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方法文章

植物工厂条件下柑橘树的诱导开花

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DOI：

10.3791/59258

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2019年3月6日

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1Instituto Agroforestal Mediterráneo, Universitat Politècnica de València, 2Departamento de Ecosistemas Agroforestales, Universitat Politècnica de València, 3S.A. Explotaciones Agrícolas Serrano (SAEAS), 4Instituto Cavanilles de Biodiversidad y Biología Evolutiva, Jardín Botánico Universitat de València, 5Instituto Universitario de Conservación y Mejora de la Agrodiversidad Valenciana, Universitat Politècnica de València

本文内容

摘要

本文介绍了一种在植物生长室条件下诱导柑橘树开花的实验方案。通过水分胁迫、高光照强度以及模拟春季光周期，可在较短时间内获得具有活性的花朵。该方法使研究人员能够在一年内实现多次开花周期。

摘要

植物生长室（Phytotron）已被广泛用于评估多种参数对多种物种发育的影响。然而，关于如何利用这种植物生长室促使幼龄果树快速大量开花的研究信息仍较为有限。本研究旨在建立一种快速、清晰的方法，以诱导幼年柑橘树（品种 Nova 和品种 Clemenules）开花，并分析诱导强度对花序类型的影响。在植物生长室中，结合短暂的水分胁迫与模拟春季条件（昼 13 小时，22 °C；夜 11 小时，12 °C），仅需实验开始后 68–72 天即可获得花朵。低温需求可通过水分胁迫有效替代。开花反应与水分胁迫程度（以落叶数量衡量）呈正比：诱导越强，开花数量越多。花芽诱导强度还影响花序类型及开花时间。本文提供了人工光照（流明）、光周期、温度、植株大小与年龄、诱导策略及各阶段所需天数的详细信息。能够随时甚至每年多次获得果树花朵，对科研人员具有诸多优势。采用本研究所提出的方法，每年可人为诱导三轮甚至四轮开花，研究人员可自主决定开花时间，并准确预知整个过程的持续时间。该方法可应用于：花朵生产及离体花粉萌发试验；针对影响果实早期发育阶段害虫的实验；果实生理变化的相关研究。上述应用有助于育种人员缩短获取雌雄配子的时间，从而实现人工强制杂交。

引言

植物生长室已被广泛用于评估多种参数对许多草本植物和鳞茎植物发育的影响。水稻1、百合2、草莓3以及许多其他物种4均已在植物生长室条件下进行过评价。针对森林树木的箱式实验也已开展，用于评估臭氧对幼年山毛榉的敏感性5,6，以及温度对欧洲赤松和挪威云杉幼苗抗霜硬化的影响7。关于如何通过人工气候室使幼龄果树实现快速且大量开花的研究则相对较少。

柑橘类果树的开花现象及其与多种内源性和外源性因素的关系长期以来已被广泛研究。温度8、水分供应9、碳水化合物10、生长素和赤霉素含量11,12、脱落酸13，以及其他许多影响柑橘生殖系统的因素均已被探讨。在甜橙（Citrus × sinensis (L.) Osbeck）中，已对温度和光周期对花芽诱导的影响进行了研究14,15。在这些实验中，采用了较长的诱导条件（15/8 °C下持续5周），且枝条发育期间的温度影响了花序类型14。在柑橘开花过程中，“花序”一词被用于描述从腋芽产生的所有类型的带花枝条，这一用法与Reece16的定义一致。

在短时间内以及非春季的其他时期，采用明确且精确的方法诱导开花，可为研究人员带来诸多优势。除热带地区外，果树的开花每年仅发生一次，这限制了可开展实验的次数。

通过促花方法获得的花朵可用于多种实验：在任何月份获取具有活力的花粉，用于体外花粉生长和萌发实验17；开展针对影响果实早期发育阶段（甚至在花瓣脱落前）害虫的研究，例如凯利花蓟马（Pezothrips kellyanus Bagnall）18 或柑橘潜叶蛾（Prays citri Millière）19；研究温度、化学处理、天敌或单纯昆虫饲养的影响；评估多种因素对干扰果实早期发育阶段的生理变化的影响，例如甜橙的“裂果”现象20,21；帮助植物育种人员缩短获得雌雄配子的时间，以进行人工强制杂交。

本文旨在阐述一种快速诱导年轻柑橘树（品种 Nova 和品种 Clemenules）开花的方法的设计与实施，并分析诱导强度对花序类型的影响。为实现这一主要目标，文中提供了有关人工光照（流明）、光周期、温度、植株大小与年龄、诱导策略、诱导天数、萌芽天数、开花天数以及每个品种总开花数量的详细信息。同时记录了水分胁迫诱导强度，并将其与花序类型、开花日期及开花数量进行关联分析。

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方案

1. 生长室特性及调控要求

  1. 使用一个尺寸为 1.85 m × 1.85 m × 2.5 m（长 × 宽 × 高）、总体积为 8.56 m3 的生长室（图 1）。如有需要，也可选用更大或更小的生长室。
    注意：几乎任何房间，甚至温室，都可以改造用作生长室。
  2. 检查是否具备温度（白天/夜间）、光周期（白天/黑夜）、光照强度和最低相对湿度等调控条件（图 2）。
    注意：定时器应至少每 30 分钟可调节一次温度和光照的开启/关闭。

2. 植物材料

  1. 从具有无病毒认证资质的注册苗圃获取植物材料（例如，6 株‘Clemenules’品种柑橘树和 6 株‘Nova’品种柑橘树）。
    注意：柑橘树可选用幼龄植株（例如，嫁接在砧木上的 1 年生或 2 年生品种）。
  2. 使用合适的花盆（例如，直径 22 cm、高 20 cm 的塑料盆），并准备 5 L 标准基质，其成分为优质白色泥炭（50%）和椰糠（50%）。
  3. 选用株高约 1.5 m、冠幅呈良好球形且直径在 1 m 至 1.5 m 之间的植株。植株应完全健康，无虫害、病原体或病害。

3. 第一次灌溉

  1. 植物从苗圃运达后，立即进行首次灌溉，以统一水分含量。采用浸灌法，将花盆浸入水中至一半高度，持续 20 分钟。
  2. 将植物置于室外半阴处，不进行灌溉，持续 3 至 5 天（表 1）。

4. 植物生长室中的春季条件

  1. 考察该地区春季环境条件，确定日间和夜间平均温度、光周期及相对湿度（例如，在工作纬度（39° 28′ 53.95″ N，0° 20′ 37.71″ W）下，柑橘树每年仅开花一次，花期通常从3月中旬持续至4月底，每年略有变化。因此，需在多个气象站（例如，纬度 38° 57′ 51.77″ N，0° 15′ 02.24″ W，海拔113米）至少连续10年记录数据，以确定日间和夜间平均温度、光周期及相对湿度）。
  2. 为柑橘树设置人工气候室的培养条件如下：（i）温度为22 °C/11 °C（昼/夜）；（ii）光周期为13/11小时（光照/黑暗）；（iii）相对湿度维持在约60%，且不得低于50%（图3）。
    1. 使用两个具有双输出功能的电子控制器，分别控制白天和夜间的湿度。使用定时器切换白天与夜间湿度设置，并设定白天和夜间的最低与最高湿度。
      1. 设置最低湿度时，按一下并释放（单次点击）Set 按钮，屏幕上将显示 SP 1（设定点1）；再次按一下并释放 Set 按钮，然后按 UP 或 DOWN 键调整 SP1 的值至50%。
      2. 设置最高湿度时，按一下并释放（单次点击）Set 按钮，屏幕上将显示 SP 1（设定点1）；按 UP 或 DOWN 键切换至 SP 2；SP 2（设定点2）出现后，按一下并释放 Set 按钮，再按 UP 或 DOWN 键将 SP2 的值调整为60%。
    2. 使用具有两个设定点并可调节差值设定点的电子控制器设置温度，并通过定时器实现白天与夜间温度的切换。
      1. 设定所需的白天温度（22 °C）。按一下并释放 Set 按钮，屏幕上将显示 SP 1（设定点1）；再按一下 Set 按钮，然后按 UP 或 DOWN 键调整 SP1 的数值。
      2. 设定控制带宽，例如 db1 和 dF1 参数。当温度达到“设定点1（SP1）+ db1”时启动制冷，当温度降至“SP1 + db1 - dF1”时停止制冷。长按 Set 按钮5秒，屏幕上显示 rE1；按 Set 按钮，再按 UP 键，出现 db1；按 Set 按钮后，使用 UP 或 DOWN 键将 db1 值设为2 °C；再按 Set | UP，出现 dF1；按 Set 按钮后，使用 UP 或 DOWN 键将 dF1 值设为2 °C。
      3. 设定所需的夜间温度（11 °C），需调整 OS1 参数（Offset Set point 1，偏移设定点1）。长按 Set 按钮5秒，然后连续按 DOWN 键3次，出现 cnF；按 Set | DOWN，出现 PA2；按 Set，出现 rE1；再按 Set，出现 OS1；按 Set 按钮后，使用 UP 或 DOWN 键将 OS1 值调整为-11 °C；最后按 fnc 按钮（ESC功能，退出）。
  3. 4周后将温度升高1 °C（即23/12 °C，昼/夜），并增加半小时光照时间（13.5/10.5 小时，光照/黑暗）。
    注：由于植物生长室存在温度波动范围，夜间温度可能在11 °C至14 °C之间波动，白天温度可能在19 °C至22 °C之间波动（图3）。
  4. 使用两套带反射罩的灯具，配备电子镇流器、钠卤灯和600 W高压钠灯（HPS），以获得适宜的光照强度（图4）。光照强度对开花至关重要。
  5. 调节灯具与树冠顶部之间的距离，以达到所需光照强度，并通过定时器设定光周期。
  6. 使用照度计检测光照强度。在树冠顶部应达到55,000 lux（671 µmol m-2 s-1），在树冠基部应达到40,000 lux（488 µmol m-2 s-1）。

5. 将树木放入植物生长室

  1. 将树木放入植物生长室中，并在数周内不进行浇水处理（图5A）。
  2. 均匀分布树木，使每棵树具有相同的空间和光照条件（例如，将树木在生长室中均匀分布为三行，每行四个位置。行间距为0.46 cm，位置间距为0.37 cm）（图1）。
  3. 在各个位置之间随机分布个体和品种（图1）。

6. 花诱导

  1. 利用水分胁迫诱导开花。首次灌溉后，直至认为水分胁迫期结束前，不再对植株进行灌溉。
  2. 每天通过观察叶片膨压来检查水分胁迫强度。
  3. 当大部分叶片呈现萎蔫状态但尚未开始脱落时，可认为水分胁迫程度已足够用于诱导开花（例如，停水22天后，叶片萎蔫，少数开始脱落）（表1）。
    注意：若水分胁迫过强（大量叶片脱落），可能影响植株存活；若水分胁迫不足（萎蔫叶片数量不足），则可能导致开花不良。
  4. 水分胁迫期结束后，对植株充分灌溉。首次灌溉采用浸水法，将花盆一半浸入水中，持续20分钟。
  5. 通过记录每株植株脱落叶片的总数来测定其水分胁迫强度（图5B、C）。脱落叶片百分比是衡量各植株所受水分胁迫程度的间接指标。通过比较水分胁迫前后叶片总数，估算脱落叶片所占百分比。

7. 如需用于其他实验，则进行花朵采收

  1. 在开花期的开始和结束阶段，每天采集一次花朵；在花朵产量最高的时期，每天采集两次，每周采集7天。
  2. 手工采摘花朵，并将其置于标有标签的塑料袋中，保存于-20 °C（图5D）。六株柑橘树每日的花朵产量可能从25朵到超过200朵不等。
    1. 采集时应准确选择花朵的发育阶段。
    2. 所采集的花朵可用于体外花粉萌发实验或其他需要花粉活力与新鲜花粉相当的用途。

8. 其他管理任务

  1. 根据需求，在水分胁迫期后大约每周浇水一次。
  2. 每2-3天检查一次病虫害情况（例如，本实验中仅观察到少量吹绵蚧 Icerya purchasi Maskell，已人工清除，以避免使用化学药剂处理（图5E））。
  3. 使用数据记录仪检查温度和湿度设置（图3）。

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结果

实验于西班牙瓦伦西亚省甘迪亚市（Gandía）的瓦伦西亚理工大学甘迪亚校区（39° 28′ 53.95″ N，0° 20′ 37.71″ W）的植物生长室中进行，时间为秋季和冬季（2017年10月26日—2018年2月5日）（表1）。实验使用了6株‘Clemenules’柑橘（Citrus clementina hort. ex Tanaka 的一个芽变品种）和6株‘Nova’柑橘（C. clementina hort. ex Tanaka × [C. paradisi Macf. × C. tangerina hort. ex Tanaka] 的橘柚杂交种）。所有植株均为嫁接在砧木上的2年生品种（首次嫁接时砧木为1年生）。‘Nova’品种嫁接于‘Carrizo citrange’砧木（x Citroncirus sp. = C. sinensis (L.) Osbeck ‘Washington’ 甜橙 × Poncirus...

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讨论

通过该方法，可快速且在任意时间诱导幼龄柑橘树（仅2年生）开花，并产生大量花朵（每株约216朵）。在先前的研究中14,15，花芽起始需依赖低温诱导，整个过程持续约120天。本研究在植物生长室中结合短期水分胁迫与春季环境条件，显著缩短了诱导时间，使得茂谷柑（Nova品种）在实验开始后68天即开花。因此，该方案将所需时间缩短了一半。试验所用植株于2017年10月26日春季和夏季之后从苗圃移入，未经历诱导性低温条件。在本研究所述的方案中，花芽诱导无需低温处理，水分胁迫可有效替代低温作为诱导刺激。该结果表明，促进开花的因素（如低温、光周期、水分胁迫）可能具有可互换性，可单独使用或组合使用。当采用低温诱导开花时，开花反应与冷处理强度成正比（15 °C/8 °C处理的周数）14。同样，在本实验中，开花反应与水分胁迫程度（叶片脱落百分比）成正比。

花的数量和质量直接受到成花诱导强度的影响。相同的干旱处理对两个测试品种产生了不同的结果。...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 José Javier Zaragozá Dolz 提供技术支持并协助完成管理任务。本研究部分得到了蔬菜品种保护协会的资助，该资助是与瓦伦西亚理工大学（UPV 20170673）合作开展项目的一部分。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
数据记录仪Testo Testo 177-H1Testo 177-H1，温湿度记录仪，4通道，带内置传感器及额外的外部温度传感器
数据记录仪软件TestoSoftware Comsoft Basic Testo 5用于编程和读取 Testo 数据记录仪的基本软件
电子差值控制器Eliwell IC 915 (LX)  (货号 9IS23071)带两个设定点及差值设定点调节功能的电子控制器 
双输出电子控制器 Eliwell IC 915 NTC-PTC具有双输出功能的电子控制器
生长室 - 植物培养室Rochina尺寸为 1.85 x 1.85 x 2.5 m（长×宽×高），总体积为 8.56 m³ 的培养室，具备昼夜温度、光周期（昼夜）、光照强度和最低相对湿度控制功能 
照明套件Cosmos Grow/Bloom Light带反射器、电子镇流器（钠灯/金属卤化物灯）和 600W 高压钠灯（HPS）的照明套件 
照度计Delta OHMHD 9221HD 9221 照度计，用于测量光照强度
植物材料Beniplant S.L (AVASA)来自注册苗圃并具有无病毒认证的柑橘树 
基质Plant Vibel由50%优质白泥炭和50%椰糠组成的标准化基质

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