利用蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳与免疫印迹法分析培养的人类细胞中线粒体呼吸链复合物

摘要

本方案展示了通过蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳分析线粒体呼吸链复合物的方法。此处描述的是应用于培养的人源细胞的实验方法。

摘要

线粒体呼吸作用由线粒体内的氧化磷酸化（OXPHOS）复合物完成。内部和外部环境因素均可干扰OXPHOS复合物的组装与稳定性。本实验方案描述了在培养的人源细胞中应用蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）分析线粒体呼吸链复合物的方法。首先，使用洋地黄皂苷从细胞中提取线粒体，随后利用十二烷基麦芽糖苷从线粒体膜中分离出完整的OXPHOS复合物。然后，在带负电荷的染料考马斯亮蓝存在下，通过梯度凝胶电泳分离这些OXPHOS复合物，该染料可防止蛋白质聚集，并确保蛋白复合物向阴极迁移。最后，通过标准免疫印迹法检测OXPHOS复合物。因此，BN-PAGE是一种简便且经济的技术，可用于评估完整OXPHOS复合物的组装情况，而与之相比，常规SDS-PAGE仅能用于研究各个OXPHOS复合物的亚基组分。

引言

线粒体是多功能细胞器，在能量产生、细胞代谢调控、信号传导、细胞凋亡、衰老等方面发挥着重要作用^1,2,3。线粒体中的能量产生依赖于氧化磷酸化功能，该功能将呼吸作用与ATP合成相偶联。在人类细胞中，线粒体氧化磷酸化系统（OXPHOS）由五个复合物组成。复合物I-IV在线粒体膜间隙中建立电化学质子梯度，复合物V利用该梯度生成ATP。每个OXPHOS复合物均为多聚体结构，除复合物II外，其亚基均由核基因和线粒体基因共同编码。OXPHOS复合物核心组分因突变或环境应激导致的任何缺陷均可能干扰氧化磷酸化系统的组装及其功能。此外，功能性OXPHOS复合物的正确组装还需要大量组装因子^4,5,6 

蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）是一种用于分析完整蛋白质复合物的基本技术，可用于研究氧化磷酸化（OXPHOS）复合物的组装。首先，使用洋地黄皂苷（digitonin）从细胞中分离线粒体，这是一种温和的去垢剂，可通透细胞的质膜。随后，利用十二烷基麦芽糖苷（lauryl maltoside）将OXPHOS复合物从线粒体膜上释放出来。通过梯度凝胶电泳，OXPHOS复合物依据其分子质量进行分离。在样品缓冲液和蓝色阴极缓冲液中加入考马斯亮蓝G-250（而非R-250），该染料可解离对去垢剂敏感的相互作用，但能保持各个呼吸链复合物的完整性⁸。在电泳过程中，含有染料的蓝色阴极缓冲液被不含染料的阴极缓冲液取代，以确保OXPHOS复合物高效转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上⁸。为了可视化OXPHOS复合物，将PVDF膜依次与针对五种OXPHOS复合物特定亚基的一抗孵育。

经过一些修改后，本文所述方法可应用于任何培养的细胞。此外，该方法也可用于分析从组织样本中分离的线粒体中的氧化磷酸化（OXPHOS）复合物⁹。每次运行每个样本进行BN-PAGE至少需要5-10 µg线粒体。采用本文所述方法，50万个培养细胞（如HEK293、SH-SY5Y或143B细胞）可获得约10 µg线粒体。然而，进行BN分析所需的细胞数量取决于具体的细胞类型。

研究线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）蛋白最常用的方法是SDS-PAGE和蛋白质印迹（western blotting）。然而，SDS-PAGE仅能用于研究单个OXPHOS亚基，与BN-PAGE相比，无法评估完整OXPHOS复合物的组装情况。普通非变性PAGE（clear native-PAGE）可在天然条件下分离蛋白质复合物，且不使用带负电荷的染料，但其分辨率明显低于BN-PAGE。然而，由于普通非变性PAGE比BN-PAGE更温和，因此能够保留一些不稳定的蛋白质复合物超分子组装结构，例如在BN-PAGE条件下会解离的OXPHOS超复合物¹⁰。本实验方案中采用梯度凝胶来分离复合物；但若无法获得相对昂贵的梯度制备装置，也可选择使用非梯度凝胶进行分离¹¹。 

需要强调的是，此处描述的方法可用于分析氧化磷酸化（OXPHOS）复合物的组装情况，但无法评估这些复合物的功能活性。高分辨率BN-PAGE结合凝胶内活性检测¹¹，以及线粒体复合物的分光光度法酶活性检测¹²，是分析OXPHOS复合物功能的有效技术。然而，这两种方法均不能检测OXPHOS复合物的组装过程。

因此，BN-PAGE 是研究单个氧化磷酸化（OXPHOS）复合物组装情况的最佳方法。例如，某些线粒体疾病（如Leber遗传性视神经病变（LHON）、伴乳酸酸中毒和卒中样发作的线粒体脑肌病（MELAS））与OXPHOS系统中一个或多个组分的组装异常相关⁵。通过使用此处所述的BN-PAGE方法，可研究线粒体疾病的分子机制。 

方案

注意：本实验方案基于 Hilander 等人发表的相关文献¹³。

1. 缓冲液和溶液的配制

注意：本实验方案中使用的所有缓冲液和溶液均汇总于表1中。所列缓冲液体积足以用于制备和运行10个样品。所有缓冲液可在+4 °C下保存长达一年。 

1. 在去离子水（dH₂O）中配制 20 mL 3× 凝胶缓冲液，含 1.5 M 氨基己酸和 150 mM Bis-tris。调节 pH 至 7.0。
2. 在去离子水（dH₂O）中配制 10 mL 2 M 氨基己酸溶液。
3. 通过混合以下组分配制 1 mL 线粒体缓冲液：0.5 mL 3× 凝胶缓冲液、0.5 mL 2 M 氨基己酸和 4 µL 500 mM EDTA。
4. 在去离子水（dH₂O）中配制 1,000 mL 阴极缓冲液，含 15 mM Bis-tris 和 50 mM 三羟甲基氨基甲烷丙酸（tricine）。调节 pH 至 7.0。
   1. 向 200 mL 阴极缓冲液中加入 0.04 g 考马斯亮蓝 G-250，配制 200 mL 蓝色阴极缓冲液。
5. 在去离子水（dH₂O）中配制 1,000 mL 阳极缓冲液，含 50 mM Bis-tris。调节 pH 至 7.0。
6. 在去离子水（dH₂O）中配制 2.5 mL 样品缓冲液，含 750 mM 氨基己酸和 5% 考马斯亮蓝 G-250。

2. 线粒体裂解物的制备

1. 在收集样品的前一天接种细胞。对于 HEK293 或 143B 细胞，使用含 10% 胎牛血清、1% L-谷氨酰胺、100 mg/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。将细胞置于 +37 °C、5% CO₂ 湿润环境的细胞培养箱中培养。确保在收集当天每份样品至少含有 500,000 个细胞。
2. 用预冷的 PBS 轻柔洗涤细胞一次，避免细胞从培养板上脱落。刮下细胞并在 +4 °C 下以 800 × g 离心 10 分钟，收集细胞沉淀。 
3. 用预冷的 PBS 洗涤细胞沉淀两次，离心条件同步骤 2.2。使用商用试剂盒通过 Bradford 法测定蛋白质浓度。在 +4 °C 下以 800 × g 离心 10 分钟，收集细胞沉淀。
   注意：细胞收集后，所有操作均应在 +4 °C 下进行，且不得涡旋振荡。 
4. 通过向 20 mL PBS 中加入 200 µL 100× 蛋白酶抑制剂，配制含蛋白酶抑制剂的 PBS 溶液共 20 mL，置于冰上保存。用含蛋白酶抑制剂的 PBS 重悬细胞，使最终蛋白质浓度为 5 mg/mL。
   1. 为计算以 5 mg/mL 蛋白质浓度重悬细胞所需的含蛋白酶抑制剂 PBS 体积，需先确定每份样品中的蛋白质总量。该计算应基于步骤 2.3 中测得的蛋白质浓度以及步骤 2.3 洗涤后用于重悬细胞的 PBS 体积。
5. 配制 1 mL 含蛋白酶抑制剂的 PBS 中 3.3 mM 桔霉素溶液。将其加入样品中至终浓度为 1.65 mM。充分混匀后冰上孵育 5 分钟。 
   1. 为配制 1 mL 含蛋白酶抑制剂的 PBS 中 3.3 mM 桔霉素溶液，将 4 mg 桔霉素溶于 1 mL PBS 中，在 100 °C 加热至无可见沉淀，立即置于冰上冷却。向 1 mL 桔霉素溶液中加入 10 µL 100× 蛋白酶抑制剂。
      注意：仅使用新鲜配制的桔霉素溶液。
      警告：桔霉素具有毒性！操作时须佩戴口罩、手套并穿实验服。
6. 加入含蛋白酶抑制剂的 PBS（按步骤 2.4 配制），调节终体积至 1.5 mL。在 +4 °C 下以 10,000 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。此步骤中线粒体被沉淀下来。 
7. 用线粒体缓冲液重悬线粒体沉淀。线粒体缓冲液的体积为步骤 2.4 中 PBS 体积的一半。
8. 新鲜配制含蛋白酶抑制剂（按步骤 2.4 配制）的 PBS 中 10% 十二烷基麦芽糖苷溶液。每 10 个样品准备 1 mL 即可。将 10% 十二烷基麦芽糖苷加入样品中至终浓度为 1%。冰上孵育 15 分钟（此步骤可延长至数小时）。
9. 在 +4 °C 下以 20,000 × g 离心 20 分钟。将上清液转移至新管中。使用试剂盒通过 Bradford 法测定蛋白质浓度。加入样品缓冲液，其体积为步骤 2.8 中所用十二烷基麦芽糖苷体积的一半。样品可在 -80 °C 保存长达 6 个月。

3. BN-PAGE 梯度凝胶的制备

1. 在室温下配制用于 BN-PAGE 的梯度凝胶。将梯度混合器置于搅拌台上，并通过软管连接至蠕动泵。将带有针头的输液装置连接到软管上。将磁力搅拌子放入梯度混合器的近端腔室中 。以最大泵速用 dH₂O 冲洗软管 10 分钟。
2. 排空软管和梯度混合器。使用移液器清除梯度混合器两腔室之间通道中残留的 dH₂O。用阀门关闭通道和软管。
3. 使用浇铸架和夹具将两块玻璃板组装在底部带孔的支架中，并将其放置在支架上。确保其基本处于水平位置，可借助水平仪校准。将连接软管的针头插入两块玻璃板之间。 
4. 配制 6% 和 15% 的凝胶溶液（表 2），置于冰上保存。最后加入过硫酸铵（APS）和四甲基乙二胺 （TEMED）（二者可引发聚合反应）。轻轻混匀，避免产生气泡。
5. 将 6% 凝胶溶液加入梯度混合器的近端腔室，15% 凝胶溶液加入远端腔室。凝胶总体积应等于玻璃板之间的分离胶体积。因此，每块尺寸为 8.3 cm × 7.3 cm 的凝胶，需向梯度混合器中加入 2.6 mL 的 6% 凝胶和 2.1 mL 的 15% 凝胶。
6. 开启磁力搅拌器，打开梯度混合器腔室之间的通道和软管。立即启动蠕动泵，流速设为 5 mL/min。向玻璃板间灌注凝胶时，避免气泡进入。当软管中无凝胶时，移除针头。
7. 在凝胶表面轻轻覆盖一层 dH₂O。室温下静置至少 1 小时，使凝胶充分聚合。
8. 凝胶灌注完成后立即清洗软管：用 dH₂O 填充梯度混合器的腔室，并以最大流速运行蠕动泵。若需制备两块或更多凝胶，每次使用后均须彻底清洗系统。
9. 通过混合 3 mL 的 3x 凝胶缓冲液与 6 mL 的 dH₂O 配制 1x 凝胶缓冲液。用滤纸轻轻吸除凝胶表面的 dH₂O。用 1x 凝胶缓冲液冲洗凝胶表面，再用滤纸轻轻吸除 1x 凝胶缓冲液。
   1. 避免滤纸纤维残留在凝胶表面。为确保这一点，应使用剪刀将滤纸剪成小片，切勿用手撕纸。
10. 将梳子插入两块玻璃板之间，但不要完全插入，以便在梳子下方灌注浓缩胶。配制 4% 浓缩胶（表 2）。APS 和 TEMED 应最后加入，因其易引发聚合反应。轻轻混匀，避免产生气泡。
11. 覆盖浓缩胶时避免在梳子下方产生气泡，并将梳子完全插入。让浓缩胶聚合至少 30 分钟。取出梳子后，用移液器吸取 1x 凝胶缓冲液冲洗加样孔。
    1. 聚合完成后，凝胶可在 +4 °C 保存数天。如需保存，应将凝胶包裹在浸有 dH₂O 的滤纸和塑料膜中，防止脱水干燥。

4. 蓝色天然凝胶电泳

注意：为防止氧化磷酸化复合物降解，请在 +4 °C 条件下进行电泳，并使用预冷的缓冲液。 

1. 用蓝色阴极缓冲液填充凝胶卡盒至加样孔底部。当卡盒未完全充满时，加样操作更为方便。用蓝色阴极缓冲液冲洗加样孔，然后用移液器将蓝色阴极缓冲液加入加样孔中。
2. 将样品（5–30 µg 蛋白质）加入加样孔中。轻轻将凝胶卡盒用蓝色阴极缓冲液加满，并向电泳槽中加入阳极缓冲液。
3. 以40 V恒定电压电泳15分钟，随后将电压升至80 V（或使用6 mA恒定电流），电流不得超过10 mA。持续电泳至染料迁移至凝胶长度的2/3处。
4. 将蓝色阴极缓冲液更换为普通阴极缓冲液，继续电泳直至染料前沿跑出凝胶。总体而言，电泳过程约需3小时。
5. 取出玻璃板，通过半干转法将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。使用25 V恒定电压、电流限制在1.0 A，转膜30分钟。
   1. 也可采用湿转法将OXPHOS复合物转移至PVDF膜上。 
6. 按照标准免疫印迹实验流程进行膜的封闭和抗体孵育。依次使用针对OXPHOS复合物各亚基的一抗。 
   注意：例如，复合物I使用抗NDUFA9抗体（1:2000），复合物II使用抗SDHA抗体（1:2000），复合物III使用抗UQCRC2抗体（1:1000），复合物IV使用抗COX1抗体（1:2000），复合物V使用抗ATP5A抗体（1:2000）。抗体列表见材料表。

结果

利用BN-PAGE可以研究线粒体OXPHOS复合物组装过程中的缺陷。图1A展示了经氯霉素处理的人类神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）中呼吸链复合物的组装情况，氯霉素可特异性抑制由线粒体DNA编码的OXPHOS亚基的翻译。氯霉素导致含有线粒体编码亚基的OXPHOS复合物减少（复合物I、III、IV；图1A），而完全由核基因编码的复合物II则代偿性上调。本实验未对复合物V进行免疫印迹检测。

多次冻融循环会破坏氧化磷酸化复合物。图1B展示了冻融循环导致氧化磷酸化复合物降解的情况。经过多次冻融循环的样品3中，线粒体呼吸复合物的条带强度较低，并且与仅冷冻一次的相同样品相比发生了偏移。图1B的未裁剪的蛋白质印迹图像见补充图1。

凝胶的质量对于获得清晰锐利的条带至关重要。图 1C 展示了来自聚合不良凝胶的免疫印迹。膜的剥离也可能影响氧化磷酸化复合体的检测。在图 1D中，分别在剥离前后检测了复合体 I，剥离后的信噪比明显降低。

图1. 成功与次优实验的BN-PAGE免疫印迹结果。(A) 通过线粒体翻译抑制剂耗竭OXPHOS复合物。人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）用氯霉素（CAP）处理48小时。CTRL为未经氯霉素处理的对照细胞。下图显示免疫印迹的定量结果。对照组的值设为1（以虚线表示）。数据以均值±标准差表示，n = 3，*P < 0.0001，采用非配对Student’s t检验与对照组比较。(B) 多次冻融循环对OXPHOS复合物的破坏作用。样品1-3均在相同条件下从人骨肉瘤细胞（143B）制备。样品1和2仅经历一次冻融循环，而样品3经历了四次冻融循环。(C) 从HEK293细胞中分离的OXPHOS复合物的BN-PAGE免疫印迹。条带弥散是由于凝胶质量较低所致。(D) 剥脱处理对OXPHOS复合物检测的影响。同一膜在剥脱前后对人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）中复合物I的检测。OXPHOS复合物使用抗NDUFA9抗体（复合物I）、抗SDHA抗体（复合物II）、抗UQCRC2抗体（复合物III）和抗COX1抗体（复合物IV）进行检测。请点击此处查看该图的放大版本。

缓冲液或溶液	成分	配制方法
3 × 凝胶缓冲液	1.5 M 氨基己酸	3.94 g 氨基己酸
	150 mM Bis-tris	0.63 g Bis-tris
	dH2O	加 dH2O 至 20 mL
	pH 7.0	调节 pH 至 7.0
阴极缓冲液	15 mM Bis-tris	3.14 g Bis-tris
	50 mM 三(羟甲基)氨基甲烷丙酸（tricine）	8.96 g tricine
	dH2O	加 dH2O 至 1000 mL
	pH 7.0	调节 pH 至 7.0
蓝色阴极缓冲液	0.02% 考马斯亮蓝 G	0.04 g Serva 蓝 G
	15 mM Bis-tris	200 mL 阴极缓冲液
	50 mM tricine
	dH2O
	pH 7.0
阳极缓冲液	50 mM Bis-tris	20.93 g
	dH2O	加 dH2O 至 2000 mL
	pH 7.0	调节 pH 至 7.0
线粒体缓冲液	1.75 M 氨基己酸	0.5 mL 3 × 凝胶缓冲液
	75 mM Bis-tris	0.5 mL 2 M 氨基己酸
	2 mM EDTA	4 µL 500 mM EDTA
	dH2O	-
	pH 7.0	-
上样缓冲液	750 mM 氨基己酸	0.94 mL 2 M 氨基己酸
	5% 考马斯亮蓝 G	0.125 g Serva 蓝 G
	dH2O	加 dH2O 至 2.5 mL
2 M 氨基己酸	2 M 氨基己酸	2.62 g 氨基己酸
	dH2O	加 dH2O 至 10 mL

表1. 用于BN-PAGE的缓冲液和溶液。

蓝色天然凝胶	6% 分离胶	15% 分离胶	4% 浓缩胶
3 x 凝胶缓冲液	3.3 mL	3.3 mL	1.64 mL
40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 37.5:1	1.5 mL	3.75 mL	0.5 mL
dH2O	5.14 mL	0.93 mL	2.77 mL
甘油	0	2 mL	0
10% 过硫酸铵*	60 µL	10 µL	60 µL
TEMED	4 µL	2 µL	6 µL
总体积	10 mL	10 mL	5 mL
*每次均需用 dH2O 新鲜配制 10% 过硫酸铵溶液

表2. BN-PAGE凝胶配方。

补充图 1. 图 1B 未裁剪的蛋白质印迹图像。 请点击此处下载该图。

讨论

该实验方案中最关键的步骤之一是在样品制备、储存和凝胶电泳过程中保持氧化磷酸化（OXPHOS）复合物的完整性。因此，线粒体分离过程应在+4 °C下进行，样品应避免反复冻融。在整个实验流程中，OXPHOS复合物最多只能耐受一次冻融循环，多次冻融会破坏OXPHOS复合物（图1B）。需要相互比较的对照组与实验组样品应平行处理，以避免因储存条件不同而导致结果产生误导。如果无法对所有样品同步完成实验的全部步骤，建议将洗涤后的细胞沉淀在-80 °C冷冻保存（本方案第1.4步），之后再统一完成后续所有操作，至少在进行凝胶电泳前应保持一致。应特别注意电泳装置（电泳槽、胶夹）的清洁。若同一装置曾用于SDS-PAGE，请在进行BN-PAGE前彻底清洗，任何残留的SDS都可能导致电泳过程中OXPHOS复合物解离。

高质量的梯度凝胶是该实验方案的另一个关键部分。市面上有用于蓝色天然PAGE的预浇注凝胶，但不建议使用，因为商用凝胶所用的缓冲液成分可能与样品缓冲液不同。此处使用的凝胶梯度（6-15%）最适合分离单个氧化磷酸化（OXPHOS）复合物。若要检测OXPHOS的更高级超分子结构（也称为呼吸链超级复合物¹⁴），则需要进行一些优化¹¹。

根据抗体的特性，依次使用特异性抗体来可视化氧化磷酸化（OXPHOS）复合物。例如，先使用信号最弱的抗体，最后使用信号最强的抗体。这一点非常重要，因为洗脱步骤会减弱后续检测信号（图1D）。如果在进行BN-PAGE后，将凝胶进行第二维SDS-PAGE电泳，则可进一步研究呼吸链复合物的组成¹⁵。

本文所述方案建议依次使用针对各个氧化磷酸化（OXPHOS）复合物的特异性抗体。然而，也可使用市售的OXPHOS抗体混合物，同时检测全部五种OXPHOS复合物。尽管如此，为了能够检测尚未完全组装的OXPHOS复合物并确定其身份，仍应依次单独使用针对各个OXPHOS复合物的抗体。该步骤较为耗时，但在测试新的实验条件和模型时可能至关重要。 

用于线粒体分离的皂苷（digitonin）浓度应根据特定细胞类型进行优化。作为一种去垢剂，皂苷可使细胞膜通透。最佳浓度的皂苷能有效通透细胞质膜，同时保持线粒体膜的完整性。皂苷浓度过低 会导致线粒体提取物中杂质含量较高，而浓度过高 则会损伤线粒体膜，降低总的线粒体得率。最佳的皂苷/蛋白比例（g/g）在0.3至1之间。可通过Western blot分析从沉淀和上清液中提取的蛋白质，以确定皂苷的最佳浓度¹⁶。

本实验方案未在免疫印迹中设置蛋白质上样量对照；因此，应至少以三份平行样本精确测定所提取复合物的蛋白质浓度，以确保上样量均等。此外，样品可进行重复的BN-PAGE电泳。若某些特定的氧化磷酸化复合物组装受到影响，未受影响的复合物可作为上样对照。

在BN-PAGE中对蛋白质复合物的分子质量进行估算具有挑战性¹⁸。当前的实验方案未包含分子量标记物；因此，为了估算氧化磷酸化（OXPHOS）复合物的组装情况，分析时应始终包含含有未受影响复合物的对照样品。BN-PAGE的对照样品通常为未经处理或野生型细胞。 

本文所述方法已针对线粒体呼吸链复合物的检测进行了优化；然而，该方法也可用于评估线粒体蛋白质的寡聚化状态¹⁹。此外，可通过氯霉素首先耗尽含有线粒体编码亚基的复合物，然后在去除氯霉素后观察其恢复情况，从而研究氧化磷酸化（OXPHOS）复合物的组装速率¹⁰。因此，BN-PAGE可用于评估OXPHOS在不同应用中的稳态水平和组装情况，包括人类线粒体疾病的分子诊断^9,11。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mm 细胞培养皿	Thermo Fisher Scientific	130182
40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 37.5:1	Bio-Rad	161-0148
氨基己酸	Sigma	A2504
过硫酸铵	Sigma	A3678
抗 ATP5A 抗体	Abcam	14748	复合物 V 亚基
抗 MTCOI 抗体	Abcam	14705	复合物 VI 亚基
抗 NDUFA9 抗体	Abcam	14713	复合物 I 亚基
抗 SDHA 抗体	Abcam	14715	复合物 II 亚基
抗 UQCRC2 抗体	Abcam	14745	复合物 III 亚基
双-Tris	Sigma	B7535
Bradford 蛋白检测试剂盒	BioRad	5000006
细胞刮刀	Fisher	11597692
考马斯亮蓝 G250（Serva Blue G）	Serva	35050
皂苷	Sigma	D141
DMEM 培养基	Lonza	12-614F/12
EDTA	Life Technologies	15575-038
FBS	Life Technologies	10270106
胎牛血清	Life Technologies	10270106
甘油	(Sigma	G5516
梯度制备仪	Bio-Rad	1654120
月桂基麦芽糖苷（n-十二烷基 β-D-麦芽糖苷）	Sigma	D4641
L-谷氨酰胺	Life Technologies	25030024
L-谷氨酰胺	Gibco	25030
N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）	Sigma	T9281
PBS	Life Technologies	BE17-516F
青霉素/链霉素	Lonza	17-602E
青霉素/链霉素	Gibco	15140
电源	GE Healthcare	EPS 301
蛋白酶抑制剂	Thermo Scientific	10137963
Trans-blot turbo mini PVDF 转印膜	BioRad	1704156
Tricine	Sigma	T9784
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	15400054
垂直电泳装置	BioRad	1658004