游泳诱导麻痹评估多巴胺信号传导 秀丽隐杆线虫

摘要

游泳诱导麻痹（SWIP）是一种成熟的动物行为检测方法，用于研究秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，简称 C. elegans）中多巴胺信号传导的潜在机制。然而，目前尚缺乏执行该检测的详细方法。本文中，我们描述了一种SWIP的逐步操作方案。

摘要

本方案中描述的游泳实验是一种用于鉴定调控多巴胺能突触蛋白的有效工具。与哺乳动物类似，多巴胺（DA）在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中调控多种功能，包括学习和运动活动。能够刺激DA释放的条件（例如，使用苯丙胺（AMPH）处理）或阻止DA清除的条件（例如，缺乏多巴胺转运体（dat-1）的突变体动物，无法将DA重新摄取回神经元内）会导致细胞外DA过量，最终引起运动抑制。这种行为在动物水中游泳时尤为明显。事实上，野生型动物可在水中持续游泳较长时间，而dat-1基因缺失突变体以及经AMPH或多巴胺转运体抑制剂处理的野生型动物则会沉入孔底且不再移动。该现象被称为“游泳诱导性麻痹”（SWIP）。尽管SWIP实验已被广泛采用，但其方法的详细描述尚不完善。本文中，我们提供了一套执行SWIP实验的逐步操作指南。实验时，将晚期四龄幼虫置于玻璃点板中，其中含有对照蔗糖溶液，可选择性加入AMPH。动物的游泳行为可通过体视显微镜下肉眼观察进行评分，也可通过安装在体视显微镜上的摄像机录制视频后自动分析。随后使用轨迹追踪软件分析视频，生成以热图形式呈现的摆动频率和麻痹情况的可视化结果。无论是人工还是自动化系统，均可提供易于量化的读数，反映动物的游泳能力，从而有助于筛选多巴胺能系统内携带突变的动物或辅助基因。此外，SWIP还可用于阐明滥用药物（如AMPH）的作用机制。

引言

动物会表现出多种由不同神经递质介导的先天且复杂的行为，这些行为依赖于复杂的信号传导过程进行协调。神经递质多巴胺（DA）在不同物种中介导了高度保守的行为，包括学习、运动功能和奖赏处理。

秀丽隐杆线虫（C. elegans）的神经系统相对简单且图谱清晰，仅包含302个神经元，却表现出显著复杂的多种行为，其中包括许多由多巴胺（DA）调控的行为，如交配、学习、觅食、运动和产卵¹。此外，其生命周期短、易于操作，以及信号分子的高度保守性等特点，进一步凸显了利用C. elegans作为研究保守行为神经基础模型的优势。

雌雄同体的 C. elegans 含有八个多巴胺能神经元；此外，雄性个体还额外具有六对用于交配的多巴胺能神经元。与哺乳动物类似，这些神经元可合成多巴胺（DA），并表达多巴胺转运体（DAT-1）——一种仅存在于多巴胺能神经元中的膜蛋白，负责将突触间隙中释放的多巴胺重新转运回多巴胺能神经元内。此外，参与多巴胺合成、囊泡包装和释放各步骤的大多数蛋白质在蠕虫与人类之间高度保守，且与哺乳动物相似，多巴胺在 C. elegans² 中调节摄食行为和运动功能。

C. elegans 在固体表面爬行....

方案

1. 溶液与培养基的制备

1. 通过将 KH₂PO₄ 3.0 g（22.05 mM）、Na₂HPO₄ 6.0 g（42.2 mM）和 NaCl 5.0 g（85.5 mM）溶解于 1 L 去离子灭菌水中来配制 M9 缓冲液。灭菌后加入 1.0 mL 1 M MgSO₄（将 12 g 溶于 100 mL 去离子灭菌水中，定容至 100 mL）。取 100 mL 上述 10 倍浓缩 M9 溶液与 900 mL 去离子灭菌水混合，配制成 1 倍工作液。
2. 配制卵缓冲液：将 6.896 g NaCl（118 mM）、3.578 g KCl（48 mM）、0.294 g CaCl₂-2H₂O（2 mM）、0.406 g MgCl₂-6H₂O（2 mM）和 5.958 g HEPES（25 mM）溶解于 1 L 去离子灭菌水中。用 NaOH 调节 pH 至 7.3。
3. 通过将 1 mL 5–6% 次氯酸钠（漂白剂）和 180 µL 10 N NaOH 加入 3.8 mL 去离子水中，现配新鲜的次氯酸钠/NaOH 溶液。
4. 称取 60 g 蔗糖，用去离子灭菌水定容至 100 mL，配制成 60% 蔗糖溶液。
5. 将 0.684 g 蔗糖溶解于 10 mL 去离子灭....

结果

我们展示了由AMPH处理诱导的SWIP实验示例。图1展示了如上所述的实验设置示意图。对于手动实验，取约8-10条年龄同步的晚期L4期线虫，使用睫毛或铂金挑针收集，并置于盛有40 µL 200 mOsm/L蔗糖溶液（对照溶液）或含0.5 mM AMPH的蔗糖溶液的玻璃点板中，进行SWIP检测。

当动物停止游泳（即表现出SWIP）时，它们会迅速沉入孔底且不再移动。因此，区分仍在水面上游泳的动物与静止在孔底的动物非常直观。大多数在对照溶液中测试的线虫可连续游泳至少10分钟，而在AMPH处理下，表现出SWIP的动物数量逐渐增加。表现出SWIP的动物最大百分比与所用AMPH浓度成正比^1,5,13。当对DAT-1基因敲除.......

讨论

本文介绍了一种在 C. elegans 中进行行为学检测 SWIP 的逐步实验方案。该方案简单直接，无主要技术难点，因此具有很高的用户友好性。然而，为了有效实施该检测，仍有一些关键环节需要特别注意。

进行实验时应确保所用线虫营养充足，因为饮食限制会影响SWIP¹⁷。在挑取线虫时需轻柔操作，裂解过程中氢氧化钠/次氯酸钠处理的时间也需精确控制，这些步骤至关重要；因为在挑取过程中造成机械损伤（使用铂金丝挑针时更常见）或胚胎长时间暴露于氢氧化钠/次氯酸钠溶液中，均可能对线虫造成永久性损伤¹⁸，从而影响其游泳能力。

应遵循无菌操作技术以避免污染。琼脂平板被污染会损害动物的健康，从而改变其游泳能力。使用接种了不同菌株大肠杆菌（E. coli）（如NA22、OP50等）的琼脂平板时，可观察到表现出SWIP表型的动物比例存在微小差异。在本实验方案中，我们使用NA22菌株以获得大量线虫。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
铝箔	Reynolds wrap	1091835
安非他明	Sigma	51-63-8
高压灭菌
细菌培养箱	新不伦瑞克科学公司	M1352-0000
细菌学级琼脂	Lab Scientific, Inc	A466
Bacto (TM) 胰蛋白胨	BD	REF 211677
氯化钙（二水合物）	Sigma-Aldrich	C3881
相机	Thorlabs	U-CMAD3
离心	Eppendorf 5810R 15孔离心机	E215059
胆固醇	Sigma-Aldrich	57-88-5
去离子水	Millipore	Z00QSV0WW	Milli-Q
Depression 玻璃斑点板	康宁	Corning, Inc. 722085
锥形瓶	赛默飞世尔科技	4103-0250PK
睫毛
载玻片	Fisherbrand	12-550-15
绘图与统计软件	Prism		Graphpad 5
HEPES	Sigma-Aldrich	RB=H3375 & H7006
次氯酸盐	Hawkins	次氯酸钠 4-6%，USP" 1 加仑
LB培养基，Miller配方	Fisher	BP1426
氯化镁（六水合物）	Sigma-Aldrich	RB=M0250	500 g
七水合硫酸镁	Sigma-Aldrich	M1880
磁力搅拌子	Fisherbrand	16-800-510
微量离心管	赛默飞世尔科技	69715
NA 22 细菌	CGC
制霉菌素	Sigma	1400-61-9
渗透压计	Advanced Instruments, Inc	Model 3320
巴斯德吸管	Fisherbrand	13-678-20A
培养皿	Falcon	351007
pH计	Orion VersaStar Pro	IS-68X591202-B 0514
聚苯乙烯锥形管	Falcon	352095
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9541
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	7778-77-0
磷酸氢二钾	Sigma-Aldrich	P-8281
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P0662
血清移液管	VWR	10毫升=89130-898
沙克尔	可靠的科学	55S 12x16
氯化钠	Fisher	RB=BP358-1
磷酸二氢钠	Fisher	RB=S381
电子表格	MS Office		Microsoft Excel
体视显微镜	Zeiss	模型 tlb3.1 stemi2000
无菌移液器吸头	各种	02-707-400
蔗糖	Sigma-Aldrich	RB=S5016
超级胶水	Loctite	1647358 0.14 盎司
SwimR 软件	10.18129/B9.bioc.SwimR
Tracker 2	Worm Tracker 2.0	www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/
视频录制软件	Virtualdub	http://www.virtualdub.org/