原子力显微镜对外泌体的成像

摘要

本文描述了一种从液体样本中无标记固定外泌体和细胞外囊泡，并通过原子力显微镜（AFM）对其进行成像的逐步操作方法。利用AFM图像可估算溶液中外泌体的尺寸，并表征其其他生物物理特性。 

摘要

外泌体及其他细胞外囊泡（EVs）是由脂质膜囊泡、膜蛋白和其他分子构成的表面修饰结构以及来源于母细胞的多种腔内成分（包括RNA、蛋白质和DNA）组成的分子复合物。对EVs流体动力学尺寸的表征已成为常规操作，该尺寸取决于囊泡本身的大小及其表面修饰物所形成的冠状层。对于EVs中最小的一类——外泌体而言，其流体动力学尺寸与实际囊泡尺寸之间的相对差异尤为显著。尽管低温透射电子显微镜（cryo-TEM）成像是表征囊泡尺寸的金标准技术，但由于仪器成本高昂、样品制备、成像及数据分析所需的专业技术要求高，且图像中常观察到的颗粒数量较少，该方法的应用仍面临挑战。一种广泛可用且易于获取的替代方法是原子力显微镜（AFM），该技术可提供关于细胞外囊泡三维形貌、尺寸及其他生物物理特性的多样化数据。本方案旨在指导用户使用这一分析工具，并概述通过AFM分析EVs的工作流程，包括以水合或干燥状态进行成像的样品制备、囊泡在基底上的静电固定、数据采集、分析与解释。代表性结果表明，EVs在修饰云母表面的固定具有可预测性和可定制性，使用户能够获得大量囊泡的尺寸数据。基于AFM数据的囊泡尺寸测定结果与cryo-TEM成像结果具有一致性。 

引言

细胞外囊泡（EVs）存在于所有体液中，包括血液、尿液、唾液、乳汁以及羊水。外泌体是细胞外囊泡中一个独特的类别，其与其他细胞外囊泡的区别在于其内体来源的生物发生途径、内体通路的标志分子以及在所有细胞外囊泡中具有最小的尺寸。外泌体的尺寸在不同研究中常表现出显著差异。研究发现，尺寸测定结果依赖于检测方法，反映了不同分析技术在估算细胞外囊泡尺寸时所依据的物理原理的差异^1,2。例如，纳米颗粒追踪分析（NTA）是目前应用最广泛的尺寸表征技术，其测定的细胞外囊泡尺寸为流体动力学直径，该参数用于表征囊泡在溶液中布朗运动所受阻力的大小。囊泡的流体动力学直径越大，其在液体中的运动能力越低。囊泡周围的冠状层由锚定或吸附在膜表面的蛋白质及其他分子组成，显著阻碍了囊泡的运动，从而增大了其流体动力学尺寸。相对而言，这种增大幅度在外泌体中尤为显著³，如图1所示。 

冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）成像是表征囊泡在水合状态下尺寸和形态的确定性技术。然而，该仪器的高昂成本以及正确使用所需的专业技术知识促使人们探索能够对水合状态的细胞外囊泡（EVs）进行成像的替代技术。在所获得的cryo-TEM图像中观察或表征的EV数量相对较少，是该技术的另一个显著缺点。

方案

1. 从生物流体中分离细胞外囊泡

1. 采用既定方法之一分离EVs，例如差速超速离心法⁸，沉淀，或尺寸排阻色谱⁹.
2. 通过电子显微镜确认分离颗粒的脂质双层形态，验证预期的表面和管腔生物标志物的存在，并确认不存在提示制备物交叉污染的生物标志物。
   注意：在分离外泌体时，通过纳米颗粒追踪分析（NTA）或动态光散射测得的流体动力学粒径分布应在预期范围内。有关细胞外囊泡（EV）和外泌体分离的具体细节不在本实验方案的范围之内。所选用的方法将取决于具体的实验问题和研究目的。¹⁰. 以下步骤具体说明了如何使用市售沉淀试剂盒从MCF-7乳腺癌细胞的培养基中通过沉淀法富集外泌体材料表).
3. 在细胞培养扩增前，将 MCF-7 乳腺癌细胞保存于液氮中。解冻细胞以进行传代培养。
4. 遵循无菌操作规范，在150 mm培养皿中进行细胞接种。使用由Eagle组成的生长培养基’最小必需培养基，0.01 mg/mL 人重组胰岛素，以及 10% 无外泌体胎牛血清。
5. 通过95%空气和5% CO₂培养环境对培养物进行通气₂ 并在37℃孵育 °C.
6. 待细胞....

结果

细胞外囊泡（EVs）的表面固定是成像过程中的关键步骤。已知外泌体具有负的Zeta电位，当云母基底经修饰而带有正电荷后，可通过静电作用实现外泌体在表面的稳定固定。若未使用NiCl处理，₂ 为赋予表面正电荷改变，发现囊泡在基质上的固定化效果不佳。高度图像中的 图10A，于空气中采集，样本为含有 2.59 x 10 的 MCF-7 外泌体样品¹⁰ 每毫升 PBS 中的囊泡在孵育 12 小时后 未修饰的 新鲜裂解的云母表面在用去离子水清洗后，表面残留的囊泡极少。图中可见的囊泡 图10A 很可能是由于去离子水未完全吸干所致，残留的去离子水使未固定在表面的囊泡重新悬浮，并在水分蒸发后将其沉积在基底上。

在使用氯化镍改变表面电荷后，建议确认处理后的表面仍无污染物。高度图像中 图10B （在空气中获得）展示了经 NiCl 处理后的清洁表面示例₂

讨论

从生物液体中固定细胞外囊泡（EVs）、表面扫描及图像分析是本研究所开发的液体中原位原子力显微镜（AFM）表征EVs方案的关键步骤。可用于AFM成像的囊泡数量与成像表面面积以及基底上固定囊泡的表面浓度成正比。鉴于EVs和外泌体具有负的Zeta电位¹⁸，我们推荐采用静电吸附法将液体样本中的EVs固定于AFM基底上。当基底表面带正电荷时，固定效果更佳。在EV固定之前，可能需要对基底赋予正电荷，例如云母——一种层状硅酸盐矿物，其通用化学式为KAl₂(AlSi₃O₁₀)(OH)₂。新解理的云母表面接近原子级平整，非常适合AFM对纳米颗粒进行成像，但其表面带负电荷，因此必须对其进行改性处理。本方案描述了如何赋予AFM基底正电荷表面的方法。代表性结果表明，与未改性基底相比，EVs从生物液体向改性云母基底的固定效率显著提高。
 
在对水合状态下的囊泡进行成像时，应尽量减少样品蒸发，因为蒸发会导致表面沉积伪影和对流现象，并随时间推移增加液体中囊泡的浓度，从而使固定的EVs表面浓度高于预期.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AFM/STM 控制器	Bruker	Multimode Nanoscope V	该 AFM 控制器支持在液体和空气中对生物样品进行成像。
AFM/STM 金属样品盘（10 mm）	TedPella	16207	用于通过双面胶带或其他方式固定云母片的金属样品盘。
AFM/STM 云母片（10 mm）	TedPella	50	最高等级 V1 的云母，厚度为 0.21 mm（0.0085”），每包 10 片，夹层包装。可安装在 AFM/STM 样品盘上。提供四种不同直径。
用于空气中成像的 AFM 探针	Bruker	TESP-V2	高质量蚀刻硅探针，适用于空气中轻敲模式和非接触模式扫描。
用于液体中软样品成像的 AFM 探针	Bruker	MLCT	带有氮化硅针尖的软质氮化硅悬臂，非常适合在液体环境中使用。  其力常数范围使用户能够在接触模式下对极软样品进行成像，也可用于高负载与距离谱学测量。
双面胶带	Spectrum	360-77705	用于将云母片固定在金属样品盘上。
ExoQuick-TC	System Biosciences	EXOTC50A-1	ExoQuick-TC 是一种基于专有聚合物的试剂盒，专为从组织培养基中分离外泌体而设计。
用于液体中成像的玻璃探针 AFM 持有器	Bruker	MTFML-V2	该玻璃探针持有器专为 MultiMode AFM 在液体中扫描而设计。  可用于峰值力轻敲模式、接触模式、轻敲模式以及力调制模式。  探针由独立的压电振荡器声学驱动，实现更大的振幅调制。  持有器配备两个端口、所需接头及附件套件，用于添加和移除液体。
Gwyddion	捷克计量研究所	版本 2.52	用于可视化和分析扫描探针显微技术所获得数据场的开源软件。
无尘擦拭纸	GE Healthcare Whatman	GB003 级擦拭纸	用于在云母基底修饰后去除 NiCl2。
无尘洁净室擦拭布	Texwipe	AlphaWipe TX1004	用于表面清洁的聚酯擦拭布。
氯化镍(II)（NiCl2）	Sigma-Aldrich	339350	粉末状试剂，用于配制 10 mM NiCl2 的去离子水溶液
磷酸盐缓冲液（1×）	Gibco	10010023	PBS，pH 7.4