本文介绍了在体内实验性自身免疫性脑脊髓炎过程中研究神经血管单元功能障碍的实验方案。我们重点阐述了如何测定血脑屏障通透性以及与白细胞穿越胶质界膜相关的明胶酶活性。
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本文内容
摘要
摘要
神经血管单元（NVU）由形成血脑屏障（BBB）的微血管内皮细胞、嵌入周细胞的内皮基底膜以及由实质基底膜和星形胶质细胞终足构成的胶质界膜组成，后者包绕中枢神经系统（CNS）微血管的远腔面。除了维持中枢神经系统稳态外，NVU还调控免疫细胞向中枢神经系统的迁移。在中枢神经系统免疫监视过程中，少量活化的淋巴细胞可穿过内皮屏障，而不会引起血脑屏障功能障碍或临床疾病。相反，在神经炎症过程中，例如多发性硬化或其动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中，大量免疫细胞可穿越血脑屏障，继而穿过胶质界膜，最终进入中枢神经系统实质，导致临床疾病的发生。 免疫细胞迁移进入中枢神经系统实质是一个两步过程，涉及依次穿越NVU的内皮屏障和胶质屏障，并依赖不同的分子机制。当T细胞穿越内皮屏障后，若在血管周围抗原呈递细胞上遇到其特异性抗原，则局部再活化将启动后续机制，导致明胶酶（gelatinases）的局灶性激活，从而使T细胞得以穿越胶质屏障并进入中枢神经系统实质。因此，在EAE过程中，通过空间关联分析中枢神经系统内免疫细胞积聚部位的血脑屏障通透性和基质金属蛋白酶（MMP）活性，可明确NVU内皮屏障和胶质屏障完整性的丧失情况。 本文展示了如何通过主动免疫在C57BL/6小鼠中诱导EAE，以及如何随后利用外源性荧光示踪剂联合应用，在体内分析血脑屏障的通透性。我们进一步展示了如何通过原位明胶酶谱法结合对血脑屏障基底膜和CD45+侵入性免疫细胞的免疫荧光染色，对EAE小鼠脑组织中的明胶酶活性进行可视化和定位。
引言
中枢神经系统（CNS）协调脊椎动物的所有身体和心理功能，而CNS稳态对于神经元之间的正常通信至关重要。神经血管单元（NVU）可确保CNS稳态，保护中枢神经系统免受血液环境变化的影响。NVU由CNS微血管内皮细胞组成，这些细胞在生化上具有独特性，并通过与周细胞、星形胶质细胞、神经元以及细胞外基质（ECM）成分的持续双向交流，形成血脑屏障（BBB），并建立两层不同的基底膜1。包裹BBB内皮细胞腔外侧的内皮基底膜含有大量周细胞，主要由层粘连蛋白α4和层粘连蛋白α5以及其他ECM蛋白构成2。相比之下，实质基底膜则由层粘连蛋白α1和层粘连蛋白α2组成，并被星形胶质细胞终足所包绕。实质基底膜与星形胶质细胞终足共同构成胶质界膜，将中枢神经系统的神经元网络与充满脑脊液的血管周围腔隙或蛛网膜下腔分隔开来3。由于NVU独特的结构，免疫细胞进入CNS的过程不同于其进入外周组织的过程，必须经历两个步骤：免疫细胞首先需穿越内皮性血脑屏障，随后再突破胶质界膜，才能进入CNS实质
多发性硬化症（MS）是一种常见的中枢神经系统（CNS）神经炎症性疾病，其特征是大量循环免疫细胞进入中枢神经系统，引发神经炎症、脱髓鞘以及血脑屏障（BBB）完整性的局灶性丧失4。BBB完整性的破坏是MS的早期标志，磁共振成像（MR....
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方案
所有研究均根据瑞士动物保护相关法律法规进行，并经瑞士伯尔尼州兽医办公室批准（许可编号：BE 31/17 和 BE 77/18）。
1. C57BL/6小鼠在特定无病原体（SPF）条件下的饲养
- 将小鼠饲养于独立通风笼具中，保持12/12小时明暗循环，自由摄食饮水。 为监控小鼠的微生物质量，实验动物群体每季度通过脏垫料哨兵鼠进行健康监测，遵循FELASA建议13。
- 使用耳缘打孔法对8至12周龄的雌性C57BL/6小鼠进行个体标记。
2. C57BL/6 小鼠的免疫
- 溶液的制备14：
- 制备完全弗氏佐剂（CFA）：在通风橱中，将30 mL不完全弗氏佐剂与120 mg新鲜研磨并经热灭活的结核分枝杆菌（H37RA）混合。将储备液储存于4 °C。
- 制备MOGaa35-55肽储备液：将MOGaa35-55肽溶解于无菌PBS中（4 mg/mL），并于-80 °C保存。
- 制备MOG乳剂：
- 在2 mL微量离心管中，按1:2比例将CFA与MOG肽储备液稀释。
- 用封口膜密封微量离心管，并用胶带完全包裹固定于涡旋振荡器上。....
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结果
在C57BL/6小鼠中评估EAE的临床病程应得到如图所示的疾病曲线 图 2A 小鼠体重的变化，如图所示 图2BC57BL/6小鼠在用MOGaa35-55免疫后，通常在主动免疫后的第10至12天开始出现疾病症状图1A）。通常，免疫小鼠在注射乳剂和首剂百日咳毒素后的第二天会出现短暂的体重下降图1B）。从EAE诱导后的第2天起，免疫小鼠的体重逐渐增加，直至疾病发作；通常在临床症状出现前一天，体重开始下降，并随着疾病症状的加重而持续降低，与症状严重程度呈正相关。图1A,B）。EAE 疾病严重程度持续加重，直至疾病高峰期，通常在 EAE 诱导后第 16 至 20 天之间达到。图2A）。在EAE临床症状最严重的阶段，小鼠的体重也降至最低。
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讨论
本文介绍了一种在雌性C57BL/6小鼠中诱导和监测实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验方案。由于多发性硬化症（MS）在女性与男性的发病率之比为3:1，因此优先选择雌性小鼠进行研究。为评估EAE的严重程度，我们采用了一种3分制评分表。EAE的严重程度通常依据运动功能障碍的程度进行评分。对于处于EAE晚期阶段、即评分超过2分的小鼠，应实施安乐死，以避免动物遭受不必要的痛苦。因此，建议按照本方案所述，以较短的时间间隔（例如每日两次）对小鼠进行评分。目前已有多种评分系统被使用，评分范围从0–3分到0–6分16,17,18,19 ，甚至包含更多细分等级20。然而，我们先前的研究表明，在评估整体疾病严重程度时，看似更精细的EAE评分方法并不能提高检测组间潜在统计学显著差异的能力15。基于.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们衷心感谢 Lydia Sorokin 与我们分享了她原始的 in situ 酶谱分析方案10。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AMCA 抗兔抗体 | 杰克逊免疫研究实验室 | 111-156-045 | 4°C 下保存 °C；避光保存 |
| 抗CD45抗体（30F11） | Pharmingen | 07-1401 | 4°C 下保存 °C |
| 抗层粘连蛋白抗体 | DAKO | Z0097 | 4°C 下保存 °C |
| 育种食物 | 例如，PROVIMI KLIBA SA | 3336 | |
| 独立通气笼具，Blue line II型或III型 | 例如，Tecniplast | 1145T, 1285L | |
| BSA 第五组分 | Applichem | A1391 | 4°C 下保存 °C |
| 冷明胶 | Sigma-Aldrich | G 9391 | |
| 考普林罐 + 支架 | 例如，Carl Roth GmbH + Co. KG | H554.1；H552.1 | |
| Cy3 抗大鼠抗体 | Jackson ImmunoResearch | 111-156-144 | 4°C 下保存 °C；避光保存 |
| 盖玻片 24 x 40 mm #1 | 例如：Thermo Scientific | 85-0186-00 | |
| Dextran Alexa Fluor 488（10,000 MW） | 例如：分子探针 | D22910 | -20℃保存 °C；避光保存 |
| 德克萨斯红葡聚糖（3000 MW） | Invitrogen | D3328 | 储存于 -20 °C；避光保存 |
| EnzChek 明胶酶/胶原酶检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技；EnzCheck | E12055 | -20℃保存 °C；避光保存 |
| 雌性C57BL/6J小鼠（8–12周龄） | 例如：Janvier Labs | 雌性，8-12 周龄 | |
| 组织学切片冷冻盒 | 例如：Carl Roth GmbH + Co. KG | 2285.1 | |
| 18G × 1½’’ (1.2 mm × 40 mm) 注射针 | 例如 BD，BD Microlance 3 | 304622 | |
| 27G x ¾’’ – 20号（0.4 mm × 19 mm）注射针 | 例如：BD，BD Microlance 3 | 302200 | |
| 30G × ½’’ (0.3 mm x 13 mm) 注射针 | 例如：BD，BD Microlance 3 | 304000 | |
| 不完全弗氏佐剂’不完全佐剂（IFA） | 例如，Santa Cruz Biotechnology | sc-24648 | 4°C 下保存°C |
| 维持食物 | 例如，PROVIMI KLIBA SA | 3436 | |
| MOGaa35-55 肽 | 例如，GenScript | -80℃保存 °C | |
| 显微镜载玻片（Superfrost Plus） | 赛默飞世尔科技 | J1800AMNZ | |
| 结核分枝杆菌 H37RA | 例如，BD | 231141 | 4°C 下保存 °C |
| 0.9% NaCl | B. Braun | 3535789 | |
| O.C.T. 化合物（Tissue-Tek） | Sakura | 4583 | |
| Omnican 50 30G x ½’’ | B. Braun | 9151125S | |
| 多聚甲醛 | 默克 | 30525-89-4 | |
| 百日咳毒素 | 例如：List 生物实验室股份有限公司 | 180 | 4°C 下保存 °C |
| 聚乙烯醇（Mowiol 4-88） | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| 蛋白酶抑制剂，无EDTA（Roche） | Sigma-Aldrich | 4693132001 | 4°C 下保存 °C |
| 排斥笔，例如 DAKO Pen | 例如：DAKO | S2002 | |
| 封口膜，例如 Parafilm M | 例如 Sigma-Aldrich | P7793 | |
| 硅胶 | 例如：Carl Roth GmbH + Co. KG | 9351.1 | |
| 缝合剪刀 | F.S.T | 15012-12 | |
| 1 ml 注射器 | 例如，PRIMO | 62.1002 | |
| 10 ml 注射器 | 例如：CODAN Medical ApS | 2022-05 | |
| Univentor 400 雾化系统 | UNO.BV |
参考文献
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
- Wu, C., et al. Endothelial basement membrane lamini....
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