幼年太平洋七鳃鳗和美洲鳗鲡植入新型微型声学标签

摘要

本文阐述了在幼年太平洋八目鳗和美洲鳗鲡体内植入微型声学标记的步骤。我们的应用基于实验室试验，结果表明，声学标记可成功植入，且对游泳能力或存活率无明显影响，标记脱落率极低。

摘要

实验中使用幼年太平洋八目鳗和美洲鳗鱼进行实验室评估，以确定标签植入可能产生的影响。遥测技术被认为是一种能够比其他已知技术在更广泛的空间尺度上获取有关生物移动和行为更详细信息的方法。本方法的目的是为八目鳗和鳗鱼的标签植入提供详细的分步操作说明。在针对活跃迁徙的幼年太平洋八目鳗（120–160 mm）的实验室研究中，我们发现植入标签的存在并未改变标记个体与未标记个体之间的游泳能力，且标签脱落率极低（<3%）。在黄化期美洲鳗鱼（113–175 mm）的实验室测试中也获得了类似结果。在为期38天的饲养期间未发生任何死亡，标签脱落率极低（3.8%）。与未标记的对照组相比，标签的存在对鳗鱼的游泳能力或存活率均无显著影响，且标签脱落极少。

引言

了解鱼类在可能阻碍其上行或下行洄游路线的河流设施（如水电站大坝）附近的活动行为和移动模式，是当前持续存在的研究需求。尽管已有大量研究利用现有技术开展，但关于幼鳗和幼年七鳃鳗的存活率及行为特征，仍存在诸多未解问题。为帮助解答这些问题，美国西北太平洋国家实验室（Pacific Northwest National Laboratory, PNNL）开发出一种新型声学微型发射器，专为幼鳗和幼年七鳃鳗设计，称为七鳃鳗/鳗鱼标记（lamprey/eel tag¹）。在此之前，现有的声学标记体积过大，无法有效植入幼鳗和幼年七鳃鳗的体腔内，且会导致标记负荷超过公认标准（标记重量与鱼体重量之比的保守值应为2%或更低，其他文献建议为4–5%）^2,3,4。该七鳃鳗/鳗鱼标记以416.7 kHz的频率发射独特的编码信号，可通过固定设施或河床部署的自主接收器（水听器）进行监测^5,6。

在美国哥伦比亚河流域，由于过去40年中太平洋 Lamprey（Entosphenus tridentatus）种群数量显著下降，人们对了解其整个生命周期的意识和关注日益增强⁷。水电设施的建设和运行可能对幼体 Lamprey 产生不利影响，因为其种群衰退发生在大规模水电开发之后⁸。幼体太平洋 Lamprey 在向海洋迁徙过程中通过水坝可能是导致死亡的一个潜在原因⁹。被动集成应答器（Passive Integrated Transponders, PIT）常用于监测可能通过分流结构（例如幼鱼旁通系统）的迁徙鱼类，从而实现对标记个体的计数^10,11。然而，幼体 Lamprey 被认为在水体中的迁徙深度大于幼鲑，因此通过幼鱼旁通系统的可能性较小¹²。由于检测概率较低，且缺乏可用于 PIT 标记的孵化场或其他集中的幼体 Lamprey 来源，目前关于幼体 Lamprey 的过坝情况、存活率或行为的信息极为有限。了解幼体太平洋 Lamprey 的行为和存活情况，对于制定下游过坝的缓解策略至关重要，包括为水电设施和灌溉分流结构设计旁通系统¹³。

美洲鳗鲡（Anguilla rostrata）为降河性洄游鱼类，成鱼阶段会从淡水迁徙至海洋中繁殖。过去几十年来，其种群数量出现了显著下降。此前，它们在所有流入大西洋的主要河流以及经由圣劳伦斯河上游至安大略湖的水域中均十分丰富；但自1980年以来，美洲鳗鲡的种群丰度大幅减少，降幅从切萨皮克湾的50%到安大略湖高达97%不等^14,15,16。导致其数量下降的因素包括：水电站大坝的建设、栖息地的破碎化与丧失，以及商业捕捞¹⁷。目前，该物种已被列入加拿大安大略省《濒危物种法》的濒危物种名录。过去在美国东部各州主要河流上建设的水电设施，构成了阻碍幼体和成体洄游的障碍。

本研究使用了新开发的七鳃鳗/鳗鱼声学标记。这些标记在PNNL认证的生物声学实验室制造。 & 流动实验室¹⁸标签尺寸为12 mm长×2 mm直径，空气中重量为0.08 g。由于标签整体尺寸较小，仅需微小切口即可通过无缝合切口方式有效植入鳗形或幼鱼体内，<3毫米长）。无缝合切口的其他优势包括：缩短手术过程所需时间、加快愈合速度，以及降低植入部位感染的可能性。¹⁹手术植入效果可能因物种、生命阶段、体腔长度、切口位置、研究持续时间及环境条件的不同而有所差异^20,21,22,23除了尺寸外，重量也是一个重要变量，因为它可以衡量标记物负担（即标记物重量相对于鱼类体重的比例）。标记物负担与其他所有手术过程因素（如麻醉、操作、手术）相结合，可能直接影响标记保留率、存活率、生长、游泳表现或鱼类躲避捕食的能力。^24,25,26,27.

方案

美国西北太平洋国家实验室（PNNL）已获得实验动物照护与使用协会评估与认证协会的认证。鳗鱼和七鳃鳗的处理遵循联邦政府关于实验动物照护与使用的指南，本研究的实验方案均符合并经PNNL机构动物照护与使用委员会批准。

1. 标签准备（耗时22分钟）

1. 将标签放入70%乙醇溶液中20分钟。
2. 使用塑料镊子取出标签，并置于含有无菌水的小型玻璃皿中。
3. 取出标签，放置于无菌药杯上。

2. 配制麻醉溶液（耗时约5分钟）

1. 在小型塑料杯中称取 40 g 三卡因（Tricaine）。
2. 将粉末溶于烧杯中的自来水，烧杯置于搅拌器上并放入搅拌子，定容至 500 mL，然后转移至塑料瓶中，配制成 80 g/L 的储备液。
3. 采用相同方法配制碳酸氢钠溶液，并加入另一个 500 mL 塑料瓶中。
4. 取一个 10 L 的塑料桶，加入 5 L 水（水源应与待标记的鱼类所处水源相同）。
5. 使用固定在 500 mL 瓶顶部的量取倾倒刻度装置，向桶中加入 6.25 mL 三卡因麻醉液和 6.25 mL 碳酸氢钠溶液，使桶中终浓度达到 100 mg/L。
6. 搅拌使溶液充分混匀。
   注意：准备一个盖子以覆盖桶口，确保七鳃鳗在麻醉溶液中时不会逃逸。

3. 七鳃鳗标记（耗时约6分钟）

1. 使用小抄网将幼年七鳃鳗（>140 mm）放入麻醉浴中。
2. 等待4-5分钟，直至七鳃鳗完全失去活动能力（在溶液中不再游动，但仍保持缓慢而稳定的鳃部运动）。
3. 用抄网取出七鳃鳗，测量其体长和体重，并记录声学标记标签的唯一识别代码。
4. 准备一块厚度为1.3 cm的闭孔泡沫垫，先用水充分浸湿，然后涂上150 µL/L的保护涂层（见材料表）。该保护涂层有助于减轻手术过程中对黏膜的损伤。
5. 将七鳃鳗腹面朝上放置在准备好的泡沫垫上。在手术过程中，将一段连接有调节水流装置（来自高位水箱）的软管置于其口部区域，以维持呼吸，确保七鳃鳗在植入标记期间能够正常呼吸。
6. 确定切口位置，位于左侧或右侧鳃孔后约20 mm处。可使用带刻度的尺子，或在泡沫垫上做标记作为参考。
7. 使用无菌的3.0 mm显微外科手术刀（带15°刀片，见材料表），小心地横向切开2.5–3 mm的切口，确保刀片仅切穿内层皮肤壁。参见图1。
8. 用手将已消毒的标记标签从前部方向植入体腔内。对植入部位施加轻微压力，以确保标记已完全进入体腔。
9. 将已标记的七鳃鳗放入恢复桶中，桶内盛有新鲜河水，并配备鱼缸氧气泵、软管和气石以供供氧。
10. 确认七鳃鳗已从麻醉状态中恢复后，将其转移至暂养水箱，以备后续研究使用。

4. 鳗鱼标记（操作时间约6分钟）

1. 重复标签制备，并配制麻醉剂，三卡因（Tricaine）和碳酸氢钠的浓度剂量均为 240 mg/L。
2. 将每种溶液各 15 mL 加入 5 L 水浴中。
3. 使用小型抄网将幼鳗（>130 mm）放入麻醉浴中。等待 4–5 分钟，直至鳗鱼完全失去活动能力（在溶液中不再游动，但仍保持缓慢而稳定的鳃部运动）。
4. 用抄网将鳗鱼取出，腹面朝上放置在涂有 Fish Protector 的闭孔泡沫垫上。
5. 确定切口位置，位于左侧或右侧胸鳍基部约 25 mm 处的体侧。
6. 使用无菌的 3.0 mm 显微外科手术刀片（15° 刀刃），小心地横向切开 2.5–3 mm 的切口，确保刀片仅切穿内层皮肤壁。参见 图 2。
7. 用手将已消毒的标签从前部插入体腔。对标签植入部位施加轻微压力，以确保标签已进入体腔。
8. 将已标记的鳗鱼放入恢复桶中，桶内盛有新鲜河水，并配备鱼缸供氧泵、管路和气石。
9. 确认鳗鱼已从麻醉状态恢复后，转移至暂养池，以供后续研究使用。

结果

幼体七鳃鳗实验室研究

2015年在PNNL开展了一项研究，旨在评估将假体七鳃鳗/鳗鱼标签植入正在迁徙的幼年太平洋七鳃鳗体内的可行性。共195尾处于大眼期的太平洋七鳃鳗从野外采集点被运送至PNNL。研究分为两个部分：第一部分旨在确定鱼类对标签植入的反应，检测指标包括标签脱落率、延迟死亡率以及标记组与未标记（对照）组鱼类的愈合情况；第二部分则对来自10 mm体长组别（120–160 mm）的标记与未标记鱼类进行游泳能力测试，以评估其游泳能力是否受到不利影响。实验鱼类体重范围为1.8至7.0 g，标签负载率介于1.25%至4.8%之间。图中展示了一张X光片，显示标签在体腔内的位置 图3¹共有两条鱼在暂养的前两天内脱落了标记标签，在随后的28天暂养期内未发现其他标签脱落。在此期间，标记鳗鲡的累计死亡率为14.3%（7条鱼），对照组为9.6%（5条鱼）。将单条标记鳗鲡和对照组鳗鲡分别放入游泳室，在恒定水流速度11 cm/s下进行游泳。该流速是根据先前的实验室测试结果选定的，该测试表明该流速处于持续游泳能力范围的较低端，可维持稳定的游泳运动。⁹对照组的平均游泳时间为 3.15 min（SE = 42.5 s），植入组的平均游泳时间为 2.3 min（SE = 30.2 s），差异无统计学意义（t = 0.958; p = 0.172）。游泳性能测试的结果显示，无论是在标记组还是对照组中，鱼体长度与游泳持续时间（即撞击时间）之间均无显著相关性（图4)。撞击被定义为鱼类无法继续在恒定水流速度下游泳，并停留在下游筛网处。

美洲鳗鲡实验室研究

为了确定标记物对鳗鱼游泳性能可能产生的影响，我们使用假标记物（尺寸为11.4 mm × 1.8 mm（长度×直径））对未标记和已标记的鳗鱼共六个体型组（n = 120；113–175 mm）进行了临界游泳速度（U_crit，反映持续游泳能力的指标）测试¹。在以cm/s为单位测得的U_crit值方面，标记组与未标记组之间无显著差异（图5）；将所有标记组和未标记组合并后，以体长/s为单位的中位数值也无显著差异（图6）。我们还对已标记鳗鱼进行了长期饲养观察（38天），结果显示标记组无个体死亡，且标记脱落率仅为3.8%（26尾鱼中1尾）¹。根据实验室结果，我们得出结论：微型声学标记可有效植入幼年美洲鳗鱼体内，对其游泳能力无显著影响，长期存活率良好，且在标记有效寿命期间（30天）标记脱落率极低。

图1。 幼年太平洋八目鳗标记操作流程图。（A） 将八目鳗置于泡沫垫上。（B） 使用显微外科刀片进行切口。（C） 植入标记物。（D） 标记完成后的八目鳗。所有照片均拍摄自同一条八目鳗（体长148 mm）。

图 2。 幼年美洲鳗标记手术过程示意图。（A） 切口前状态。（B） 切口后状态。（C） 标签前部插入后状态。所有照片均拍摄自同一条鳗鱼（138 mm）。

图3．幼年太平洋七鳃鳗体腔内假体七鳃鳗/鳗鱼标签的X光图像。

图 4．对照组（未标记）和标记七鳃鳗游泳性能测试中的撞击率，按10 mm体长区间分组，并标注正向标准误差条。 样本量列于各柱状图中。

图5． 标记组与未标记鳗鱼（每组10尾）按体长分组的临界游泳速度（cm/s）箱线图。 每个箱体内的线条表示中位数；顶部和底部线条分别表示第75和第25百分位数；须线表示第90和第10百分位数；离群值以封闭圆圈表示。

图6． 标记组与未标记鳗鱼（每组10条）的临界游泳速度（体长/秒）箱线图。 每个箱体内的线条表示中位数；顶部和底部线条分别表示第75和第25百分位数；须线表示第90和第10百分位数；异常值以封闭圆圈表示。

讨论

实验室研究结果表明，标记操作及标记本身对鱼类的存活率或游泳能力均无不良影响。长期饲养和监测显示，标记脱落极少发生，且在标记有效期内（30天）不明显。标记植入操作能够有效地将标记置入体腔，且不会在标记部位引起明显出血或真菌感染。整个标记过程耗时较短（<6分钟），有助于减少鱼类因麻醉所承受的应激反应。这些发现表明，该技术是一种适用于幼体七鳃鳗和鳗鲡洄游研究的新型工具，可在今后的研究中加以应用。该技术将使研究人员能够追踪七鳃鳗和鳗鲡在河流系统中的活动，以及它们在接近水电站或其他阻碍鱼类通过的结构时的行为。由此获得的结果可为相关设施的管理决策提供更科学的依据，从而有助于保护这些物种在其幼体阶段的生存。标记植入操作中最关键的步骤包括：使用适当剂量的麻醉剂、控制切口的深度和长度、正确放置标记，以及配备合适的术后恢复饲养容器。该技术的局限性较小，最主要的是需要经过培训的手术人员，以准确完成<3 mm的切口并将标记放置于目标位置。此外，由于标记负荷的限制，体型较小的鳗鲡和七鳃鳗（<140 mm）不适合进行该标记操作。我们不建议对所述操作流程进行任何修改。

标记鳗鱼和七鳃鳗的其他方法包括使用 PIT 标签。然而，PIT 标签不能主动发射信号，因此只有当携带 PIT 标签的鱼类被引导进入旁通道设施，或经过固定探测器附近时，才能被计数^10,11。七鳃鳗/鳗鱼标签未来的应用包括能够在这些物种栖息的任何环境中对迁徙的七鳃鳗和鳗鱼种群进行标记和追踪。使用七鳃鳗/鳗鱼标签的其他优势还包括能够估算鱼类在溢洪道或水轮机处的存活率、回落率、在水库内的迁移时间、通过水坝时的滞留延迟以及相关行为。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 L 塑料桶	N/A	N/A
19 L 提桶	N/A	N/A
3.00 mm 手术刀	Beaver-Vistec	377513
500 ml 瓶子	Nalgene	2089-0016
Adam 天平	Certified Material Testing Products	BCL-LBK12A
气泵	Amazon	N/A
气石	Pentair	ALS3
网眼为 3/32 英寸的抄网	N/A	N/A
乙醇（70%）	Sigma-Aldrich	24102
鱼体保护剂	Kordon LLC	31456
泡沫垫	N/A	N/A
手套	Kimberly Clark	N/A
搅拌棒	Sigma-Aldrich	F37110-1128
塑料镊子	N/A	N/A
倾倒式分液漏斗刻度管	Fischer Scientific	13-683-60C
手术刀柄	Beaver-Vistec	371360
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761
磁力搅拌器	Corning, PC-351	N/A
三卡因甲磺酸盐（MS-222）	Western Chemical Inc.	515388	用于食用的鱼类在使用前，必须在高于 10°C（50°F）的清水中饲养 21 天
6 mm 管路	N/A	N/A