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方法文章

木蛀甲虫附肢的扫描与透射电子显微镜样品制备方法

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DOI：

10.3791/59251

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2020年2月3日

 ,  ,  ,  , 
1The Key Laboratory for Silviculture and Conservation of the Ministry of Education, School of Forestry, Beijing Forestry University, 2School of Forestry, Inner Mongolia Agricultural University, 3Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 4School of Forestry, Fujian Agriculture and Forestry University

本文内容

摘要

为了观察昆虫感受器的超微结构，本研究介绍了扫描电镜和透射电镜（SEM 和 TEM）的样品制备方案。在固定液中添加吐温 20 以避免 SEM 样品发生形变。荧光显微镜有助于提高 TEM 切片的准确性。

摘要

本报告描述了用于扫描电镜和透射电镜观察的样品制备方法，以木蠹象Chlorophorus caragana Xie & Wang (2012) 的附肢制备为例，展示了两种电子显微镜的样品处理流程。扫描电镜（SEM）样品制备方案基于化学固定、系列乙醇脱水、干燥及溅射镀膜。在固定液和洗涤液中添加吐温-20（聚氧乙烯山梨醇酐月桂酸酯）后，木蠹象体表的清洗更为彻底，有利于获得更清晰的SEM图像。本研究的透射电镜（TEM）样品制备包括固定、乙醇脱水、树脂包埋、荧光显微镜定位、切片和染色等一系列步骤。含吐温-20的固定液能更有效地穿透木蠹象体壁，相比未添加吐温-20的情况，可实现对体内组织和器官更佳的固定效果，从而获得清晰的昆虫感器超微结构透射电镜图像。该制备流程的下一步是利用荧光显微镜确定包埋在树脂块中样品的感器位置，以提高目标感器定位的精确度，进而提升切片的准确性。

引言

扫描电子显微镜是许多形态学研究中的重要工具，SEM 可显示表面结构1,2。透射电子显微镜的优势在于可用于在纳米尺度上研究多种生物结构，从细胞的构架、细胞器的超微结构，到大分子复合物及蛋白质的结构。TEM 可显示内部结构3,4,5。

鞘翅目是昆虫中最大的类群，包含约182个科和350,000个物种。大多数鞘翅目昆虫，特别是钻蛀性甲虫，以植物为食，其中许多是森林和果树的重要害虫，对树木造成严重危害6。目前，基于化学生态学理论的害虫种群预防与控制日益受到关注7。高效、低毒、无污染的信息素防治方法已成为一种有效的手段8。研究昆虫感器的形态学与超微结构是昆虫化学生态学研究的重要组成部分。扫描电镜和透射电镜（分别为SEM和TEM）被广泛用于研究其形态结构与内部解剖特征。然而，在制备用于电子显微镜（EM）观察的昆虫样品过程中，观察位点的客观性和真实性可能受到影响9。通常，昆虫SEM样品的制备需经过清洗、组织固定、脱水、置换、干燥和喷镀等步骤10。由于钻蛀性甲虫生活环境复杂，其体表常附着多种污染物，附肢上也常具有大量细长的感器或刚毛。特别是一些钻蛀性甲虫无法通过实验室人工饲养获得，需直接从野外采集后立即放入固定液中以保持新鲜，随后在实验室进行清洗。若先固定再清洗，由于戊二醛会将杂质牢固地固定在样品表面，显然更难清除残留物。Tween 20是一种表面活性剂11,12,13,14，在清洗过程中发挥重要作用，包括降低水的表面张力以及提高水对样品表面的润湿性。本研究将Tween 20添加至固定液和PBS清洗液中，以降低液体的表面张力，防止污物沉积在钻蛀性甲虫体表，从而使SEM观察下的体表更为清洁。

利用透射电子显微镜（TEM），可对昆虫不同器官上的感觉器进行切片，以揭示其内部清晰的结构，从而为分析感觉器功能提供依据。当研究对象昆虫（如钻蛀性甲虫）体型较大，且体壁具有较高度的 sclerotization（硬化）时，固定液可能无法充分渗透至昆虫体内各组织。Tween 20 能增强污物的分散性和悬浮能力。本研究在固定液中添加 Tween 20，以增强固定液对钻蛀性甲虫体壁的渗透性，避免表皮发生变形和塌陷11,12,13。此外，采用常规切片技术难以准确定位不同类型的感觉器，尤其是一些微小的感觉器15。在传统透射电镜样品制备基础上，本研究结合荧光显微镜与扫描电镜（SEM）技术，确定嵌入块中昆虫感觉器的位置，从而提高切片的准确性。

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方案

警告：使用试剂前请查阅其材料安全数据表。样品制备过程中使用的多种化学物质具有毒性、致突变性、致癌性和/或生殖毒性。操作样品时须佩戴个人防护装备（手套、实验服、长裤和不露脚趾的鞋子），并在通风橱内进行操作。

1. 扫描电镜样品制备与成像

  1. 样品固定与清洗
    1. 在 C. caragana 分布区域工作时，使用植物引诱剂（如异佛尔酮16）在野外陷阱中诱捕成虫。将清洁后的成虫 C. caragana 样本保存于含 0.1 mol L-1 磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.2）、2.5%（wt/vol）戊二醛（Anhydrous EM Grad）和 0.06%（vol/vol）Tween 20 的混合液中。于 4 °C 下固定过周末。
    2. 将虫体从保存液中取出，并用磷酸盐缓冲液冲洗。在体视显微镜下，去除附肢并将其在含 0.06%（vol/vol）Tween 20 的 0.1 mol L-1 磷酸盐缓冲液（pH 7.2，简称 PBST）中超声清洗（40 kHz）。清洗 100 秒后，转移样本至显微镜下检查清洁程度。通常情况下，需清洗 400 秒，以确保样本足够清洁且未受损，便于观察。
  2. 样品脱水、制备与干燥
    1. 依次使用 50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、100% 和 100%（均为 vol/vol）乙醇对样品进行脱水处理，每步持续 20 分钟。在体视显微镜下，使用碳双面导电胶带将三个观察面（背侧、腹侧和侧方）分别固定于样品台上。注意所有观察面必须保持清洁，无污染。将样品台置于含有硅胶干燥剂的培养皿中，干燥 48 小时。
  3. 溅射镀膜与样品装入
    1. 使用日立工机（Hitachi Koki E-1010）离子溅射仪，将主阀（MAIN VALVE）旋转至 OPEN 位置，打开样品室盖，将样品放入样品室。打开电源开关，READY 指示灯亮起。设定溅射时间为 45 秒，镀层厚度为 70.875 Å。当机械泵真空表读数降至 7 以下时，按下 DISCHARGE 按钮，开始铂喷镀。实验结束后，关闭电源，取出样品。镀膜厚度计算公式：d = KIVt（“d”为膜厚，单位为“Å”；“K”为常数，取决于溅射金属和气体，例如空气的 K 值为 0.07；“I”为等离子体电流，单位为 mA；“V”为施加电压，单位为 KV；“t”为时间，单位为秒）。
    2. 将载有样品的样品台插入扫描电镜（SEM）样品台。确保样品台与样品台座具有足够高度，以获得清晰图像。打开 SEM 软件，选择合适的加速电压，起始电压设为 20 kV。

2. 透射电子显微镜样品制备与成像

  1. 按照步骤 1.1.1 和 1.1.2 获取并固定样品。
  2. 清洗、二次固定与脱水
    1. 将成年 C. caragana 从保存液中取出。在体视显微镜下去除附肢，用 PBST 洗涤样品 3 小时，然后在 25 °C 条件下用含 1%（wt/vol）四氧化锇的 PBS 溶液后固定 1 小时。在室温下依次用 50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、100% 和 100%（均为 vol/vol）乙醇处理 20 分钟进行脱水。
  3. 树脂包埋与聚合
    1. 将样品包埋于树脂中，置于平底包埋模具内。样品应位于模具底部，并尽可能靠近凹槽边缘。将标签放入空白处，然后将含有样品的模具在 60 °C 下孵育 72 小时。从培养箱中取出包埋块，确认树脂已完全聚合。
  4. 样品切片与染色
    1. 确认样品已完全固化后，将每个树脂块置于荧光显微镜下，在蓝光下拍照。调整显微镜的荧光光源，使其从上方照射样品，以便清晰观察树脂块中的感觉器。拍照并测量距离以定位目标感觉器（图 1）。
    2. 参考触须的扫描电镜图像（图 2A），用刀片粗略切割树脂块，使其接近目标感受器（图 2B）。
    3. 随后，使用蓝光荧光显微镜对粗切后的树脂块进行拍照，调整上方光源以清晰观察感觉器。蓝光激发产生的绿光有利于观察。成像时，在荧光显微镜载物台上加入分度值为 0.01 mm 的目镜测微尺，然后使用 ImageJ 软件（美国国立卫生研究院）测量目标位置的距离（图 2C）。图像标尺使用 Adobe Photoshop CS5（Adobe Systems, Inc., San Jose, CA, USA）制作。接着，为超薄切片机切片设定切割距离，采用 50–60 nm 的切片厚度进行切片，直至到达目标位置。利用荧光显微镜精确定位目标感受器。
    4. 将切片捞于 Formvar 覆膜的 100 目铜网上，用醋酸铀和柠檬酸铅双重染色。
      1. 首先，将 3.75 g 醋酸铀加入 50 mL 50% 甲醇中。使用过滤（0.45 µm）注射器将饱和醋酸铀溶液在室温下染色 10 分钟。染色过程中需覆盖切片，防止光照产生沉淀。用 50% 甲醇冲洗两次，再用过滤的去气水冲洗两次。
      2. 其次，将 0.02 g 柠檬酸铅加入 10 mL 去气蒸馏水中，置于离心管中。加入 0.1 mL 10 N 氢氧化钠，密封后振荡溶解。将铜网浸入柠檬酸铅溶液中染色 8 分钟。使用前需离心。染色必须在无二氧化碳环境中进行，以防止生成碳酸铅沉淀。将染液滴加于塑料培养皿的方格中。用去气过滤水冲洗后干燥17。在 80 kV 下通过透射电镜观察。

植物根尖的显微比较；细节视图；70 µm比例尺；生物结构分析。
图1：荧光显微镜拍摄的包埋Chlorophorus caragana附肢的树脂块。（A）触角树脂块；（B）产卵器末端的树脂块。箭头指示树脂块的边缘；虚线圆圈指示目标感器。 请点击此处查看该图的放大版本。

昆虫翅膀的扫描电子显微镜；结构分析；显微图像比较；比例尺。
图2：精确感受器定位方法的操作流程。（A）Chlorophorus caragana 上颚须第4亚节，虚线圆圈标示了扫描电镜（SEM）所针对的感受器位置。（B）C. caragana 上颚须第4亚节的荧光显微图像。白色箭头显示树脂包埋块的大致切面边缘，虚线圆圈标示了感受器的精确定位。（C）从树脂包埋块边缘至目标上颚须感受器位置的标记距离（本样品中为28 µm）。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

使用含Tween 20的清洗和固定溶液后，获得的SEM图像比不含Tween 20时更清晰（图3）。Tween 20固定溶液有助于戊二醛固定液渗透进入组织，微管结构清晰可见。不含Tween 20时，样品内部结构的TEM图像较为模糊（图4）。

扫描电子显微镜图像；昆虫刚毛微结构，放大视图，显示表面细节。
图3：Chlorophorus caragana 触角上的感器在扫描电镜下的定位。 使用 Tween 20（A

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讨论

本文介绍了一种用于钻木甲虫的扫描电镜与透射电镜样品制备方案。以昆虫附肢作为代表性研究对象，我们展示了相较于传统样品制备方法的多项改进。

液体油从固体表面脱离后被乳化成微小液滴，可均匀分散并悬浮于洗涤介质中，从而减少在物体表面的再沉积。表面活性剂的洗涤性能包含润湿性、渗透性、乳化性、分散性、增溶性等所有基本特性11,12,13,14。不同洗涤剂对黄金线虫电子显微镜样品制备效果的影响研究表明，Tween 20 的清洁效果最佳，其次为碳酸氢钠和蒸馏水24。本研究发现，Tween 20 可用于降低液体的表面张力，并防止污物沉积在昆虫体表，尤其适用于直接从野外采集的钻蛀性甲虫。在扫描电镜中，昆虫体表的清洗更为彻底。含有 Tween 20 的固定剂更易穿透昆虫体壁，从而在透射电镜中实现对体内组...

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披露

我们没有需要披露的利益冲突。

致谢

我们感谢北京农业职业学院、中国农业科学院原子能利用研究所、北京林业大学生物研究中心以及中国科学院动物研究所张善干教授的大力协助。本研究得到了国家重点研发计划&中国国家重点研发计划（2017YFD0600103）、国家自然科学基金（项目编号：31570643，81774015）、中国林业公益性行业科研专项（201504304）、内蒙古农业大学高层次人才科研启动计划（203206038）、内蒙古自治区高等教育科研项目（NJZZ18047）、内蒙古自治区林学 "双一流" 建设项目 (170001)

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
解剖镜重庆奥托光学
有限责任公司		1425277
碳导电胶带SPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc.7311
四氯化碳Sigma56-23-5
铜网GilderGridsG300
磷酸氢二钠国药集团化学试剂有限公司10039-32-4
乙醇J.T. Baker64-17-5
平底包埋模具海德创投（北京）生物科技有限公司70900
荧光显微镜LEICADM2500
戊二醛Sigma-Aldrich111-30-8无水电子显微镜级
异佛尔酮Sigma78-59-1
柠檬酸铅Sigma512-26-5
甲醇Sigma67-56-1
磷酸二氢钠伊特思化学试剂有限公司7558-80-7
物镜测微尺Olympus0-001-034
四氧化锇Sigma541-09-3
培养皿Aldrich1998
剃须刀片Gillette
树脂SpurrERL4221
手术刀联辉GB/T19001-2008
扫描电子显微镜（SEM）日立S-3400
硅胶干燥剂苏州龙辉干燥剂有限公司112926-00-8
小毛刷MartolG1220
氢氧化钠Sigma1310-73-2
溅射离子仪日立工机株式会社，东京，日本E-1010
体视显微镜LeicaEZ4 HD
透射电子显微镜（TEM）日立H-7500
Tween 20天津大茂化学试剂9005-64-5
超薄切片机LeicaUC6
超声波清洗器GT SonicGT-X1
醋酸铀酰Sigma6159-44-0

参考文献

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