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方法文章

用于高效递送表观基因组编辑工具至人诱导性多能干细胞衍生疾病模型的慢病毒载体平台

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DOI：

10.3791/59241

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2019年3月29日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Duke University Medical Center, 2Center for Genomic and Computational Biology, Duke University Medical Center, 3Viral Vector Core, Duke University Medical Center, 4Division of Gynecologic Oncology, Department of Obstetrics and Gynecology, Duke University Medical Center

本文内容

摘要

靶向DNA表观基因组编辑是一种强大的治疗策略。本方案描述了用于人诱导性多能干细胞（hiPSC）来源神经元表观基因组编辑的、携带CRISPR-dCas9-DNMT3A转基因的一体化慢病毒载体的制备、纯化与浓缩过程。

摘要

利用人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的细胞是研究人类神经退行性疾病的一种重要方法。本文中，我们描述了一种优化的实验方案，用于将携带α-突触核蛋白基因（SNCA）位点三倍重复的患者来源的hiPSCs，定向分化为与帕金森病（PD）相关的多巴胺能神经元群体。越来越多的证据表明，SNCA 的高水平表达是导致帕金森病发生的原因之一。鉴于目前尚缺乏针对PD的新型治疗方法，尤其是能够调控SNCA表达水平的策略，我们近期开发了一种基于CRISPR/dCas9-DNA甲基化的系统，通过在SNCA第一内含子调控区富集甲基化水平，从而实现对SNCA转录的表观遗传调控。该系统采用慢病毒载体递送，其中包含一种失活的Cas9蛋白（dCas9）与DNA甲基转移酶3A（DNMT3A）催化结构域的融合蛋白。该系统应用于SNCA位点三倍重复的细胞后，可通过靶向SNCA第一内含子的DNA甲基化，使SNCA-mRNA和蛋白水平降低约30%。这种精细调控的SNCA表达下调能够挽救与疾病相关的细胞表型。在本实验方案中，我们旨在详细描述将hiPSCs分化为神经前体细胞（NPCs）的逐步操作流程，以及建立和验证用于评估SNCA第一内含子甲基化谱的焦磷酸测序分析方法。为进一步阐明本研究中所使用的慢病毒-CRISPR/dCas9系统，本方案还介绍了慢病毒载体的制备、纯化与浓缩方法，并强调其在利用hiPSCs和NPCs进行表观基因组和基因组编辑应用中的适用性。该方案具有良好的可扩展性，可用于制备高滴度慢病毒，适用于体外和体内实验。

引言

近年来已开发出多种表观基因组编辑平台，可用于靶向调控基因表达区域中的任意DNA序列1，2。所构建的表观基因组编辑工具旨在实现以下功能：（i）调控转录，（ii）改变组蛋白翻译后修饰，（iii）修饰DNA甲基化，以及（iv）调节调控元件间的相互作用。将转录/染色质修饰因子锚定于失活的Cas9（dead Cas9, dCas9）的方法，源于此前开发的表观基因组编辑平台，例如锌指蛋白（ZFPs）和转录激活因子样效应物（TALEs），这些平台包含一个强效的转录效应结构域（ED），并与设计的DNA结合结构域（DBD）融合3。期望获得的表型结果（如激活或抑制）由锚定在内源位点的效应分子决定（图1）。为构建可编程的转录激活子，dCas9/gRNA模块被连接至VP164，5，6（图1A），这是一种病毒激活结构域，可招募RNA聚合酶II及通用转录机器。对该系统的改进包括使用VP64（VP16结构域的四聚体），可实现更强的激活效率5

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方案

1. 系统设计与病毒制备

  1. 质粒设计与构建
    注意：通过使用Ortinski等人发表的生产与表达优化表达盒来构建一体化的LV-gRNA-dCas9-DNMT3A载体30。该载体盒包含转录因子Sp1识别位点的重复序列，以及3'长末端重复序列（LTR）非翻译区（U3'）中的先进缺失结构（图2A）30,36。该载体骨架已被证实可有效递送并表达CRISPR/Cas930,35。
    1. 通过定点诱变获得失活（死亡）版本的SpCas9（dCas9）（数据未显示）。将pBK30129中编码活性Cas9的片段替换为分别在HNH和RuvC催化结构域含有D10A和H840A突变的克隆，通过AgeI-BamHI片段交换实现（图3）。
    2. 从pdCas9-DNMT3A-eGFP（见材料表）中扩增DNMT3A催化结构域，引物为BamHI-429....

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结果

与原始 GFP 对照相比，LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro 载体生产滴度的验证

我们通过p24gag ELISA比较了LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro与原始GFP/Puro病毒的物理滴度。如图5A所示的代表性结果表明，采用本方案所制备的载体其物理产量相当。这说明优化后的载体骨架结合优化的生产流程，能够实现CRISPR/dCas9载体的高产量滴度。为了评估dCas9-DNMT3A转基因包装进入病毒颗粒的效率，我们将浓缩后的载体转导至HEK-293T细胞中（图5B）。然而，图5A所示结果表明，LV-dCas9-DNMT3A-GFP载体的转导率显著低于原始GFP载体（

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讨论

慢病毒载体（LVs）已逐渐成为表观基因组编辑的首选载体，尤其是在遗传性疾病领域，这主要归因于其具备以下两个优势：（i）能够容纳较大的DNA载荷；（ii）可高效转导多种分裂和非分裂细胞。LVs较高的包装效率在包装CRISPR/dCas9系统时尤为有利，因为这些系统体积较大。从这一角度来看，LVs是递送一体化CRISPR/Cas9系统的理想平台。事实上，常用于临床前和临床基因治疗的腺相关病毒（AAV）平台，难以完全容纳dCas9-效应蛋白系统的较大包装尺寸。实际上，AAV载体严格的包装容量限制阻碍了其在递送CRISPR/dCas9组件中的应用。为提高AAV的包装能力，已开发出多种新型基于AAV的平台。例如，最近构建了一种分裂型内含肽（split-intein）策略，将Cas9系统拆分为两个AAV载体38。该策略提高了整体包装容量，但需要同时生产和共转导两个AAV载体38。源自Staphylococcus aureus的SaCas9的发现，推动了SaCas9/向导RNA系统的开发39.......

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披露

杜克大学已就本研究提交了临时专利申请。

致谢

本工作部分由Kahn神经技术发展奖（授予O.C.）和美国国立卫生研究院/国家神经疾病与卒中研究所（NIH/NINDS）（R01 NS085011，授予O.C.）资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器设备
Optima XPN-80 超速离心机贝克曼库尔特A99839
0.22 μM 滤器单元，1 L康宁430513
0.45-μm 滤膜装置，500 mL康宁430773
100 mm 细胞培养处理培养皿康宁430167
15 mL 圆锥形离心管康宁430791
150 mm 细胞培养皿（经TC处理，带20 mm网格）康宁353025
50 mL 锥形离心管康宁430291
6孔板康宁3516
Aggrewell 800StemCell Technologies34811
Allegra 25R 台式离心机贝克曼库尔特369434
BD FACSBecton Dickinson338960
圆锥底超速离心管Seton Scientific5067
锥形管适配器Seton ScientificPN 4230
Eppendorf 细胞成像载玻片Eppendorf30742060
高结合力96孔板康宁3366
倒置荧光显微镜LeicaDM IRB2
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒（50）Qiagen27104
可逆过滤器StemCell Technologies27215
SW32Ti 转子贝克曼库尔特369650
VWR® 一次性血清移液管，玻璃，无热原VWR93000-694
VWR® 真空过滤系统VWR89220-694
xMark™ 微孔板吸光度读板仪伯乐（Bio-Rad）1681150
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
细胞培养试剂
人胚胎肾293T（HEK 293T）细胞ATCCCRL-3216
AccutaseStemCell Technologies7920
抗黏附冲洗液StemCell Technologies7010
抗FOXA2抗体AbcamAb60721
抗Nestin抗体AbcamAb18102
抗生素-抗真菌素溶液，100倍浓缩液Sigma AldrichA5955-100ML
B-27添加剂（50倍浓度），不含维生素A赛默飞世尔科技12587010
BESSigma AldrichB9879 - BES
牛血清白蛋白第五组分（7.5% 溶液）赛默飞世尔科技15260037
CHIR99021StemCell Technologies72052
Corning Matrigel hESC-合格基质康宁08-774-552
胎牛血清HycloneSH30087.04
DMEM-F12Lonza12-719
DMEM高糖培养基Gibco11965
DNeasy 血液 & 组织试剂盒Qiagen69504
EpiTect PCR 对照 DNA 套件Qiagen596945
EZ DNA甲基化试剂盒Zymo ResearchD5001
明胶Sigma AldrichG1800-100G
庆大霉素赛默飞世尔科技15750078
温和细胞解离试剂干细胞技术7174
GlutaMAX赛默飞世尔科技35050061
人重组bFGFStemCell Technologies78003
人源重组 EGFStemCell Technologies78006
人重组Shh（C24II）StemCell Technologies78065
MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）赛默飞世尔科技11140050
mTeSR1StemCell Technologies85850
N-2 补充剂（100 倍浓缩）赛默飞世尔科技17502001
Neurobasal 培养基赛默飞世尔科技21103049
非必需氨基酸（NEAA）HycloneSH30087.04
PyroMark PCR 试剂盒Qiagen978703
RPMI 1640 培养基赛默飞世尔科技11875-085
SB431542StemCell Technologies72232
丙酮酸钠Sigma AldrichS8636-100ML
STEMdiff 神经诱导培养基StemCell Technologies5835
STEMdiff 神经前体细胞冻存培养基StemCell Technologies5838
TaqMan 检测 FOXA2赛默飞世尔科技Hs00232764
TaqMan 检测 GAPDH赛默飞世尔科技Hs99999905
TaqMan 检测 巢蛋白赛默飞世尔科技Hs04187831
TaqMan 检测 OCT4赛默飞世尔科技Hs04260367
TaqMan 检测 PPIA赛默飞世尔科技Hs99999904
0.05% 胰蛋白酶-EDTAGibco25300054
Y27632StemCell Technologies72302
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
p24 ELISA 试剂
单克隆抗-p24 抗体美国国立卫生研究院艾滋病研究与参考试剂项目3537
山羊抗兔辣根过氧化物酶IgGSigma Aldrich12-348工作浓度 1:1500
山羊血清，无菌，10 mLSigmaG9023工作浓度 1:1000
HIV-1 标准品美国国立卫生研究院艾滋病研究与参考试剂项目SP968F
正常小鼠血清，无菌，500 mLEquitech-BioSM30-0500
多克隆兔抗-p24 抗体美国国立卫生研究院艾滋病研究与参考试剂项目SP451T
TMB 过氧化物酶底物KPL5120-0076工作浓度 1:10,000
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
质粒
pMD2.GAddgene12253
pRSV-RevAddgene52961
psPAX2Addgene12259
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
限制性内切酶
BsmBINew England BiolabsR0580S
BsrGINew England BiolabsR0575S
EcoRVNew England BiolabsR0195S
KpnINew England BiolabsR0142S
PacINew England BiolabsR0547S
SphINew England BiolabsR0182S

参考文献

  1. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  2. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology<....

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CRISPR dCas9 SNCA
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