本文描述了一种从液体样本中无标记固定外泌体和细胞外囊泡，并通过原子力显微镜（AFM）对其进行成像的逐步操作方法。利用AFM图像可估算溶液中外泌体的尺寸，并表征其其他生物物理特性。
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摘要
摘要
外泌体及其他细胞外囊泡（EVs）是由脂质膜囊泡、膜蛋白和其他分子构成的表面修饰结构以及来源于母细胞的多种腔内成分（包括RNA、蛋白质和DNA）组成的分子复合物。对EVs流体动力学尺寸的表征已成为常规操作，该尺寸取决于囊泡本身的大小及其表面修饰物所形成的冠状层。对于EVs中最小的一类——外泌体而言，其流体动力学尺寸与实际囊泡尺寸之间的相对差异尤为显著。尽管低温透射电子显微镜（cryo-TEM）成像是表征囊泡尺寸的金标准技术，但由于仪器成本高昂、样品制备、成像及数据分析所需的专业技术要求高，且图像中常观察到的颗粒数量较少，该方法的应用仍面临挑战。一种广泛可用且易于获取的替代方法是原子力显微镜（AFM），该技术可提供关于细胞外囊泡三维形貌、尺寸及其他生物物理特性的多样化数据。本方案旨在指导用户使用这一分析工具，并概述通过AFM分析EVs的工作流程，包括以水合或干燥状态进行成像的样品制备、囊泡在基底上的静电固定、数据采集、分析与解释。代表性结果表明，EVs在修饰云母表面的固定具有可预测性和可定制性，使用户能够获得大量囊泡的尺寸数据。基于AFM数据的囊泡尺寸测定结果与cryo-TEM成像结果具有一致性。
引言
细胞外囊泡（EVs）存在于所有体液中，包括血液、尿液、唾液、乳汁以及羊水。外泌体是细胞外囊泡中一个独特的类别，其与其他细胞外囊泡的区别在于其内体来源的生物发生途径、内体通路的标志分子以及在所有细胞外囊泡中具有最小的尺寸。外泌体的尺寸在不同研究中常表现出显著差异。研究发现，尺寸测定结果依赖于检测方法，反映了不同分析技术在估算细胞外囊泡尺寸时所依据的物理原理的差异1,2。例如，纳米颗粒追踪分析（NTA）是目前应用最广泛的尺寸表征技术，其测定的细胞外囊泡尺寸为流体动力学直径，该参数用于表征囊泡在溶液中布朗运动所受阻力的大小。囊泡的流体动力学直径越大，其在液体中的运动能力越低。囊泡周围的冠状层由锚定或吸附在膜表面的蛋白质及其他分子组成，显著阻碍了囊泡的运动，从而增大了其流体动力学尺寸。相对而言，这种增大幅度在外泌体中尤为显著3，如图1所示。
冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）成像是表征囊泡在水合状态下尺寸和形态的确定性技术。然而，该仪器的高昂成本以及正确使用所需的专业技术知识促使人们探索能够对水合状态的细胞外囊泡（EVs）进行成像的替代技术。在所获得的cryo-TEM图像中观察或表征的EV数量相对较少，是该技术的另一个显著缺点。
原子力显微镜（AFM）通过探针在基底表面扫描，逐点成像表面颗粒，从而可视化水合或干燥状态下的细胞外囊泡（EVs）的三维形貌4,5,6。本研究概述了利用AFM表征EVs的关键实验步骤。在液体环境中成像囊泡之前，必须通过功能化表面的拴系作用、滤膜截留或静电吸引等方式将囊泡固定在基底上7。对于已知具有负zeta电位的外泌体而言，在带正电荷的基底上进行静电固定是一种尤为便捷的固定方法。然而，尽管静电作用可有效固定细胞外囊泡，但这些相同的静电作用力也会导致囊泡形态发生畸变，因此成像后的数据分析至关重要。本文通过描述一种算法来进一步阐明这一点：该算法基于表面固定后发生形变的外泌体的AFM数据，估算溶液中球状囊泡的实际尺寸。
在本研究所建立的实验方案中，介绍了囊泡稳定静电固定的方法，并随后阐述了在水合或干燥状态下进行原子力显微成像所需的操作步骤。文中明确了影响固定囊泡表面浓度的各种因素，并提供了针对溶液中不同浓度细胞外囊泡（EVs）样品实施静电固定的指导建议。讨论了实验条件的选择，以确保能够在足够数量的固定囊泡基础上，估算多种生物物理特性的经验概率分布。同时给出了原子力显微镜（AFM）成像后数据处理的示例。具体而言，描述了一种基于对固定EVs的AFM表征来推断溶液中囊泡尺寸的算法。代表性结果表明，AFM测定的囊泡尺寸与冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）成像结果具有良好的一致性。
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方案
1. 从生物流体中分离细胞外囊泡
- 采用既定方法之一分离EVs，例如差速超速离心法8，沉淀，或尺寸排阻色谱9.
- 通过电子显微镜确认分离颗粒的脂质双层形态，验证预期的表面和管腔生物标志物的存在，并确认不存在提示制备物交叉污染的生物标志物。
注意：在分离外泌体时，通过纳米颗粒追踪分析（NTA）或动态光散射测得的流体动力学粒径分布应在预期范围内。有关细胞外囊泡（EV）和外泌体分离的具体细节不在本实验方案的范围之内。所选用的方法将取决于具体的实验问题和研究目的。10. 以下步骤具体说明了如何使用市售沉淀试剂盒从MCF-7乳腺癌细胞的培养基中通过沉淀法富集外泌体材料表). - 在细胞培养扩增前，将 MCF-7 乳腺癌细胞保存于液氮中。解冻细胞以进行传代培养。
- 遵循无菌操作规范，在150 mm培养皿中进行细胞接种。使用由Eagle组成的生长培养基’最小必需培养基，0.01 mg/mL 人重组胰岛素，以及 10% 无外泌体胎牛血清。
- 通过95%空气和5% CO₂培养环境对培养物进行通气2 并在37℃孵育 °C.
- 待细胞贴壁后（接种后约24 h），更换培养基。按1:10比例传代，培养十块培养板，每板加入20 mL培养基。
- 收获并合并其中 9 个培养板的培养基（约 180 mL）−细胞仍处于生长期时达到80%汇合度。
- 将培养基分为 60 mL 和 120 mL 两份，再进一步分装为每管 30 mL，于 3,000 x g 15 分钟。
- 将每根离心管中的上清液转移至新的无菌50 mL离心管中，并进行外泌体分离。
- 根据已发表的方案通过沉淀法分离外泌体（例如，参见参考文献）11）或按照制造商说明进行操作’商业提取试剂盒的使用说明（若使用商业提取试剂盒）材料表) 时，后一种情况下的第一步是将细胞培养基在 3,000 x g 孵育15分钟。吸走上清液，弃去细胞和细胞碎片。
- 向 supernatant 中加入沉淀溶液（体积比为1:5），混匀后4℃过夜。
- 以 1,500 x g 室温孵育30分钟。离心后弃去上清液。
- 将剩余的外泌体沉淀物在1,500 x g下再次离心5分钟 g轻轻吸去上清液，切勿扰动沉淀。
- 将沉淀重悬于100 μL中−500 µL 的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）缓冲液，根据下游分析需要分装成多个 aliquot。
- 立即进行分离出的外泌体的表面固定化，以用于原子力显微镜成像。如有需要，可将等分试样于 -80 ℃ 冷冻保存 °C 以备后续使用，同时需采取预防措施，避免样本在冻融循环过程中受损。
2. 细胞外囊泡的表面固定
- 使用强力双面胶带、环氧树脂或其它粘合剂，将云母片牢固地粘附在原子力显微镜（AFM）/扫描隧道显微镜（STM）用的磁性不锈钢样品盘上。
- 使用锋利的剃刀或美工刀切割云母片，或在云母片上表面贴上胶带后迅速撕下，以去除一层材料。
注意：上述任一方法均可通过去除先前暴露于环境中的薄层云母，暴露出新鲜的表面。操作后，云母片与AFM/STM金属样品盘之间的粘附必须保持牢固。 - 在室温下，将100 µL的10 mM NiCl2溶液滴加到云母片上表面，处理10秒，使表面电荷由负变正。
- 用无尘擦拭纸或吸水纸吸去NiCl2溶液，随后用去离子水（DI水）清洗云母表面3次，并用干燥氮气流吹干。
注意：建议使用AFM扫描修饰后的表面，以确认其无污染物。 - 将带有表面修饰云母片的AFM样品盘放入培养皿中。
- 将步骤1.14获得的外泌体样品用1×PBS稀释，使终浓度达到每毫升溶液含4.0 × 109至4.0 × 1010个颗粒。使用纳米颗粒追踪分析（NTA）验证稀释后的颗粒浓度。
- 用移液器吸取100 μL稀释后的外泌体溶液，滴加于云母片表面形成静止液滴。
- 盖上培养皿盖，并用封口膜密封，以减少样品蒸发。在4 °C条件下孵育12−18小时。
注意：固定在外泌体表面的密度随孵育时间及液体中外泌体浓度的增加而升高。若样品中外泌体浓度较低，则可能需要更长的孵育时间。 - 孵育结束后，小心吸除80−90%的液体，避免扰动表面。此时，外泌体将通过静电作用固定在云母基底上。
- 在成像水合状态的细胞外囊泡（EVs）前，用1×PBS冲洗表面3次。冲洗过程中需注意保持样品始终处于水合状态。
- 用1×PBS清洗云母表面后，吸除80%−90%液体，再加入约40 μL新鲜的1×PBS覆盖样品。
- 在成像干燥状态的细胞外囊泡（EVs）前，用去离子水清洗基底3次。
注意：使用去离子水冲洗可防止基底干燥过程中盐结晶及溶质在表面沉积。 - 在成像干燥状态的细胞外囊泡（EVs）前，尽可能吸除液体，避免接触表面，并用干燥氮气流吹干剩余液体。
3. 原子力显微镜成像
- 为成像干燥的细胞外囊泡（EVs），请选择专为在空气中进行轻敲模式和非接触模式扫描设计的悬臂梁，并将其安装到探针 holder 上。
注意：所列示例悬臂梁的特性见下文 材料表 （123 μm 长度，40 μm 宽度，7 nm 尖端半径，37 N/m 弹簧常数）可作为选择与现有原子力显微镜（AFM）仪器兼容探针的参考。- 将步骤2.13中的样品置于原子力显微镜（AFM）载物台上。磁性不锈钢样品盘可将样品固定在载物台上。静置一段时间，使样品与载物台达到热平衡。
- 使用轻敲模式扫描云母的足够大面积区域’表面。例如，选择一个5 × 5 µm的区域，以约1 Hz的扫描速率在512行上进行光栅扫描。同时获取高度图像和相位图像，因为它们可提供关于样品表面形貌及表面特性的互补信息。
注意：扫描时间将随成像区域的增大和构成图像的扫描线数量的增加而延长，但会随扫描速率（定义为每秒扫描的线数）的提高而缩短。过高的扫描速率可能影响图像质量。因此，光栅扫描速度应审慎权衡采集时间与图像质量之间的权衡关系。
- 为成像水合囊泡，选择适用于扫描柔软水合样品的悬臂梁，并将其安装到专为液体中扫描设计的探针 holder 上。
注意：在选择与现有原子力显微镜（AFM）仪器兼容的探针时，应参考探针规格说明中所列的各项参数 材料表 （三角悬臂梁，标称长度175 µm，宽度22 µm，针尖半径20 nm，弹簧常数0.07 N/m，适用于驱动频率在4至8之间成像） kHz）可作为参考。- 用1×PBS润湿悬臂梁的尖端，以降低扫描过程中向液体中引入气泡的可能性。
- 将步骤2.11中的样品置于原子力显微镜（AFM）载物台上。磁性不锈钢样品盘会将其表面附着的载有固定化EVs的云母片固定住。
- 留出足够时间使样品制备过程和原子力显微镜载物台达到热平衡。
- 在轻敲模式下对水合云母表面进行成像，同时获取形貌和相位图像。
注意：成像质量受仪器设备、所选探针及扫描参数的影响。在优化扫描条件时，可采用以下设置作为起点：扫描范围为 5 x 5 µm，扫描线数为 512，扫描速率约为 0.8–1.0 Hz 4至8 kHz的驱动频率。
4. 图像分析
注意：以下数据处理与分析步骤适用于获取的高度图像。类似流程也可用于分析相位数据。下文描述专指 Gwyddion12，这是一款依据 GNU 通用公共许可证发布的免费开源软件。其他软件工具也具备类似功能。
- 前往 数据处理, SPM 模式, 提示 并选择 模型提示 (图2）。选择用于扫描样品的探针的几何形状和尺寸，然后单击 好的.
- 通过执行表面重建来校正针尖侵蚀伪影。打开图像，从菜单中选择 数据处理, SPM 模式, 提示，然后选择 表面重构 并单击 好的 (图3).
- 通过从扫描数据中消除基底的倾斜，将成像平面与实验室的 XY 平面对齐。为完成此操作，选择 数据处理, 水平 并选择 水平面 (图4).
- 通过选择对齐图像的行 数据处理, 正确的数据 然后选择 对齐行. 提供多种比对选项（图5例如， 中位数 是一种通过计算每条扫描线的平均高度并从数据中减去该值的算法。
- 前往 数据处理, 正确的数据 并选择 去除疤痕 (图6），可去除常见的扫描错误，即所谓的伪影。
- 将云母表面在零高度（Z = 0）处对齐，方法是选择 平整基底 在 水平 可从下拉菜单访问 数据处理 (图7).
- 通过扫描表面识别EVs 阈值标记 在 谷物 下拉菜单图8A）。该算法通过识别高于用户选定阈值的颗粒高度，将固定在表面的外泌体识别为从零表面基底突出的颗粒。请选择介于1至3之间的阈值 nm，以消除大部分背景干扰。背景较干净时可使用更小的阈值。
注意：阈值在 图8A 为1.767 nm。采用此阈值对MCF-7外泌体进行鉴定的结果如图所示。 图8BGwyddion 提供了多种替代阈值分割的算法，用于自动识别图像中的囊泡，包括自动阈值分割（大津法）、边缘检测和分水岭算法。
注意： 如果原子力显微镜图像中存在颗粒聚集体，可将其遮蔽并从分析中排除。 - 使用可用方法对鉴定出的EVs进行几何和尺寸表征 分布 可从以下获取的算法 谷物 菜单
注意：Gwyddion 提供了用于评估固定化EVs在水合或干燥状态下标量值、面域、体积及其他特性的分布工具。标量值特性的示例如下所示 图9, 这给出了每个已鉴定外泌体在足迹范围内的最大高度分布。 - 将原子力显微镜数据从 Gwyddion 导出，以便使用其他计算工具和自定义计算机程序进行专门分析。
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结果
细胞外囊泡（EVs）的表面固定是成像过程中的关键步骤。已知外泌体具有负的Zeta电位，当云母基底经修饰获得正表面电荷后，可通过静电作用实现外泌体的稳定表面固定。若未使用NiCl处理，2 为实现表面正电性改变，发现囊泡在基底上的固定化效果不佳。高度图像中的 图10A，于空气中采集，样本为含有 2.59 x 10 的 MCF-7 外泌体10 每毫升 PBS 中的囊泡孵育 12 小时 未修饰的 新鲜裂解的云母表面在用去离子水清洗后，表面残留的囊泡极少。图中可见的囊泡 图10A 很可能是由于去离子水未完全吸净，残留的水重新悬浮了未固定在表面的囊泡，随后在蒸发过程中将这些囊泡沉积到基底上所致。
在使用氯化镍改变表面电荷后，建议确认处理后的表面仍无污染物。高度图像中 图10B （在空气中获得）展示了经 NiCl 处理后的清洁表面示例2...
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讨论
从生物液体中固定细胞外囊泡（EVs）、表面扫描及图像分析是本研究所开发的液体中原位原子力显微镜（AFM）表征EVs方案的关键步骤。可用于AFM成像的囊泡数量与成像表面面积以及基底上固定囊泡的表面浓度成正比。鉴于EVs和外泌体具有负的Zeta电位18，我们推荐采用静电吸附法将液体样本中的EVs固定于AFM基底上。当基底表面带正电荷时，固定效果更佳。在EV固定之前，可能需要对基底赋予正电荷，例如云母——一种层状硅酸盐矿物，其通用化学式为KAl2(AlSi3O10)(OH)2。新解理的云母表面接近原子级平整，非常适合AFM对纳米颗粒进行成像，但其表面带负电荷，因此必须对其进行改性处理。本方案描述了如何赋予AFM基底正电荷表面的方法。代表性结果表明，与未改性基底相比，EVs从生物液体向改性云母基底的固定效率显著提高。
在对水合状态下的囊泡进行成像时，应尽量减少样品蒸发，因为蒸发会导致表面沉积伪影和对流现象，并随时间推移增加液体中囊泡的浓度，从而使固定的EVs表面浓度高于预期...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢美国国家科学基金会（资助号 IGERT-0903715）、犹他大学（化学工程系种子基金和研究生研究奖学金）以及斯科尔科沃科学技术研究所（Skoltech 奖学金）提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AFM/STM 控制器 | Bruker | Multimode Nanoscope V | 该 AFM 控制器支持在液体和空气中对生物样品进行成像。 |
| AFM/STM 金属样品盘（10 mm） | TedPella | 16207 | 用于通过双面胶带或其他方式固定云母片的金属样品盘。 |
| AFM/STM 云母片（10 mm） | TedPella | 50 | 最高等级 V1 的云母，厚度为 0.21 mm（0.0085”），每包 10 片，夹层包装。可安装在 AFM/STM 样品盘上。提供四种不同直径。 |
| 用于空气中成像的 AFM 探针 | Bruker | TESP-V2 | 高质量蚀刻硅探针，适用于空气中轻敲模式和非接触模式扫描。 |
| 用于液体中软样品成像的 AFM 探针 | Bruker | MLCT | 带有氮化硅针尖的软质氮化硅悬臂，非常适合在液体环境中使用。 其力常数范围使用户能够在接触模式下对极软样品进行成像，也可用于高负载与距离谱学测量。 |
| 双面胶带 | Spectrum | 360-77705 | 用于将云母片固定在金属样品盘上。 |
| ExoQuick-TC | System Biosciences | EXOTC50A-1 | ExoQuick-TC 是一种基于专有聚合物的试剂盒，专为从组织培养基中分离外泌体而设计。 |
| 用于液体中成像的玻璃探针 AFM 持有器 | Bruker | MTFML-V2 | 该玻璃探针持有器专为 MultiMode AFM 在液体中扫描而设计。 可用于峰值力轻敲模式、接触模式、轻敲模式以及力调制模式。 探针由独立的压电振荡器声学驱动，实现更大的振幅调制。 持有器配备两个端口、所需接头及附件套件，用于添加和移除液体。 |
| Gwyddion | 捷克计量研究所 | 版本 2.52 | 用于可视化和分析扫描探针显微技术所获得数据场的开源软件。 |
| 无尘擦拭纸 | GE Healthcare Whatman | GB003 级擦拭纸 | 用于在云母基底修饰后去除 NiCl2。 |
| 无尘洁净室擦拭布 | Texwipe | AlphaWipe TX1004 | 用于表面清洁的聚酯擦拭布。 |
| 氯化镍(II)（NiCl2） | Sigma-Aldrich | 339350 | 粉末状试剂，用于配制 10 mM NiCl2 的去离子水溶液 |
| 磷酸盐缓冲液（1×） | Gibco | 10010023 | PBS，pH 7.4 |
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