一种用于研究大鼠制动诱导膝关节屈曲挛缩的微创内固定技术

摘要

本文介绍一种用于大鼠模型膝关节固定化的微创技术方案。该方案基于肌肉间隙分离方式和小切口技术，具有良好的可重复性，适用于研究获得性关节挛缩的潜在分子机制。

摘要

关节挛缩是由关节长期固定所致，是骨科领域常见的并发症。目前，通过植入内固定装置限制膝关节活动度是建立实验性挛缩模型的常用方法。然而，此类植入操作不可避免地会对动物造成手术创伤。为了建立一种创伤更小的方法，我们在手术过程中结合了肌间隙分离方式与既往报道的微小切口技术：在大腿外侧和小腿分别做两个微小皮肤切口，随后通过肌间隙分离暴露骨面。利用预先构建的内固定装置，将大鼠膝关节逐渐固定于约135°屈曲位置，且不损伤主要神经和血管。结果表明，这种简便的技术可促进动物术后快速康复。通过X射线或显微CT扫描分析证实了内固定装置位置正确。与对侧膝关节相比，固定侧膝关节的活动范围显著受限，表明该模型具有良好的有效性。此外，组织学分析显示，随着时间推移，膝关节后上方关节囊区域逐渐出现纤维沉积和粘连。因此，这种微创模型可能适用于模拟固定所致膝关节挛缩的发生发展过程。

引言

关节挛缩定义为双轴关节被动活动范围（ROM）受限^1,2。目前旨在预防和治疗关节挛缩的疗法已取得一定成效^3,4。然而，获得性关节挛缩的潜在分子机制在很大程度上仍不清楚⁵。不同社会群体中关节挛缩的病因具有高度多样性，包括遗传因素、创伤后状态、慢性疾病以及长期制动⁶。普遍认为，制动是获得性关节挛缩发生过程中的一个关键因素⁷。严重关节挛缩患者最终可能导致身体功能障碍⁸。因此，建立稳定且可重复的动物模型对于研究获得性关节挛缩的潜在病理生理机制十分必要。

目前建立的制动诱导型膝关节挛缩模型主要通过使用非侵入性石膏固定、外固定以及内固定来实现。Watanabe 等人报道了在大鼠膝关节上应用石膏固定制动的可能性⁹。通过穿戴特制背心，将大鼠一侧下肢关节用石膏固定，可使大鼠膝关节保持完全屈曲状态，且不造成任何手术创伤^10,11。然而，这种固定方式同时会影响髋关节和踝关节的活动，可能加剧股四头肌（quadriceps femoris）或腓肠肌（gastrocnemius）的肌肉萎缩程度¹²。此外，为避免后肢出现水肿和充血，需在规定时间点更换石膏，这可能影响制动的连续性。另一种被认可的建立膝关节挛缩模型的方法是采用外科外固定技术。Nagai 等人将克氏针与钢丝结合制成外固定器，将膝关节固定于约140°屈曲位置¹³。该方法使用树脂覆盖表面，以防止皮肤擦伤。尽管外固定制动具有良好的稳定性和可靠性^14,15，但经皮穿入的克氏针通道可能增加感染风险¹⁶。根据我们的经验，使用外固定技术可能导致大鼠日常活动减少，表现为条件性舔舐行为增加。

此外，Trudel 等人描述了一种在大鼠膝关节中广为接受的关节挛缩模型，该模型基于手术内固定技术¹⁷（此方法改良自 Evans 及其同事所采用的方法¹⁸）。值得注意的是，该方法强调使用小切口技术以最大程度减少手术创伤的重要性。该模型已被证实可有效诱导关节挛缩的形成¹⁹。然而，如何实施最小程度的解剖以暴露骨面的具体操作方案仍不明确²⁰。同时，螺钉钻入的精确位置也尚未完全明确。通过皮下或肌下途径植入内固定物的方式仍存在争议²¹。为解决这些问题，我们对该方法进行了改良，引入了一种适当的肌间隙分离方式，从而可通过微创途径暴露骨面，并经肌下通道植入固定装置。该操作方案使大鼠术后实现了快速康复。动物在关节固定后出现关节活动范围受限，这与组织学分析所观察到的关节囊粘连的形态学改变一致。我们还通过X射线分析或显微CT分析确认了螺钉钻孔的精确可行位置。因此，本研究旨在详细描述一种建立于肌间隙分离方式结合小切口技术基础上的膝关节挛缩模型中的微创操作技术。我们认为，微创技术既能减少动物的创伤，又能有效模拟关节屈曲挛缩的病理过程。

方案

所有操作均按照《实验动物护理与使用指南》进行，并经中山大学附属第三医院机构动物护理与使用委员会批准（许可编号：02-165-01）。所有动物实验均依照ARRIVE指南实施。

1. 术前准备

注意：图1 展示了手术操作的设计。

1. 使用一块塑料板和两枚金属螺钉将膝关节在约135°屈曲位进行牢固固定。
   注意：手术操作应在股骨近端和胫骨远端进行，避免侵犯关节结构。
2. 准备内固定所需材料和器械。
   1. 通过手术剪裁剪一个5 mL注射器的医用级聚丙烯塑料部分（图2a），制成尺寸如下：长度25 mm、宽度10 mm、厚度1 mm的塑料板（图2b）。使用手术刀垂直修整板的边缘使其光滑。用无菌生理盐水冲洗塑料板三次，以去除碎屑。
      1. 用75%乙醇浸泡消毒4小时，随后进行紫外线照射灭菌3小时。
   2. 在塑料板上预钻孔：准备一个手持式低速电动钻，转速约为0–4000 rpm（图2c）。在塑料板两端分别钻出直径为1 mm和0.9 mm的孔（图2d）。分别匹配M 1.4 mm × 8 mm和M 1.2 mm × 6 mm的钢螺钉于板的两端（图2e）。
      1. 使用前用75%乙醇擦拭，并经紫外线照射灭菌3小时。
3. 准备手术器械：直型蚊式止血钳1把、光滑弯头镊子1把、眼睑拉钩2个、持针器1把、组织镊1把、缝合剪1把、显微组织剪1把和手术刀1把（图2f）。将手术器械在121.3 °C下高压蒸汽灭菌20分钟，并干燥备用。
4. 实验动物
   1. 实验中使用体重在250–350 g之间的成年雄性SPF级Sprague-Dawley（或Wistar）大鼠。
      注意：可根据实验需要选择雌性或雄性大鼠。
   2. 将大鼠置于笼中，饲养于12小时光照/12小时黑暗循环控制的实验室环境中，提供充足的食物和饮水。

2. 手术

1. 调节温度。在恒温手术室内的手术平台上放置加热垫。
2. 麻醉与皮肤准备
   1. 使用电子天平称量大鼠体重并记录。
   2. 固定大鼠，进行腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）以诱导麻醉。通过脚趾夹捏法评估动物是否已达到充分麻醉状态。²²手术期间使用润滑剂保护角膜，防止干燥。
   3. 用电推剪剃除大鼠下肢及双后肢的毛发，先用聚维酮碘酊消毒两次，再用75%乙醇消毒三次。
   4. 将大鼠侧卧放置，用手术巾覆盖，仅暴露一侧后肢和髋部。
   5. 用聚维酮碘再次消毒手术区域。
3. 使用微创技术通过内固定法固定膝关节。
   注意：手术过程中需使用无菌生理盐水保持切口湿润。该手术通常需要两名外科医生。
   1. 标记皮肤切口方向。在股骨大转子远端，沿肌间隙体表投影画一条线 股外侧肌 和 股二头肌 (图3a）。沿画线切开表皮皮肤，长度约为1.5 cm（图3b).
   2. 钝性分离肌肉间隙 股外侧肌 和 股二头肌 用组织镊夹住，直至股骨干暴露约1 cm长度（图3c）。使用拉钩以利于持续分离肌间隙。
   3. 沿肌间隙在体表的投影方向，切开表皮皮肤，长约1 cm 胫骨前肌 和 腓骨长肌 远端下肢（图3d）。钝性分离肌肉间隙，直至胫骨暴露约1 cm 长度（图3e).
   4. 使用电钻以1,500 rpm的速度垂直在股骨干上钻一个直径为1.0 mm的孔，操作时用拉钩和光滑镊子分开软组织图3f）。正确的钻孔位置位于大转子下缘下方约8 mm处。迅速按压伤口以止血。
      注意：选择合适的钻孔直径可避免术中骨折。
   5. 在胫骨上距胫腓骨融合边缘约4 mm处钻一个直径为0.9 mm的孔图4a）。小心进行钻孔，以防止肌肉或肌腱受损。
   6. 使用直型蚊式止血钳，从胫骨孔向股骨孔建立一条皮下肌层隧道。该皮下肌层隧道位于 腓肠肌 胫骨末端及以上部位 臀中肌，位于下方的 股二头肌 在股骨末端。
   7. 使用一枚 M 1.4 mm × 8 mm 钢螺钉将塑料板的一端（带直径 1.0 mm 孔）固定于股骨近端图4b）。使用一枚 M 1.2 mm × 6 mm 钢螺钉将塑料板另一端（带直径 0.9 mm 孔）固定于胫骨远端（图4c）。确保膝关节无内翻畸形。
4. 关闭切口：使用4-0可吸收缝线缝合肌筋膜、深筋膜和皮下组织（图4d）。使用聚酰胺缝合皮肤 缝合线（图4f).

3. 术后管理

1. 术后通过皮下注射布托啡诺（Buprenorphine，0.03 mg/mL）给予镇痛，剂量为 0.05 mg/kg。术后5天内在饮水中添加 5 mg/mL 新霉素（Neomycin）。
2. 术后至少72小时内，每天两次皮下注射镇痛混合剂（布托啡诺和卡洛芬），剂量分别为 0.05 mg/kg 和 5 mg/kg。
3. 检查后肢是否出现过度水肿，以排除血管损伤；确保大鼠术后能正常行走，以判断是否存在术中神经损伤。

4. 术后检查

1. 术后隔天观察手术切口的愈合情况，并对膝关节进行体格检查，以评估感染的早期迹象。若持续出现水肿，需检查踝关节和掌指关节的肿胀程度。
   注意：术后早期感染可导致伤口渗出、腿部肿胀以及伤口愈合延迟。
2. 术后第1天对后肢进行X射线成像，以确认螺钉位置正确。
   注意：Micro-CT扫描分析是另一种可选方法，可用于显示钢螺钉的准确位置和方向。
3. 测量被动活动范围（ROM），以评估挛缩的发展情况。按照先前所述方法²⁰，在术后不同时间点进行膝关节ROM测量。
   1. 简言之，处死大鼠并剥离后肢皮肤。拆除固定装置后，使用机械关节测量仪在两种扭矩（667 或 1,060 g/cm）下测量膝关节角度²³。
   2. 根据研究目的，分别计算总挛缩、肌源性挛缩和关节源性挛缩所导致的ROM²⁴。
      注意：根据研究目标设定不同的时间队列（例如1、2、4、8、16和32周）。对侧膝关节（非手术侧或假手术侧）可作为对照²。
4. 膝关节后方关节囊的组织学分析。
   1. 准备关节组织。解剖获取膝关节组织，并用4%多聚甲醛固定。参照既往报道的方法进行脱钙处理，并包埋于石蜡中²⁵。在矢状面上，于内侧髁中段水平切取5 μm厚的切片。
      注意：可根据研究目的选择不同的染色方法，包括苏木精-伊红（HE）、醛品红-马松-戈德纳（AFMG）、弹性纤维-马松或免疫组织化学染色，用于关节囊的组织学研究^15,26。
   2. 观察膝关节后方关节囊的组织形态学变化。拍摄膝关节后部区域的照片，观察骨干-滑膜交界处与半月板之间纤维沉积及粘连的变化情况⁶。
      注意：关节囊的病理改变被认为是膝关节挛缩的致病因素之一。根据研究内容，参照先前描述的方法测量后方关节囊的长度、厚度及囊区面积²⁷。

结果

我们观察到，接受微创手术的大鼠术后仅一天即可恢复常规饮食。特别是，手术切口已结痂，无渗出物（图5a）。与对侧相比（图5c），术侧后肢踝关节和掌指关节的肿胀在术后两天时几乎完全消失（图5b）。未发现大鼠出现早期感染的任何迹象。大鼠能够正常站立并活动（图5d）。术后第十二天，手术伤口已完全愈合（图5）。

肉眼可见，膝关节在固定四周后出现挛缩，而微创手术对对侧肢体无明显影响（图6a）。X射线图像显示钢钉正确置于股骨或胫骨内（图6b），但未能显示塑...

讨论

本研究旨在阐明一种采用微创技术的膝关节固定方法，该方法可促进动物术后快速康复。传统上，肌间隙分离入路被认为是骨科手术中的一种微创技术。正如预期，我们发现大鼠在术后一天即可恢复正常的饮食和活动，这与既往研究结果一致。此外，手术后未发生动脉或神经损伤，表明肌间隙分离方式能够提供充分且安全的骨暴露方法。尽管使用石膏固定可减轻手术侵入性，但后肢可能出现水肿，从而影响固定的连续性。在本研究中，由手术操作引起的踝部或足趾肿胀在术后两天内完全消失。这些结果凸显了通过符合快速康复原则的微创技术建立的一种可靠且稳定的关节固定模型。临床上，由固定引起的屈曲挛缩更接近于非炎症性病程⁶。水肿可导致炎性介质的释放⁴。因此，使用石膏固定诱导关节挛缩实际上并非无害。在本研究中，分别在股骨侧和胫骨侧各进行两个独立的小切口（1-1.5 cm）。切口长度与克氏针钻孔所需切口大小相似。因此，该方法的微创效果更有利于将创伤降低至外固定水平。此外，既往一项随机对照试验表明，经皮使用外固定器可能与肢体感染风险增加存在潜在关联¹⁶。考虑到本...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
安尔迪安	上海利康有限公司	310173	抗菌
Buprenorphine	上海信谊药厂有限公司	/	镇痛
卡洛芬	MCE	HY-B1227	镇痛
十字螺丝刀	STANLEY	PH0*125mm	拧紧螺钉
电钻	WEGO	185	钻孔（使用0.9 mm和1.0 mm不锈钢钻头）
显微外科器械	RWD	/	动物骨科手术器械
新霉素	Sigma	N6386	抗菌
戊巴比妥钠	Sigma	P3761	麻醉
不锈钢螺钉	WEGO	m1.4*8; m1.2*6	螺钉（内固定部件）
注射器	WEGO	3151474	用于塑形板（内固定部件）
μ-CT	ALOKA	Latheta LCT-200	活体CT扫描