为了观察昆虫感受器的超微结构，本研究介绍了扫描电镜和透射电镜（SEM 和 TEM）的样品制备方案。在固定液中添加吐温 20 以避免 SEM 样品发生形变。荧光显微镜有助于提高 TEM 切片的准确性。
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本文内容
摘要
摘要
本报告描述了用于扫描电镜和透射电镜观察的样品制备方法，以木蠹象Chlorophorus caragana Xie & Wang (2012) 的附肢制备为例，展示了两种电子显微镜的样品处理流程。扫描电镜（SEM）样品制备方案基于化学固定、系列乙醇脱水、干燥及溅射镀膜。在固定液和洗涤液中添加吐温-20（聚氧乙烯山梨醇酐月桂酸酯）后，木蠹象体表的清洗更为彻底，有利于获得更清晰的SEM图像。本研究的透射电镜（TEM）样品制备包括固定、乙醇脱水、树脂包埋、荧光显微镜定位、切片和染色等一系列步骤。含吐温-20的固定液能更有效地穿透木蠹象体壁，相比未添加吐温-20的情况，可实现对体内组织和器官更佳的固定效果，从而获得清晰的昆虫感器超微结构透射电镜图像。该制备流程的下一步是利用荧光显微镜确定包埋在树脂块中样品的感器位置，以提高目标感器定位的精确度，进而提升切片的准确性。
引言
扫描电子显微镜是许多形态学研究中的重要工具，SEM 可显示表面结构1,2。透射电子显微镜的优势在于可用于在纳米尺度上研究多种生物结构，从细胞的构架、细胞器的超微结构，到大分子复合物及蛋白质的结构。TEM 可显示内部结构3,4,5。
鞘翅目是昆虫中最大的类群，包含约182个科和350,000个物种。大多数鞘翅目昆虫，特别是钻蛀性甲虫，以植物为食，其中许多是森林和果树的重要害虫，对树木造成严重危害6。目前，基于化学生态学理论的害虫种群预防与控制日益受到关注7。高效、低毒、无污染的信息素防治方法已成为一种有效的手段8。研究昆虫感器的形态学与超微结构是昆虫化学生态学研究的重要组成部分。扫描电镜和透射电镜（分别为SEM和TEM）被广泛用于研究其形态结构与内部解剖特征。然而，在制备用于电子显微镜（EM）观察的昆虫样品过程中，观察位点的客观性和真实性可能受到影响9。通常，昆虫SEM样品的制备需经过清洗....
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方案
警告：使用试剂前请查阅其材料安全数据表。样品制备过程中使用的多种化学物质具有毒性、致突变性、致癌性和/或生殖毒性。操作样品时须佩戴个人防护装备（手套、实验服、长裤和不露脚趾的鞋子），并在通风橱内进行操作。
1. 扫描电镜样品制备与成像
- 样品固定与清洗
- 在 C. caragana 分布区域工作时，使用植物引诱剂（如异佛尔酮16）在野外陷阱中诱捕成虫。将清洁后的成虫 C. caragana 样本保存于含 0.1 mol L-1 磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.2）、2.5%（wt/vol）戊二醛（Anhydrous EM Grad）和 0.06%（vol/vol）Tween 20 的混合液中。于 4 °C 下固定过周末。
- 将虫体从保存液中取出，并用磷酸盐缓冲液冲洗。在体视显微镜下，去除附肢并将其在含 0.06%（vol/vol）Tween 20 的 0.1 mol L-1 磷酸盐缓冲液（pH 7.2，简称 PBST）中超声清洗（40 kHz）。清洗 100 秒后，转移样本至显微镜下检查清洁程度。通常情况下，需清洗 400 秒，以确保样本足够清洁且未受损，便于观察。
- 样品脱水、制备与干燥
- 依次使用 50%、60%、....
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结果
使用含Tween 20的清洗和固定溶液后，获得的SEM图像比不含Tween 20时更清晰（图3）。Tween 20固定溶液有助于戊二醛固定液渗透进入组织，微管结构清晰可见。不含Tween 20时，样品内部结构的TEM图像较为模糊（图4）。
图3：Chlorophorus caragana 触角上的感器在扫描电镜下的定位。 使用 Tween 20（A
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讨论
本文介绍了一种用于钻木甲虫的扫描电镜与透射电镜样品制备方案。以昆虫附肢作为代表性研究对象，我们展示了相较于传统样品制备方法的多项改进。
液体油从固体表面脱离后被乳化成微小液滴，可均匀分散并悬浮于洗涤介质中，从而减少在物体表面的再沉积。表面活性剂的洗涤性能包含润湿性、渗透性、乳化性、分散性、增溶性等所有基本特性11,12,13,14。不同洗涤剂对黄金线虫电子显微镜样品制备效果的影响研究表明，Tween 20 的清洁效果最佳，其次为碳酸氢钠和蒸馏水24。本研究发现，Tween 20 可用于降低液体的表面张力，并防止污物沉积在昆虫体表，尤其适用于直接从野外采集的钻蛀性甲虫。在扫描电镜中，昆虫体表的清洗更为彻底。含有 Tween 20 的固定剂更易穿透昆虫体壁，从而在透射电镜中实现对体内组.......
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披露
我们没有需要披露的利益冲突。
致谢
我们感谢北京农业职业学院、中国农业科学院原子能利用研究所、北京林业大学生物研究中心以及中国科学院动物研究所张善干教授的大力协助。本研究得到了国家重点研发计划&中国国家重点研发计划（2017YFD0600103）、国家自然科学基金（项目编号：31570643，81774015）、中国林业公益性行业科研专项（201504304）、内蒙古农业大学高层次人才科研启动计划（203206038）、内蒙古自治区高等教育科研项目（NJZZ18047）、内蒙古自治区林学 "双一流" 建设项目 (170001)
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 解剖镜 | 重庆奥托光学 有限责任公司 | 1425277 | |
| 碳导电胶带 | SPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc. | 7311 | |
| 四氯化碳 | Sigma | 56-23-5 | |
| 铜网 | GilderGrids | G300 | |
| 磷酸氢二钠 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10039-32-4 | |
| 乙醇 | J.T. Baker | 64-17-5 | |
| 平底包埋模具 | 海德创投（北京）生物科技有限公司 | 70900 | |
| 荧光显微镜 | LEICA | DM2500 | |
| 戊二醛 | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | 无水电子显微镜级 |
| 异佛尔酮 | Sigma | 78-59-1 | |
| 柠檬酸铅 | Sigma | 512-26-5 | |
| 甲醇 | Sigma | 67-56-1 | |
| 磷酸二氢钠 | 伊特思化学试剂有限公司 | 7558-80-7 | |
| 物镜测微尺 | Olympus | 0-001-034 | |
| 四氧化锇 | Sigma | 541-09-3 | |
| 培养皿 | Aldrich | 1998 | |
| 剃须刀片 | Gillette | ||
| 树脂 | Spurr | ERL4221 | |
| 手术刀 | 联辉 | GB/T19001-2008 | |
| 扫描电子显微镜（SEM） | 日立 | S-3400 | |
| 硅胶干燥剂 | 苏州龙辉干燥剂有限公司 | 112926-00-8 | |
| 小毛刷 | Martol | G1220 | |
| 氢氧化钠 | Sigma | 1310-73-2 | |
| 溅射离子仪 | 日立工机株式会社，东京，日本 | E-1010 | |
| 体视显微镜 | Leica | EZ4 HD | |
| 透射电子显微镜（TEM） | 日立 | H-7500 | |
| Tween 20 | 天津大茂化学试剂 | 9005-64-5 | |
| 超薄切片机 | Leica | UC6 | |
| 超声波清洗器 | GT Sonic | GT-X1 | |
| 醋酸铀酰 | Sigma | 6159-44-0 |
参考文献
- Song, Y. Q., Dong, J. F., Sun, H. Z. Scanning Electron Microscope Technology of Insect Material. Hubei Agricultural Sciences. 52, 1064-1065 (2013).
- Liu, C. The develo....
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重印与许可
