基于体外慢病毒工程技术对神经前体细胞进行改造，并将其共移植到野生型大脑中，结合对“实验”和“对照”衍生细胞的配对形态测量学分析，该方法能够以简单且经济的方式精确模拟体内基因对新皮层神经元形态的调控。
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本文内容
摘要
摘要
神经元细胞结构的基因调控目前正处于深入研究之中。本文介绍了一种用于在活体中研究新皮质投射神经元形态基因调控的简便方法。该方法基于以下三个步骤：（1）在体外利用慢病毒对神经前体细胞进行基因工程改造，以获得“实验”组和“对照”组细胞；（2）将这些细胞共移植到野生型动物脑内；（3）对它们所分化的神经元进行成对的形态计量学分析。具体而言，本方法采用来自泛神经元特异性遗传标记供体的E12.5期大脑皮质前体细胞。这些细胞通过特定启动子与tetON/OFF技术进行工程化改造，并通过手工操作移植至新生动物的侧脑室。随后，在对受体脑组织进行免疫荧光分析后，将移植来源神经元的轮廓图像输入开源软件NeurphologyJ，提取其形态计量参数，并计算平均长度和分支指数。与其他方法相比，该方法具有三个主要优势：能够在较低成本下实现对转基因表达的精细调控，仅需基本的外科操作技能，且在分析少量动物后即可获得具有统计学意义的结果。然而，由于其设计特点，该方法不适用于研究非细胞自主性的神经结构调控。此外，该方法更适用于神经元迁移完成后对神经突形态调控的研究。在当前的实验设计下，该方法特别适用于研究基因对谷氨酸能新皮质神经元结构的调控。若结合在其他特定神经细胞类型中表达EGFP的转基因品系，该方法亦可被重新应用于研究这些细胞类型结构的基因调控。
引言
本文介绍了一种我们开发的简单方法，用于解析体内基因对神经元细胞结构的调控机制。该方法基于体外工程化改造神经前体细胞，将其移植至新生小鼠脑内，并对"实验"和"对照"细胞进行成对形态计量分析，从而以快速且经济的方式揭示目的基因在精细调控神经元形态中的功能意义。为研究体内 基因对神经元结构的调控作用，必须解决三个关键技术问题：（1）实现目的基因（GOI）的适当模式化表达，并对其进行精确的定量控制；（2）获得清晰分隔的不同神经元轮廓的可视化图像；（3）在使用较少动物数量的前提下，确保结果具有统计学显著性。
在条件允许的情况下，携带四环素（tet）调控型转基因的小鼠突变品系可能是解决第一个问题的最佳工具1。或者，也可采用体细胞转基因技术。在这些情况下，转基因可通过电穿孔2或病毒转导3的方式递送。随后，转基因可作为附加体保留（例如，在常规电穿孔后4），或整合到基因组中（通过逆转录病毒整合酶随机整合5；或通过CRISPR介导的同源重组定点整合（SLENDR）6）。
其次，神经元轮廓的可视化可通过以下两种方式实现....
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方案
本文所述所有方法和操作程序均已获得SISSA动物福利委员会（SISSA IACUC）的批准。
1. 工程化细胞的制备 "绿色" 前体细胞池
- 制备 "绿色" 池
- 将野生型CD1雌鼠与 MtaptEGFP/+ 奠基者16. 通过颈椎脱位法处死妊娠母鼠，处死时间为交配后12.5天（以阴道栓检查确定第0天），收集胚胎发育第12.5天（E12.5）的胚胎。将胚胎置于24孔板的各个孔中，每孔加入冷PBS溶液。
- 在蓝光灯下通过肉眼观察快速对胚胎进行基因型鉴定，检查其脑部是否发出绿色荧光。
- 放置 "绿色" 将胚胎转移至含有冷的含0.6%葡萄糖的1×PBS的10 cm直径培养皿中，并置于体视显微镜下。
- 使用标准剪刀剪下胚胎头部，并用 #3 和 #5 镊子从中分离出端脑。
- 分离两个端脑泡，并用镊子解剖出新皮层；务必去除海马和基底神经节17.
- 使用P1000移液器将新皮质转移至置于冰上的1.5 mL离心管中收集。
- 让解剖出的新皮层沉降到管底。
- 尽可能吸除上清液。 ....
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结果
共有五个主要数据集提供了有关该实验步骤关键方面的有用信息：第一，慢病毒载体对神经前体细胞的转导及共转导效率；第二，用于驱动“测试基因”的启动子关键特性的示例；第三，可用于移植的工程化细胞示例；第四，新生小鼠脑内细胞显微注射关键操作步骤的示意图；第五，整体形态计量分析流程的概要。
关于（1），评估了在不同感染复数（MOI = 2、4、8）下递送的原型慢病毒载体有效转导新皮质前体细胞的能力。在第一项实验中，来源于早期野生型新皮质的神经前体细胞被一种携带mCherry编码序列（cds）的慢病毒报告载体感染，该序列由神经发生谱系特异性的pTα1启动子驱动，感染MOI分别为2、4、8，随后让细胞进行分化。对其子代细胞进行mCherry与泛神经元标志物Tubb3的共免疫分析显示，神经元被有效转导的比例分别为64%、69%和78%（图1A）。在第二项实验中，新皮质前体细胞被两种慢病毒报告载体急性共感染，这两.......
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讨论
该操作流程中的某些特定方面或步骤至关重要，需特别注意。首先，(a) 操作人员必须经过充分的培训，能够在符合 BSL-2 标准的实验室环境中安全操作慢病毒。其次，(b) 在混合"实验组"和"对照组"神经组织样本之前，必须按照所述方法仔细洗涤相应的神经球悬浮液，以防止因慢病毒意外残留导致两组样本之间发生延迟性交叉感染。第三，(c) 在细胞移植过程中，需谨慎定位脑室腔；在此过程中，细胞悬液中加入的快绿示踪剂具有重要作用。此外，(d) 为防止母鼠吞食幼崽，移植后的幼鼠必须在完全从麻醉中恢复后（通常 10 分钟已足够）方可重新放回母鼠身边。(e) 移植组织的冷冻切片厚度应设定为 60 µm；该厚度可同时实现抗体在组织中的充分渗透，并最大限度减少因人为神经元断裂造成的信号丢失。最后，(f) 为避免数据分析中产生无意偏倚，我们强调神经元骨架化分析必须由对红色荧光通道信息设盲的操作人员完成。
本文所述方案涉及GOF基因操作。或者，可通过编码RNAi效应分子的慢病毒对"实验"神经元进行基因功能下调改造。接下来，我们通常使用mCherry标记"对.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Mihn Duc Do 在本实验方案早期建立过程中所做的贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.3 mL 注射器 | BD | 320840 | 室温保存 |
| 0.45 μm 无菌滤器 | Millex-HV | SLHU033RS | 室温保存 |
| 12 孔板 | Falcon | 353043 | 室温保存 |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | 室温保存 |
| 24 孔板 | Falcon | 351147 | 室温保存 |
| 抗 EGFP 抗体，鸡多克隆，RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | –20 °C 保存 |
| 抗 RFP 抗体，大鼠单克隆，RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | –20 °C 保存 |
| 抗 Tubb3 抗体，小鼠单克隆，RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | –20 °C 保存 |
| 校准微毛细移液管用吸管组件套件 | Sigma | A5177-5EA | 室温保存 |
| 蓝光灯 | Nightsea | BLS2 | 室温保存 |
| 硼硅酸盐毛细管 | Kwik-Fil | TW150-4 | 室温保存 |
| BSA | Sigma | A9647 | –20 °C 保存 |
| Bürker 计数板 | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| 冷冻包埋介质（Killik） | Bio-Optica | 05-9801 | 室温保存 |
| DAPI | Sigma | D9542 | –20 °C 保存 |
| 一次性包埋模具 | Bio-Optica | 07MP7070 | 室温保存 |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | +4 °C 保存 |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | –20 °C 保存 |
| 强力霉素 | Sigma | D1822 | –20 °C 保存 |
| Dumont 镊子 #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | 室温保存 |
| Dumont 镊子 #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | 室温保存 |
| EGF | Gibco | PHG0311 | –20 °C 保存 |
| EGTA | Sigma | E3889 | 室温保存 |
| FGF | Gibco | PHG0261 | –20 °C 保存 |
| 精细剪刀 - 锐利型 | Fine Science Tools | 14060-09 | 室温保存 |
| 两性霉素 B（Fungizone） | Gibco | 15290018 | –20 °C 保存 |
| 葡萄糖 | Sigma | G8270 | 室温保存 |
| GlutaMAX 补充剂 | Gibco | 35050061 | 室温保存 |
| 山羊抗鸡 Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | –20 °C 保存 |
| 山羊抗大鼠 Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | –20 °C 保存 |
| 肝素溶液 | Stem Cell Technologies | 07980 | –20 °C 保存 |
| N2 补充剂 | Gibco | 17502048 | –20 °C 保存 |
| 光纤 | Leica | CLS150X | |
| P1000 拉针仪 | Sutter Instruments | P-1000 model | |
| Parafilm 封口膜 | Bemis | PM-996 | 室温保存 |
| 青霉素-链霉素溶液（Pen Strep） | Sigma | P0781 | –20 °C 保存 |
| 培养皿 | Falcon | 353003 | 室温保存 |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma | 158127 | 室温保存 |
| 质粒 #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | 实验室构建 in house | –20 °C 保存 | |
| 质粒 #386 [LV_pTa1_mCherry] | 实验室构建 in house | –20 °C 保存 | |
| 质粒 #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | 实验室构建 in house | –20 °C 保存 | |
| 质粒 #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | 实验室构建 in house | –20 °C 保存 | |
| 质粒 #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | –20 °C 保存 |
| 质粒 #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | 实验室构建 in house | –20 °C 保存 | |
| 质粒 #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | 实验室构建 in house | –20 °C 保存 | |
| 手术刀 | Braun | BB515 | 室温保存 |
| 体视显微镜 | Leica | MZ6 | 室温保存 |
| 台盼蓝 | Gibco | 15250-061 | 室温保存 |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 15400-054 | –20 °C 保存 |
| 胰蛋白酶抑制剂 | Sigma | T6522 | –20 °C 保存 |
参考文献
- Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T.
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重印与许可
