木钻甲虫附着物扫描和透射电子显微镜的样品制备方法

Summary

为了观察昆虫的超结构，在研究中提出了扫描和透射电子显微镜（SEM和TEM，分别为SEM和TEM）的样品制备方案。在SEM中加入Tween 20，以避免样品变形。 荧光显微镜有助于提高TEM的切片精度。

Abstract

本报告描述了扫描和传输电子显微镜观察的样品制备方法，通过制备木钻甲虫、氯磷酸二甲AA和Wang（2012年）的附属物来证明这两种电子显微镜。扫描电子显微镜（SEM）样品制备方案基于样品化学固定、一系列乙醇浴中的脱水、干燥和溅射涂层。通过在固定液和洗涤溶液中加入Tween 20（聚氧乙烯山梨酸盐），在SEM中更干净地清洗了木钻甲虫的昆虫体表面。本研究的透射电子显微镜（TEM）样品制备涉及一系列步骤，包括固定、乙醇脱水、嵌入树脂、使用荧光显微镜定位、切片和染色。修复与Tween 20能够穿透昆虫体壁的木钻甲虫比没有Tween 20更容易，随后更好的固定组织和器官在体内，从而产生清晰的传输电子显微镜观察昆虫感性超结构。此制备的下一步是使用荧光显微镜确定嵌入树脂块中的样品中的昆虫敏菌的位置，以提高目标感镜定位的精度。这提高了切片精度。

Introduction

扫描电子显微镜是许多形态学研究中的重要工具，SEM显示表面结构^1，2。透射电子显微镜的吸引力是，它可用于研究纳米尺度上的多种生物结构，从细胞结构和细胞器的超微结构，到大分子复合物和蛋白质的结构。TEM显示内部结构^3，4，5。

科洛普特拉是最大的昆虫群，包括大约182个家族和35万种昆虫。大多数的科林托普兰昆虫，特别是木质甲虫，以植物为食，其中许多是森林和果树的重要害虫，对树木造成毁灭性的破坏^。目前，基于化学生态学理论的病虫害防治工作已^{日益受到重视}。高效、低毒、无污染信息素控制方法已成为一种有效的方法^。昆虫的感性形态学和超微结构研究是昆虫化学生态学研究的重要组成部分。扫描和透射电子显微镜（SEM和TEM分别）对它们的形态学和内部解剖学的研究有很大的效果。然而，在电子显微镜（EM）昆虫样品的制备过程中，观测点的客观性和真实性可能会受到影响^。一般来说，昆虫的SEM样品制备需要清洗、组织固定、脱水、转移、干燥和溅射涂层^10。由于林甲虫生活的环境复杂，人体表面往往有各种各样的污染物，其附属物往往有许多细长的鼻孔或毛刺。特别是，一些木钻孔机不能从实验室饲养，直接收集在现场，然后放入固定流体，以确保新鲜度，随后在实验室洗涤。如果样品先固定然后清洗，显然要清除碎屑要困难得多，因为谷醛会强烈地将其固定在样品上。Tween 20 是表面活性剂 11、12、13、14，在洗涤过程中起着重要作用，包括降低水的表面张力和提高洗衣表面水的润湿性。在这项研究中，将Tween 20添加到固定溶液和PBS清洁溶液中，以降低液体的表面张力，防止污垢沉积在木质甲虫的体表面，使SEM的车身表面更清洁。

使用TEM，可以对昆虫的不同器官进行切片，以揭示昆虫体内的清晰结构，从而为分析昆虫功能提供依据。当昆虫，如木钻甲虫，是大，其身体壁有相当程度的硬化，所以固定可能无法完全饱和器官组织内的昆虫体内。补间20可以增强污垢的分散和悬浮能力。在这项研究中，Tween 20被添加到固定剂中，以增强固定流体渗透到虫体壁的木刺甲虫，避免表皮^11、12、13的变形和坍塌。此外，使用一般的切片技术，很难准确定位不同类型的感菜，特别是对于一些小的森西拉^15。本研究在传统TEM样品制备的基础上，结合荧光显微镜和SEM，确定昆虫感菌在嵌入块中的位置，从而提高切片精度。

Protocol

注意:在使用前，请查阅试剂的材料安全数据表。样品制备过程中使用的几种化学品具有毒性、诱变性、致癌性和/或再毒性。使用个人防护设备（手套、实验室外套、全长裤子和闭趾鞋），在处理样品时在烟罩下工作。

1. SEM 样品制备和成像

1. 样品固定和清洁
   1. 在发生C.卡拉干纳的区域工作，吸引成年人进入田间陷阱，诱饵植物吸引剂，如异磷^16。在 0.1 摩尔^L-1磷酸盐缓冲盐水 （PBS， pH 7.2）， 2.5% （wt/vol） 谷醛 （非水化 EM 梯度） 和 0.06% （vol/vol） 补间 20 中保存成人C. 卡拉干纳的清洁身体。在周末将样品固定在 4°C。
   2. 从保鲜液中取出身体，用磷酸盐缓冲液冲洗。使用立体显微镜，取出附属物，并在 0.1 摩尔^L-1磷酸盐缓冲盐水 （pH 7.2） 中用 0.06% （vol/vol） 补间 20 （PBST） 超声波清洗它们。清洁 100 s 后，将样品转移到显微镜上，检查其是否清洁。在正常情况下，清洁 400s，以确保样品足够清洁，可以观察且不会损坏。
2. 样品脱水、安装和干燥
   1. 在50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、100%和100%（全vol/vol）乙醇中连续使用20分钟，使样品脱水。在立体显微镜下，使用碳双面胶带将3个观察表面（背腹和侧侧）分别固定在存根上。请注意，所有观察表面必须保持清洁且无污染。将样品阶段放入含有硅胶干燥剂的培养皿中，为期48小时。
3. 溅射涂层和样品插入
   1. 使用日立 Koki （E-1010） ion 溅射仪，将 MAIN VALVE 旋转到打开位置，拆下样品室盖，并将样品放入腔室。打开电源开关，打开"就绪"指示灯。将溅射时间设置为 45 秒，将涂层厚度设置为 70.875 Ω。一旦机械泵真空表盘指数降至7以下，按"放电"并开始喷洒铂金。在实验结束时，关闭电源并将样品带出腔室。喷涂膜厚度:d = KIVt（"d"是薄膜的厚度，单位为"*";"K" 是一个常数，具体取决于溅射的金属和气体。例如，空气的 K 为 0.07;"I"是等离子体流的单位mA;"V"是"KV"单元中施加的电压。"t"是时间（以秒为单位）。
   2. 将包含样本的存根插入 SEM 的舞台上。确保带有样本存根的样本阶段具有足够的高度，以允许良好的图像。打开 SEM 软件并选择所需的工作电压，从 20 kV 开始。

2. TEM样品制备和成像

1. 如步骤 1.1.1 和 1.1.2 所示，获取并修复示例。
2. 清洁、二次固定和脱水
   1. 从保鲜液中取出成年C.卡拉干纳。使用立体显微镜，取出附属物，在PBST中清洗样品3小时，然后在PBS中用1%（wt/vol）四氧化二氮在PBS中将其固定1小时，在25°C下。在室温下，在50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、100%和100%（全vol/vol）乙醇下，连续20分钟对样品进行脱水。
3. 树脂嵌入和聚合
   1. 将样品嵌入树脂中，嵌入平面嵌入模具中。样品位于板的底部，并尽可能靠近凹陷槽的边缘。将标签放在空白处，然后在60°C孵育含有样品的板，72小时。从培养箱中取出胶囊，并验证树脂是否聚合。
4. 样品切片和染色
   1. 确保样品已凝固后，将每个树脂块置于荧光显微镜下，并在蓝光下拍摄。移动显微镜的荧光光源，使其从上面照射样品。使树脂块中的感菜清晰可见。拍摄并测量距离以瞄准森西拉（图1）。
   2. 请参阅掌上心形的SEM图像（图2A），用剃刀刀片大致切割树脂块以关闭目标受体（图2B）。
   3. 接下来，使用蓝光荧光显微镜，拍摄大致切割的树脂块，从上面调整光源，以便清楚地观察到感理。蓝光激发的绿光创造了一个有利的观察。成像时，将目标微米（DIV 0.01mm）添加到荧光显微镜阶段，然后通过ImageJ软件（美国国家卫生研究院）测量目标的距离（图2C）。图像标尺由 Adobe Photoshop CS5（Adobe 系统公司，加利福尼亚州圣何塞，美国）制作。然后，对于超微缩切片，使用 50-60 nm 切片厚度设置切割距离，直到达到目标位置。使用荧光显微镜精确定位目标受体。
   4. 将部分安装在 Formvar 涂层的 100 个网状铜网格上，双色与醋酸乙烯和铅酸盐染色。
      1. 首先，将3.75克醋酸二酯加入50mL的50%甲醇中。在室温下用过滤（0.45 μm）注射器过滤乙酸乙酯饱和溶液10分钟染色的染色网格。在50%甲醇中冲洗2次;2x过滤脱气水。
      2. 其次，在离心管中加入0.02克铅酸盐，加入10mL的脱气蒸馏水中。加入0.1 mL的10 N氢氧化钠，密封和摇动溶解。使用前使用含铅酸盐溶液的染色网格为8分钟。必须在无二氧化碳的环境中进行染色，以防止碳酸铅沉淀的形成。将污渍滴放在塑料培养皿的方块上。在脱气过滤水中冲洗并干燥^17。通过在 80 kV 下运行的 TEM 观察它们。

图1:荧光显微镜拍摄了一个树脂块，包裹着氯磷酸的附属物。（A） 天线树脂块;（B） 排卵器末端的树脂块.箭头指示树脂块的边缘;虚线圆圈表示目标感。请点击此处查看此图的较大版本。

图2:精确感感定位方法的程序。（A）氯磷酸卡拉干那的上颌触电的第4子段，虚线圆圈显示SEM所针对的感西拉。 （B） 荧光显微镜观察的C. 卡拉干纳上颌电的第四子段。白色箭头显示树脂块的大致切割边缘，虚线圆圈显示准确位置。（C） 从树脂块边缘到上颌触觉目标位置的标记距离（本样品为 28 μm）。请点击此处查看此图的较大版本。

Results

使用使用 Tween 20 的清洁和固定溶液，比没有补间 20 的更清洁 SEM 图像（图 3）。补间20固定溶液将谷醛固定溶液渗透到组织中。微管结构清晰可见。没有Tween20（图4），样品内部结构的TEM图像被模糊了。

图3:SEM下氯磷酸卡拉加纳天线上的感突。SEM图像与Tween 20 （A） 和无 Tween 20 （B） 的比较显示，图片 A 比图片 B 一般更干净.

Discussion

本文介绍了一种木钻甲虫扫描和透射电子显微镜的样品制备方案。以昆虫附属项为代表研究课题，对传统的样品制备方法进行了一些改进。

从固体表面分离的液体油被乳化成小液滴，小液滴可以很好地分散并悬浮在洗涤介质中，以减少在物体表面的再沉积。表面活性剂的洗涤性能包括所有基本特性，如润湿性、渗透性、乳化特性、分散性、溶解^性11、12、13、14等。不同洗涤剂对金线虫电子显微样品制备的影响表明，Tween 20具有最佳的清洁效果，其次是碳酸氢钠和蒸馏水^24。在这项研究中，我们发现Tween 20可用于降低液体的表面张力，并防止污垢沉积在昆虫的体表面，特别是直接在田间采集的木甲虫。昆虫体表面在SEM中洗得更干净。用Tween20固定剂更容易穿透昆虫体壁，随后在TEM中更好地固定体内的组织和器官。表面活...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
解剖镜片	重庆汽车光学 有限责任公司	1425277
Carbon Adhesive Tape	SPI Supplies， Division of Structure Probes， Inc.	7311
四氯化碳	Sigma	56-23-5
铜板栅	GilderGrids	G300
磷酸氢二钠	国药集团化学试剂有限公司	10039-32-4
乙醇	J.T. Baker	64-17-5
平面包埋模具	海德创业（北京）生物科技有限公司	70900
荧光显微镜	徕卡	DM2500
戊二醛	Sigma-Aldrich	111-30-8	无水 EM 级
异佛尔酮	Sigma	78-59-1
柠檬酸铅	Sigma	512-26-5
甲醇	Sigma	67-56-1
磷酸二氢钠	其集团化学试剂有限公司	7558-80-7
物镜千分尺	奥林巴斯	0-001-034
四氧化锇	Sigma	541-09-3
培养皿	奥尔德里奇	1998
剃须刀刀片	吉列
树脂	刺	ERL4221
手术刀	联辉	GB/T19001-2008
SEM	日立	S-3400
硅胶干燥剂	苏州隆辉干燥剂有限公司	112926-00-8
小刷	Martol	G1220
氢氧化钠	Sigma	1310-73-2
溅射离子仪器	日本东京市日立工机有限公司	E-1010
体视显微镜	徕卡	EZ4 高清
透射电镜	日立	H-7500
Tween 20	天津大茅化学试剂	9005-64-5
徕	卡	UC6
超声波清洗机	GT Sonic	GT-X1
乙酸铀酰	Sigma	6159-44-0