时间。 - 用TBS-triton将切片洗涤3次，每次5分钟，以去除多余的一抗。随后将切片在含荧光标记二抗（例如Alexa 647标记的抗鸡抗体，1:200稀释）的封闭缓冲液中于室温孵育2小时。
- 再次用TBS-triton洗涤切片3次，每次5分钟，以去除多余的二抗，然后在PBS中按1:100稀释加入300 µM DAPI溶液，室温孵育15分钟。
- 用PBS洗涤切片3次，每次5分钟，以去除多余的DAPI。使用棉签或精细擦拭纸擦除组织周围的PAP笔画线。待切片干燥后，滴加封片剂并加盖盖玻片。封片剂完全干燥后再进行成像。
6. 图像采集
- 使用共聚焦显微镜（材料表），以40倍油镜、1 µm步长，或20倍物镜配合2倍缩放、1 µm步长，对DG的同一侧进行成像，并通过覆盖载玻片标签的方式对实验组和对照组实施盲法处理。
注意：40倍油镜可提供更高的分辨率，但成像时间长于20倍物镜配合2倍缩放。 - 将物镜设为40倍，然后在共聚焦软件（材料表）左上角点击定位选项卡，将目标DG切片置于视野中央。
- 找到DG后，切换至左上角的采集选项卡，并勾选以下选项：Z轴层扫、拼图扫描和位置。
- 设置各通道参数：增益为600−750，激光强度为1%−15%，偏移值为1−10。任何通道的激光强度均不得超过20%。在设置增益和激光强度时，确保无像素过饱和。
注意：这些参数范围会因所用设备的性能和染色效率的不同而有所变化。 - 在拼图扫描窗口中将拼图设为7个水平方向×3个垂直方向，使用当前相同的设置点击扫描概览图像。例如，使用7×3拼图，配合20倍物镜和2倍缩放。
- 完成概览扫描后，确保DG完全位于预期图像范围内。若未完全包含，请调整DG视野，使其完全落入概览图像中，因为该图像将代表最终获取的成像区域。
- 通过微调焦旋钮浏览不同的Z轴层扫图像，设定成像深度。确保整个DG位于起始和终止位置之间。假设步长为1 µm，则每幅图像大约包含40个Z层。
- 在采集模式窗口中将扫描速度设为9，启用双向扫描且不进行平均。然后在位置窗口中添加相应位置。
注意：重复步骤6.3−6.8，可同时对多个DG进行成像。提高扫描速度会降低图像质量，但可缩短总体成像时间。若图像质量过低，可降低扫描速度或增加平均次数。 - 准备就绪后，点击开始实验按钮。每只小鼠沿前后轴采集5个DG切片图像。例如，若第一节段成像左侧DG，则第二节段应成像下一个更靠后的左侧DG。
- 使用共聚焦软件“处理”选项卡下的拼接功能，将各独立图像拼接成完整的齿状回图像。或者，可使用FIJI（ImageJ）软件将图像拼接为完整的齿状回结构。
- 保存拼接后的图像用于定量分析。
7. 图像分析
- 使用 FIJI 打开每个齿状回切片的每张图像，分别以最大投影和通道合并为不同颜色的复合图像形式呈现，以便于直观观察共定位情况。
- 使用多边形选择工具（左侧第三个框），测量每只小鼠每张最大投影图像切片中齿状回（DG）的面积，并记录每只小鼠每一节段的数据。该面积将用于计算密度。
- 使用 FIJI 软件中“插件”菜单下的细胞计数器（Cell Counter）插件，记录复合图像中齿状回（DG）区域同时显示初级抗体（即 nestin）和胸腺嘧啶类似物 Edu 共定位的细胞数量 插件 | 分析 | 细胞计数仪 | 细胞计数仪此外，记录具有放射状突起的EdU阳性细胞和nestin阳性细胞的总数。
注意： 对于巢蛋白（nestin），形态学观察尤为重要。在定量神经干细胞时，应仅对具有放射状突起的细胞进行计数。在对齿状回切片进行定量时，须对所有样本采用相同的标准，尤其是在观察焦点平面以外的细胞时。若细胞不在焦点平面上，则不应计入。详见 West 等人的研究。21 有关体视学定量的更详细说明。 - 在电子表格软件中输入细胞计数，以汇总所有数据，供后续分析使用。
- 通过将每只动物每个切片中双标细胞的总数除以该切片的总体积，计算每个切片中双标细胞的密度。例如，通过将一只动物中nestin+/EdU+细胞的总数除以该动物齿状回（DG）体积的总和，获得干细胞密度。假设每个Z轴步进为1 µm，将每个切片的面积乘以Z轴步进总数，计算该切片的体积。
注意： 在此方案中，总步数应接近40步，因为组织切片厚度为40 µm。确保每只动物作为一个数据点，因为该方法的目的是估算海马单侧半球中共定位细胞的总数。 - 进行旨在解答研究问题所需的其他必要计算。在本示例中，计算刺激对侧苔藓细胞后增殖细胞的总数、干细胞总体数量以及增殖干细胞所占百分比。
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结果
根据上述实验步骤（图1A、B），我们能够确定刺激齿状回（DG）对侧苔藓细胞投射对海马区神经发生微环境的影响。通过使用Cre依赖的Gq偶联刺激型DREADD病毒，并结合标记苔藓细胞的5-HT2A Cre小鼠品系，我们选择性地激活了苔藓细胞向对侧DG的兴奋性投射，结果表明强烈的苔藓细胞刺激促进了神经干细胞的静息状态（图1C）。在组织分析前，我们验证了病毒注射位置的准确性（图2A、B）。此外，我们通过c-fos免疫组织化学实验验证了苔藓细胞的激活（数据未显示）。若病毒注射位置不当，则应将该动物排除在后续分析之外。注射不当是指未能准确靶向目标坐标、大部分表达区域位于目标区域之外，或病毒递送量极少甚至没有。在本实验中，DG门区的苔藓细胞为预期靶点，若注射位置偏离门区，则予以排除。通过使用胸腺嘧啶类似物EdU，并按照第5.2和5.3节所述进行巢蛋白（nestin）染色的抗原修复，我们成功标记了正在增殖的神...
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讨论
本实验方案的目的是通过一系列免疫组织化学技术，在体内评估操控特定神经环路对成年海马神经发生的调控作用。检测由特定神经环路介导的、依赖于神经活动的成年神经发生调控是一种极具价值的技术，且具有广泛的可修改性，可用于研究多种不同的神经环路。此类实验的成功依赖于多个因素，包括准确的病毒递送、针对所需操控选择合适的病毒类型、正确给予胸腺嘧啶类似物、动物年龄、免疫染色效率、成功的经心灌注以及对图像的无偏定量分析。例如，病毒递送不准确可能导致脱靶效应，从而产生与目标环路无关的表型。此外，低质量的免疫荧光技术可能掩盖实际存在的细胞数量，进而产生无生物学意义的表型。另一个需要严格控制的重要因素是实验小鼠的年龄，因为成年神经发生具有年龄依赖性22。最后，必须对每一部分进行无偏评分。为减少偏差，应采用系统化的方法，并确保评分人员能够熟练地利用形态学信息识别成年神经干细胞（NSC）发育的各个阶段。此外，应对对照组和处理组实行盲法评分，并在完成图像定量后再揭示其分组信息。为进一步减少偏差，可由两名独立的研究人员分别对同一数据集进行定量分析，以验证观察结果的可靠性。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
L.J.Q. 获得了美国国立卫生研究院国家精神卫生研究所的资助，资助项目包括多元化补充基金 R01MH111773 以及 T32 培训基金 T32NS007431-20。本项目获得了 NIH（MH111773、AG058160 和 NS104530）授予 J.S. 的基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24 孔板 | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 孔板 | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| 70% 异丙醇 | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| 酒精消毒片 | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 叠氮化物 | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| 抗鸡 Nestin 抗体 | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| 抗山羊 DCX 抗体 | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| 抗小鼠 Tbr2 抗体 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| 聚维酮碘溶液 (Betadine 溶液) | Amazon | ||
| 柠檬酸储备液 [0.1 M]（21 g/L 柠檬酸） | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 氯氮平-N-氧化物 | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| 共聚焦软件 (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| 五水合硫酸铜(II) | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| 棉签 | Amazon | ||
| 盖玻片 | Denville Scientific | M1100-02 | |
| 精密擦拭纸 (Kimwipes) | Kimtech Science | 7557 | |
| 0.5 mm 钻头 | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| 乙二醇 | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton 2 英寸针头 | Hamilton Company | 7803-05 | |
| Hamilton 5 μL 型号 75 RN 注射器 | Hamilton Company | Ref: 87931 | |
| 高速钻机 | Foredom | 1474 | |
| 输注泵 | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| 注射用生理盐水溶液 | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| 胰岛素注射器 | BD Ultra-Fine 胰岛素注射器 | ||
| 异氟烷 | Henry Schein | 29405 | |
| 小型动物立体定位仪 | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica 切片机 | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair（脱毛产品） | Nair | ||
| 4% 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 带正电荷载玻片 | Denville Scientific | M1021 | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet 软膏 | Puralube | ||
| 20 片式载玻片架 | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| 载玻片架支架 | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| 小型动物加热垫 | K&H | ||
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP 笔（4 mm 笔尖） | PolySciences | 24230 | |
| 手术刀 | MedPride | 47121 | |
| Tris 缓冲液 (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| 三钠柠檬酸储备液 [0.1 M]（29.4 g/L 三钠柠檬酸） | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| 吐温 X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| 镊子 | Amazon | ||
| Vet Bond 组织粘合剂 | 3M | 1469SB |
参考文献
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