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方法文章

测量访问三种不同自然程度地点后的生物物理与心理压力水平

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DOI：

10.3791/59272

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2019年6月19日

 ,  ,  , 
1School of Kinesiology and Recreation, Illinois State University, 2Department of Recreation, Park, and Tourism Studies, Indiana University, 3Department pf Environmental and Occupational Health, School of Public Health-Bloomington, Indiana University

本文内容

摘要

本文的目的是确定在访问三种不同环境后压力水平的变化，并描述基于唾液皮质醇、α-淀粉酶测量值以及心理自评量表来识别压力水平所使用的方法。 

摘要

接触自然环境已被证实与心理压力的减轻有关。尽管大多数与压力相关的研究依赖于自我报告形式，但现在越来越多的研究开始结合生物性压力相关激素和催化剂（如皮质醇和α-淀粉酶）来测量压力水平。本文介绍了一种研究方案，用于评估在三种不同自然程度的地点进行访问后，个体生理及心理压力水平的变化。生理及自我报告的心理压力水平在受试者进入所选地点后立即测量，并在离开地点前再次测量。通过一种"唾液收集”方法，获取受试者进入三个研究地点之一时提供的1–2 mL唾液样本，作为生理指标的测量依据。根据现有文献规定，唾液样本在受试者结束在该地点的活动后45分钟内完成采集。唾液采集后，样本进行标记并运送至生物实验室。本研究关注的主要生理变量是皮质醇，采用ELISA方法并使用TECAN酶标仪进行测定。为评估自我报告的压力水平，采用感知压力问卷（Perceived Stress Questionnaire, PSQ），该问卷用于报告担忧、紧张、愉悦感以及感知到的需求程度。所有三个地点的数据均在傍晚至晚间早期收集。在三种环境之间进行比较时，无论是通过生物标志物还是自我报告所测得的压力水平，在最具自然特征的环境中访问后的压力水平均显著更低。

引言

长期处于高压力水平与多种严重健康问题相关，例如心脏病、肥胖症和心理障碍1,2,3。越来越多的研究表明，接近或访问自然环境（如公园和未开发的景观）对心理健康具有显著积极影响，并可有效降低压力水平1,4,5,6,7,8,9,10。关于自然环境对压力水平影响的解释主要包括以下两点：（1）自然环境为体力活动提供了场所8,11；（2）身处自然环境中的访客能够专注于非任务性的思维过程，从而减轻注意力疲劳12。为了评估自然环境对压力缓解的作用，本研究在访问三个不同类型休闲场所后，采用心理压力自评量表（PSQ）以及两种基于唾液的生物标志物——皮质醇和α-淀粉酶进行检测。这些地点在"自然程度"方面各不相同，包括一种类似荒野的环境、一个市政公园以及一个本地健身与休闲设施。

本研究旨在解决以下研究问题：（RQ1）在三种不同环境（即自然环境、半自然环境和建成环境）之间，通过唾液皮质醇和α-淀粉酶所测量的生理应激水平是否存在差异？（RQ2）在三种不同环境（即自然环境、半自然环境和建成环境）之间，通过压力感知问卷（PSQ）所测量的心理应激水平（表现为四个维度：需求、担忧、紧张和愉悦）是否存在差异？

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方案

本研究遵循印第安纳大学机构审查委员会人体研究保护计划的政策与指南。

1. 地点选择

  1. 根据自然程度的不同水平选择样地数量（n）。
    注：本研究选择了三个样地。依据“自然性”水平的连续体，样地A被认为是最自然的，包含约1,200英亩林木覆盖的山脊，毗邻湖泊，位于落叶林内，最常见的活动包括步行和野生动物观察。样地B是一个33英亩的市政公园，设有步行道、集会场所、游乐场以及用于非正式休闲活动的开阔场地。样地C为城市内的室内健身场所，自然性最低。这三个样地均位于美国中西部一座中等规模城市（估计人口为46,000人）的相对邻近区域。

2. 受试者筛选与准备

  1. 在受试者参与休闲活动之前完成参与者招募。
    注：在A地和B地，研究人员在公园入口的停车场接近受试者；在C地，研究人员在室内运动设施的前台接近受试者。为控制活动类型差异，A地和B地招募的受试者主要进行徒步，而C地的主要活动为在室内跑道上跑步或步行。
  2. 在招募过程中，提醒受试者遵守与采集唾液皮质醇样本相关的指导原则。提供唾液样本前10分钟内不得进食或饮水。
    注：需注意，本研究中唾液样本未对体积或稀释度（浓度）进行标准化处理，即未考虑参与者水合状态是否充分，或两次样本采集之间水合状态是否发生变化。
  3. 向每位参与者发放红色臂带（或同等醒目的服装），以便在其活动结束后返回时易于识别。
  4. 分配30至40分钟的时间段，使所有三个地点的受试者在各地点停留的时间大致相同。排除在各地点停留时间明显多于或少于其他受试者的个体。
  5. 保持所进行活动类型的统一。
    注：本研究中，“中等强度”活动定义为步行或徒步。从事与步行或徒步明显不同的活动的受试者将被排除在样本之外。例如，钓鱼、野餐或举重的受试者未被纳入相应样本中。

3. 条件与实验设计

  1. 采用准实验的前测/后测设计。
  2. 确定受试者并获得其参与同意后，要求每位受试者阅读并签署一份机构审查委员会（IRB）表格，说明研究的自愿性质、目的和具体流程。
  3. 完成上述步骤后，向受试者发放一件用于后续识别的衣物（例如红色臂带），并采集其生理和心理层面的压力水平指标（即PSQ量表评分，以及1-2 mL通过吐或滴入试管方式收集的唾液样本）。样本采集时间为下午晚些时候至傍晚早期。
    注意：这些数据由研究人员在两种时间点采集：1）受试者进入实验场所前即刻；2）受试者结束场所访问后立即采集。

4. 唾液样本

  1. 为避免样本稀释，要求受试者在采集唾液样本前10分钟内不要进食、饮水或漱口。
  2. 要求受试者在休闲体验开始前及体验结束后立即提供1-2 mL唾液样本（不含泡沫）。
  3. 采用被动滴流法收集唾液样本：
    1. 为受试者提供一根2英寸的塑料吸管，用于将唾液滴入2 mL冻存管中（参见材料表）。
    2. 指导受试者让唾液在口中聚集后，通过吸管自然滴入冻存管。根据《唾液采集与处理指南》（2011年），1 mL（不含泡沫）已足够大多数检测使用。
    3. 使用指定的三位数编号（例如001）及字母对样本进行标记，以表示采集时间点（例如A代表体验前，B代表体验后；001A表示编号001的受试者在休闲体验前提供的唾液样本）。
    4. 样本采集并标记后，应暂时储存在装有干冰的聚苯乙烯泡沫盒中，冷冻保存时间不超过2小时。
    5. 将标记好的样本运送至实验室，并在-80 °C条件下长期保存直至分析。

5. α-淀粉酶的定量分析

注意：在此测定中，α-淀粉酶将2-氯-对硝基苯基-α-D-麦芽三糖苷水解为2-氯-硝基苯酚，并生成葡萄糖、2-氯-对硝基苯基-α-D-麦芽糖苷、麦芽三糖和葡萄糖。通过在405 nm处的吸光度监测反应，该吸光度对应于样品中α-淀粉酶的活性。本测定在0至2000 U/L范围内呈线性。

  1. 材料
    1. 使用液体淀粉酶试剂盒（参见材料表）对唾液样本中的α-淀粉酶进行定量。所有试剂均为即用型液体，储存温度为0–4 °C。
    2. 使用多功能酶标仪（参见材料表），在检测过程中于37 °C控温条件下读取405 nm处的光密度值。
  2. 分析
    1. 检测前将样本置于冰上解冻。
    2. 用1×PBS将样本稀释10倍（10 µL唾液 + 90 µL PBS）。
    3. 每个样本设两个复孔进行检测。
    4. 将淀粉酶试剂在20–25 °C条件下平衡至少30分钟。
    5. 向96孔微孔板中每孔加入0.1 mL淀粉酶试剂。
    6. 将微孔板在37 °C预孵育至少5分钟。
    7. 向淀粉酶试剂中加入2.5 µL样本。
    8. 反应60秒后进行第一次读数。
    9. 此后每隔60秒继续读数，持续2分钟。
    10. 计算每分钟平均吸光度变化值（ΔAbs/min）。
  3. 计算
    1. 计算淀粉酶活性时，使用以下公式：
      静态平衡方程，用于唾液α-淀粉酶活性分析的每分钟吸光度变化（ΔAbs/min）公式。
      其中ΔAbs/min = 每分钟吸光度差值的变化；TV = 总反应体积（0.1025 mL）；*1000 = 将U/mL转换为U/L；MMA = 2-氯-对硝基苯酚的毫摩尔吸光系数 = 12.9；SV = 样本体积（0.0025 mL）；LP = 光程（1 cm）。代入后得：
      静态平衡公式图解，ΔAbs/min计算，U/L α-淀粉酶酶活性分析。
      因此，将ΔAbs/min乘以3178再乘以稀释倍数（10），即可得到以U/L为单位的淀粉酶活性。
    2. 对于高于2000 U/L（检测线性范围）的样本，需进一步稀释（至少用PBS稀释2倍），重新检测后将α-淀粉酶结果乘以额外的稀释倍数。

6. 皮质醇的定量

注意：本实验通过皮质醇标准曲线定量唾液中的游离皮质醇。将标准品和稀释后的样本加入预先包被有抗体的微量滴定板中。向孔中加入皮质醇-过氧化物酶结合物，随后加入抗皮质醇的单克隆抗体。随着样本中皮质醇浓度的增加，皮质醇/过氧化物酶结合物的结合量减少。

  1. 材料
    1. 使用皮质醇酶免疫分析试剂盒（见材料表）对唾液样本中的皮质醇进行定量。该试剂盒包含进行此检测所需的所有试剂。所有组分在有效期内应储存于 0–4 °C。
    2. 使用能够读取 450 nm 处光密度（OD）的分光光度计（见材料表），以及能够利用酶标仪的 OD 读数进行四参数逻辑曲线（4 PLC）拟合的软件。
  2. 试剂准备
    1. 将所有试剂在 20–25 °C 下平衡至少 30 分钟。
    2. 使用去离子水将皮质醇分析缓冲液按 1:5 比例稀释。
    3. 使用去离子水将洗涤缓冲液按 1:20 比例稀释。
      注：分析缓冲液和洗涤缓冲液在 0–4 °C 下储存时可稳定保存 3 个月。
  3. 样本准备
    1. 分析前将样本置于冰上解冻。
    2. 用皮质醇分析缓冲液将样本按 1:10 比例稀释（20 µL 唾液 + 180 µL 缓冲液），并在配制后 2 小时内使用。
  4. 标准品制备
    1. 标记玻璃试管编号 #1–#7。
    2. 向试管 #1 中加入 225 μL 分析缓冲液，向试管 #2–#7 中各加入 125 μL 缓冲液。
    3. 向试管 #1 中加入 25 μL 皮质醇储备液，并涡旋混匀。
    4. 从试管 #1 中取出 125 μL 缓冲液加入试管 #2 中，然后涡旋混匀。
    5. 对试管 #3–#7 重复梯度稀释操作。
      注：各标准品的最终皮质醇浓度见表 1。
    6. 标准品必须在配制后 2 小时内使用。
标准品#1#2#3#4#5#6#7
检测缓冲液体积 (μL)225125125125125125125
添加物标准品原液#1#2#3#4#5#6
添加体积 (µL)25125125125125125125
终浓度 (pg/mL)3200160080040020010050

表1：标准曲线制备表。

  1. 分析
    1. 参照图1中的微孔板布局设置微孔板。
    2. 建议使用多通道移液器加入试剂。
    3. 向微孔板中相应数量的孔中加入50 μL样品或标准品。样品和标准品应设复孔。
    4. 向非特异性结合（NSB）孔中加入检测缓冲液（75 μL）。
    5. 向最大结合（B0）孔和零标准品（空白）孔中各加入检测缓冲液（50 μL）。
    6. 向每孔加入25 μL皮质醇偶联物。
    7. 除NSB孔外，向其余各孔加入25 μL皮质醇抗体。
    8. 轻轻敲击微孔板侧壁以混匀试剂。
    9. 用封板膜覆盖微孔板，并在室温（RT，20–25 °C）下震荡孵育1小时。
    10. 移除孔内液体，用洗涤缓冲液（300 μL）洗涤各孔4次。每次洗涤之间将微孔板倒扣在吸水纸上轻拍以吸干液体。
    11. 向每孔加入TMB底物（100 μL）。
    12. 在20–25 °C下避光孵育30分钟，不震荡。
    13. 向每孔加入终止液（50 μL）。
    14. 在450 nm波长下读取微孔板各孔的光密度值。
    15. 计算每个标准品的光密度平均值，然后计算每个样品的光密度平均值，并减去NSB孔的平均光密度值。
    16. 使用最大结合（B0）对照，计算所有样品的结合百分比（%B/B0）。
    17. 使用具备四参数逻辑斯蒂曲线拟合功能的软件，根据%B/B0数据绘制标准曲线。
    18. 将计算结果乘以稀释倍数（10），得到以pg/mL为单位的皮质醇浓度。
    19. 若样品的光密度值高于最高标准品，应使用检测缓冲液进一步稀释后重新检测，并将结果乘以相应的额外稀释倍数。

用于实验设置的微孔板图示，包含标准品、未知样品、空白孔、NSB 和 B0 孔。
图 1：微孔板布局示例。 请点击此处查看此图的放大版本。

7. 心理测量（感知压力量表）

  1. 使用 Fliege 等人发表的压力感知问卷（PSQ）13 测量受试者的心理状态水平，该问卷包含四个因子（担忧、紧张、压力、喜悦），共 20 个条目。
  2. 要求受试者在休闲体验开始前以及体验结束后立即填写 PSQ 问卷。
  3. 将问卷标记为与每位受试者生理心理压力水平相对应的三位数 ID 编号。

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结果

样本描述
本研究采用配额抽样方法，从三个地点各自招募了35名访客。研究共招募了105名受试者，其中包括63名男性和42名女性。从三个不同地点招募的访客平均年龄分别为25.9岁（地点A）、37.2岁（地点B）和28.8岁（地点C）。同时记录了受试者访问这三个选定地点的频率。对于地点A和地点C，大多数受试者每周访问一至三次；而对于地点B的受试者，其访问频率在每周一至三次和每周超过三次之间大致均等。

生物物理和心理压力指标。采用皮质醇和α-淀粉酶水平的生物物理指标来识别生理压力水平的变化。通过PSQ量表识别心理压力的变化。

休闲场所访问对皮质醇水平和α-淀粉酶水平的影响
第一个研究问题探讨了不同类型的场所（例如，自然程度）是否会导致皮质醇和α-淀粉酶水平的差异。配对样本t检验结果显示，访问场所A（自然环境）后，唾液皮质醇水平显著下降[t31 = 3.26,

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讨论

本研究旨在通过生物物理和心理测量工具，识别在不同自然程度的三种环境中进行休闲访问后，压力水平可能发生的改变。已有研究表明，皮质醇和α-淀粉酶是心理压力水平的可靠指标。本研究中描述的淀粉酶检测方法已调整为96孔板格式。当唾液中淀粉酶水平较高时，吸光度会迅速发生变化。因此，必须限制单次分析的样本数量，因为每次可分析的样本数量受限于向每个孔中加入2.5 µL样本的速度。在本研究中，每次仅测量一列（八个反应）的淀粉酶水平。应激反应涉及两个主要系统：下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴（HPA）和交感-肾上腺髓质系统（SAM）。Kirschbaum和Hellhammer14报道，唾液皮质醇浓度与血清皮质醇水平密切相关，且避免了与采血技术相关的过度应激问题。α-淀粉酶是一种主要的唾液酶，通常与交感神经（SAM）刺激相关15，并被认为是评估SAM系统的有效测量工具16。

尽管生物物理和心理测量方法在检测应激水平变化方面均有效，但本研究中存在若干问题。首先，皮质醇与...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究部分通过印第安纳大学布卢明顿分校公共卫生学院资助的教师研究资助计划（Faculty Research Grant Program, FRGP）提供资金支持。作者谨此感谢Alison Voight博士和Melissa Page在编辑工作和建设性意见方面的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
皮质醇酶免疫检测试剂盒DetectXK003-H1皮质醇酶免疫检测试剂盒用于定量检测干燥粪便提取物、唾液、尿液、血清、血浆及培养基样本中的皮质醇含量。
低温储存用冷冻标签Fisherbrand5-910-A独特胶粘剂可耐受极端温度
液体淀粉酶（CNPG3）试剂套装Pointe ScientificA7564用于定量动力学测定人血清中α-淀粉酶活性。
带外螺纹盖的2 mL圆底聚丙烯管Greiner Bio-One07-000-2572.0 ml U型底Cryo.s自立式聚丙烯灭菌管
Synergy多功能微孔板读板仪BioTek该仪器为单通道吸光度、荧光和发光微孔板读板仪，采用双光学系统设计，可对微孔板格式中的样品进行检测。

参考文献

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