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体外肿瘤细胞再攻击用于预测性评估嵌合抗原受体T细胞的抗肿瘤功能

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DOI：

10.3791/59275

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2019年2月27日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology & Hematopoietic Cell Transplantation, T Cell Therapeutics Research Laboratory, City of Hope Beckman Research Institute and Medical Center, 2Irell and Manella Graduate School of Biological Sciences, City of Hope Beckman Research Institute and Medical Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种体外共培养方法，用于反复刺激靶向肿瘤的T细胞，从而实现对T细胞抗肿瘤活性的表型和功能分析。

摘要

嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗领域正在快速发展，CAR设计、基因工程方法和生产工艺优化不断取得进步。然而，这些研发工作面临的一个挑战是建立可靠的体外检测方法，以有效筛选出在体内具有最佳治疗效果的CAR T细胞产品。传统的体外肿瘤细胞裂解实验由于共培养时间较短以及T细胞与肿瘤细胞比例较高，往往无法真实反映CAR T细胞的抗肿瘤潜力。本文介绍一种在高肿瘤细胞负荷条件下评估CAR T细胞重复杀伤能力的体外共培养方法。该方法通过在7天内持续观察CAR T细胞的长期细胞毒性和增殖能力，并每隔一天向共培养体系中补充新的肿瘤靶细胞。该检测可结合T细胞活化、耗竭及记忆表型的分析。利用该方法，我们成功区分了CD4+与CD8+ CAR T细胞在针对胶质母细胞瘤（GBM）细胞时的功能和表型差异，这些差异与其在原位异种移植模型中的体内抗肿瘤活性差异相一致。该方法为评估CAR T细胞效力以及阐明不同CAR T细胞产品之间的功能差异提供了一种简便有效的手段。

引言

利用嵌合抗原受体（CAR）工程化T细胞进行免疫治疗在对抗B细胞恶性肿瘤方面已显示出良好的疗效1,2,3,4，而针对其他肿瘤的应用潜力仍在深入研究中5,6,7。目前在优化CAR结构、制备工艺以及患者输注前治疗方案方面已取得显著进展6,7,8，新型合成生物学方法有望进一步提高CAR T细胞的持久性、安全性和肿瘤特异性9,10。然而，准确评估CAR T细胞的治疗潜力以指导最佳临床转化方案仍面临困难且耗时耗力。迄今为止，评估CAR T细胞功能最成熟的方法是在携带人源肿瘤异种移植的免疫缺陷小鼠模型中进行，通过检测CAR T细胞的抗肿瘤效果，并在不同细胞剂量下进行比较11,12,13,14,15。这类体内小鼠实验工作量大、耗时长，尤其在需要筛选大量参数时更为明显。此外，体内实验还可能受到小鼠品系获取、动物饲养设施及动物操作技术的限制。因此，亟需建立更为便捷的体外检测方法，以快速读取效应活性，同时又能真实反映这些T细胞在体内的抗肿瘤功能。

传统的体外检测T细胞毒性的方法主要集中在脱颗粒、细胞因子产生以及裂解放射性同位素标记靶细胞的能力（例如铬释放实验）的检测。尽管这些实验对于定义CAR T细胞的特异性和重定向靶标识别具有重要信息价值，但它们往往无法反映工程化T细胞在体内的抗肿瘤潜力12,13,16。在某些情况下，短期体外杀伤实验的结果甚至与体内抗肿瘤功能呈负相关16。这种不一致很可能是由于这些体外实验中使用了较高的效应细胞与靶细胞（E:T）比例，因而无法区分那些易于发生耗竭的CAR T细胞产品17。相比之下，在体内肿瘤清除过程中，T细胞通常需要应对较大的肿瘤负荷，因而需经历多轮杀伤，进而驱动T细胞的分化和耗竭18,19,20，而T细胞耗竭是CAR T细胞有效清除肿瘤的主要障碍之一12,13。同时，大多数短期体外杀伤实验也无法检测T细胞增殖能力的差异，而在接受CAR T细胞治疗的患者中，CAR T细胞的扩增能力与临床应答密切相关4。因此，理想的体外实验应能模拟高肿瘤负荷的条件，诱导T细胞耗竭，并能够检测T细胞的扩增情况。

本文介绍了一种通过简单的体外共培养实验评估CAR T细胞重复杀伤肿瘤潜能的策略。该方法可同时检测多种T细胞效应功能参数，包括靶细胞杀伤、CAR T细胞扩增以及与记忆性或耗竭相关的表型。该实验所得结果与CAR T细胞在体内的抗肿瘤效应具有良好相关性，可用于评估CAR T细胞产品的效力。尽管本文描述的是针对IL13Ra2的CAR T细胞杀伤原代胶质母细胞瘤（GBM）细胞系的实验方法21，但该方案可轻松适用于任何CAR T细胞平台。

方案

我们的机构审查委员会（IRB）不要求对此方案进行审查。我们接收来自希望城病理学部门的废弃新鲜胶质母细胞瘤肿瘤样本，这些样本经过编码，我们的实验室无法获取解码信息。我们接收的标本仅附有活检/切除时的既往治疗情况和疾病状态数据，不包含任何可识别个人信息。

1. 培养基制备

  1. 准备用于培养原代胶质母细胞瘤（GBM）细胞系的神经干细胞培养基：DMEM:F12，1:50 B27，5 µg/mL 肝素，2 mmol/L L-谷氨酰胺；每周两次补充 20 ng/mL 表皮生长因子（EGF）和 20 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子（FGF）（参见材料表）。
  2. 准备T细胞培养基：含10%胎牛血清（FCS）的X-VIVO 15培养基；每48小时补充70 IU/mL重组人IL-2（rhIL-2）和0.5 ng/mL重组人IL-15（rhIL-15）（参见材料表）。
  3. 准备共培养培养基：取不含EGF和FGF补充物的神经干细胞培养基，加入10% FCS。
  4. 准备流式细胞术染色溶液（FSS）：HBSS，2% FCS，NaN3（0.5 g/500 mL）。

2. 胶质母细胞瘤肿瘤细胞的制备

  1. 通过在300 × g 条件下离心4分钟收集低代次胶质母细胞瘤肿瘤球（TSs），弃去上清液。
    注意：胶质母细胞瘤肿瘤球（TSs）由切除的肿瘤组织按先前所述方法制备22,23,24，并在37 °C、5% CO2 的培养箱中，使用神经干细胞培养基进行维持培养。
  2. 将共培养基置于37 °C水浴中预热。
  3. 向胶质母细胞瘤肿瘤球（TSs）中加入1 mL冷的Accutase溶液，通过吹打30–60秒使肿瘤球解离，随后加入5 mL预热的共培养基终止消化。
    注意：胶质母细胞瘤肿瘤球（TSs）在Accutase中的处理时间不应超过5分钟。
  4. 在300 × g 条件下离心4分钟收集胶质母细胞瘤细胞，弃去上清液，并将细胞重悬于2 mL共培养基中。
  5. 使用细胞活力计数仪测定细胞浓度。
    注意：细胞活力必须>70%。

3. CAR T 细胞的制备

  1. 在检测前不到24小时，取100 µL培养的CAR T细胞加入流式管中，并加入2 mL FSS。
    注意： CAR T细胞按先前所述方法制备11,21，并在T细胞培养基中培养。
  2. 以300 × g 离心4分钟，弃上清液。
  3. 加入2 mL FSS洗涤细胞，以300 × g 离心4分钟，弃上清液。
  4. 在4 °C条件下，使用适当的抗体对细胞染色30分钟，以检测CAR表达。
    注意： 例如，若使用先前描述的靶向IL13Rα2的CAR25，则使用抗IL13抗体进行染色。
  5. 用2 mL FSS洗涤两次，然后使用流式细胞仪分析CAR表达情况。
  6. 根据图1B所示的设门策略确定T细胞上的CAR%。
  7. 共培养当天，以300 × g 离心4分钟收集全部CAR T细胞，弃上清液，并将细胞重悬于2 mL共培养培养基中。
  8. 使用细胞活力计数仪测定细胞浓度。
    注意： 细胞活力必须>70%。

4. 建立肿瘤细胞与T细胞共培养体系

  1. 用共培养培养基将肿瘤细胞稀释至浓度为 0.16 百万/mL。
  2. 根据 CAR%，用共培养培养基将 CAR T 细胞稀释至 CAR+ 细胞浓度为 0.04 百万/mL。
    注意：例如，若 CAR 表达率为 50%，T 细胞浓度为 0.4 百万/mL，则需进行 1:5 稀释，以获得最终浓度为 0.04 百万 CAR+ 细胞/mL。
  3. 将 100 µL 稀释后的肿瘤细胞加入 96 孔平底组织培养板的每孔中。
  4. 将 100 µL 稀释后的 CAR T 细胞加入含有肿瘤细胞的各孔中，并充分混匀。
    注意：每组肿瘤细胞-T 细胞共培养需在 4 个时间点进行分析。每个时间点可能需要 4–6 个重复，具体取决于不同的分析方法，但不建议每个时间点少于 <3 个重复；代表性板图请见 表 1。
  5. 将培养板置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养。

5. 肿瘤细胞再攻击

注意：再次刺激在初次共培养建立后的第2、4和6天进行（图1A）。

  1. 按照上述方法（步骤 2.1-2.6）收获并解离胶质母细胞瘤肿瘤球（GBM TSs）。
  2. 将胶质母细胞瘤细胞重悬于浓度为 0.64 百万/mL 的培养基中。
  3. 确定需要再次刺激的共培养孔（见表 1），并小心从每孔上清中移除 50 µL 培养基。
  4. 向每孔中加入 50 µL 胶质母细胞瘤细胞悬液，充分混匀后，将培养板放回 37 °C、5% CO2 的培养箱中继续培养。

6. 收集样品并进行流式细胞术分析

注意：样品将在初次共培养建立后的第1、3、5和7天采集，分别对应1、2、3和4轮肿瘤刺激。

  1. 将0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液置于37 °C水浴中预热。
  2. 确定需要收获的孔，并将培养基转移至新的圆底96孔板中。
  3. 向孔中加入50 µL胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C下消化残留的肿瘤细胞5分钟。
  4. 在显微镜下确认细胞已从孔底脱落。
  5. 用移液器吹打孔底使脱落的细胞重悬，然后将含有脱落细胞的胰蛋白酶-EDTA溶液转移至圆底96孔板中对应的孔。
  6. 将圆底96孔板在300 x g、4 °C条件下离心4分钟，弃去上清液。
  7. 每孔加入200 µL FSS洗涤细胞，在300 x g、4 °C条件下离心4分钟，弃去上清液。
  8. 用含抗体（见材料表）的100 µL/孔FSS重悬细胞，在4 °C避光孵育30分钟进行染色。
  9. 每孔加入100 µL FSS，于300 x g、4 °C离心4分钟，弃去上清液。
  10. 每孔加入200 µL FSS洗涤细胞，在300 x g、4 °C条件下离心4分钟，弃去上清液。
  11. 用含500 ng/mL DAPI的100–200 µL/孔FSS重悬细胞，随后通过流式细胞术分析样品。

7. CAR T 细胞的功能与表型分析

  1. 从流式细胞仪中获取数据文件，并圈选所有活细胞（DAPI-）（图1C）。
  2. 通过圈选 CD45- 群体来定量肿瘤细胞，通过圈选 CD45+、CAR+ 群体来定量CAR T细胞（图1C）。
    注意：如果肿瘤细胞表达 CD45（例如 Raji 淋巴瘤细胞），可使用抗 CD3 染色来区分T细胞与肿瘤细胞。
  3. 绘制随时间变化的肿瘤细胞和CAR T细胞数量曲线。
  4. 通过 4-1BB 和 CD69 的共表达来鉴定T细胞的活化状态。
    注意：这些表面标志物可用于初始共培养后6–24小时分析T细胞活化情况。
  5. 通过 PD-1、LAG-3 和 TIM-3 的表达来鉴定T细胞耗竭状态。
  6. 通过 CD45RO 和 CD62L 的表达来鉴定T细胞记忆状态。

结果

利用上述检测方法，我们区分了CD4+和CD8+ CAR T细胞介导的不同效应强度和杀伤动力学。本文展示的结果揭示了来自健康供体的CD4+和CD8+ CAR T细胞之间的差异，这些细胞的制备独立于我们此前的发表21。

通过标准的脱颗粒实验，我们观察到CD4+ 和 CD8+ CAR T细胞对表达靶向抗原的GBM细胞表现出同等水平的激活，这通过CD107a的表达及细胞内细胞因子的产生得以证实。图2A）。然而，通过重复性肿瘤挑战实验，我们发现 CD4+ 但非 CD8+ CAR T细胞表现出多轮杀伤能力（图2B）。CD4+ CAR T 细胞在此项检测中也表现出优于 CD8+ 细胞的扩增能力（图2C). 在经过两轮肿瘤攻击（1:12 E:T）后，从第3天（D3）开始观察到CAR T细胞亚群在扩增上的差异；而在经过三轮肿瘤攻击（1:20 E:T）后，从第5天（D5）开始观察到细胞毒性的差异，表明短期检测无法揭示不同CAR T细胞产品在效力上的差别。当使用1:1混合的CD4+ 和 CD8+ CAR T细胞被应用于该实验，结果发现其性能优于CD8+ 但不包括 CD4+ CAR T细胞在长期细胞毒性中的作用（图2B). CD8的扩增+ CAR T细胞通过共施加的CD4诱导+ 细胞，而CD4+ CD8存在时，CAR T细胞的扩增受到抑制+ 细胞（图2C).

解释区分CD4效应活性的机制+ 和 CD8+ CAR T细胞，我们首先确认在初次共培养24小时后，CD4和CD8双阳性细胞均存在+ 和 CD8+ CAR T细胞的活化程度相当（图3A）。同时，根据CD45RO和CD62L的表达情况，两种CD4+ 和 CD8+ CAR T细胞表现出从中央记忆型（CD45RO+CD62L+) 到效应记忆（CD45RO+CD62L-）表型在重复肿瘤攻击期间的表现（图3B。随后，我们在该实验的第3天（D3）对细胞进行了表征，此时间点早于CAR T细胞亚群开始显现功能差异的阶段。T细胞耗竭以抑制性受体PD-1、LAG-3和TIM-3的共表达为标志15,21，这表明 CD8+ CAR T细胞与CD4相比更容易发生耗竭+ CAR T细胞（图3C。此外，CD8上未观察到差异+ CAR T细胞在联合应用/不联合应用CD4情况下的耗竭+ 细胞（图3C），表明CD4诱导的CD8+ CAR T细胞扩增与更强的效应功能无关。

综合本实验结果可知，CD4+ CAR T 细胞在长期细胞毒性方面显著优于 CD8+ 细胞。尽管在短期细胞毒性（重新攻击后1–3天）方面两者表现相似，但CD4+ CAR T 细胞在反复肿瘤攻击下仍能维持效应功能，而CD8+ 细胞则出现耗竭，无法控制肿瘤细胞的生长。当两种亚群混合时，CD4+ CAR T 细胞可促进CD8+ CAR T 细胞的扩增，但未能改善CD8+ 细胞的耗竭状态，因此两组之间未产生协同效应。如先前研究所述21，在体内模型中也观察到CD4+ 与CD8+ CAR T 细胞之间类似的差异。事实上，CD8+ CAR T 细胞能够介导短期肿瘤清除，但随后出现抗原阳性复发；相比之下，CD4+ CAR T 细胞治疗可实现长期肿瘤根除21，这与其在体外反复攻击实验中表现出的重复杀伤潜能相一致。

CAR T细胞共培养时间线、流式细胞术图示、细胞活力图、肿瘤分析。
图1：重复挑战实验的示意图与分析策略。（A）重复肿瘤挑战实验的示意图与时间线。每个孔中，CAR T细胞首先与PBT030-2 GBM细胞共培养（4,000个CAR+细胞，16,000个肿瘤细胞），之后每隔一天（第2、4、6天）重新加入32,000个肿瘤细胞进行再挑战。在第1、3、5、7天对肿瘤细胞和CAR T细胞数量以及CAR T细胞表型进行分析。（B）在建立共培养前，用于确定T细胞中CAR%的设门策略。（C）来自重复挑战实验中活细胞、肿瘤细胞和CAR T细胞的设门策略。（D）与未转导T细胞共培养时，重复挑战实验不同时间点的肿瘤细胞数量。误差棒 = ±标准误。请点击此处查看该图的放大版本。

CD4+ CD8+ 免疫反应分析；流式细胞术和增殖图；CD107a、IFN-γ 表达。
图 2：重复攻击实验揭示 CD4+ 与 CD8+ CAR T 细胞在杀伤能力和增殖效力上的差异。（A）CD4+ 和 CD8+ CAR T 细胞与胶质母细胞瘤（GBM）细胞共培养 5 小时后（效靶比 E:T=1:1）的脱颗粒及细胞内细胞因子染色结果。（B）将 CD4+、CD8+ 或混合型（CD4:CD8=1:1）CAR T 细胞用于重复攻击实验，并定量检测存活的肿瘤细胞。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，与 CD4+ 组比较，采用单因素方差分析结合 Bonferroni 多重比较检验。（C）重复肿瘤攻击实验过程中 CD4+ 和 CD8+ CAR T 细胞的扩增情况。比较内容从左至右依次为：CD4+ 与 CD8+ 单一亚群；“混合”组内的 CD4+ 与 CD8+；CD4+ 单一亚群与混合组；CD8+ 单一亚群与混合组。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，采用非配对 Student's t 检验。误差棒表示 ± 标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。

CD4+/CD8+ CAR T细胞的流式细胞术数据分析；CD69、CD62L、CD45RO、LAG3、TIM3、PD1的表达。
图3：重复刺激实验中T细胞表型的分析。（A）实验第1天（D1）CAR T细胞上4-1BB和CD69的染色情况。（B）CAR T细胞在进入再刺激实验前（输入样本）、实验第3天（D3）和第7天（D7）的CD45RO和CD62L染色情况。（C）实验第3天（D3）CAR T细胞上PD-1、LAG-3和TIM-3的共表达情况。（上图）用于鉴定表达1种、2种或3种抑制性受体的T细胞的设门策略。（下图）CD4+细胞（单一亚群）、CD8+细胞（单一亚群）以及CD8+细胞（“混合”组内）之间的比较。请点击此处查看该图的放大版本。

CD4+ CD8+ CAR-T细胞实验时间表，无再刺激组与不同再刺激天数组，分析网格。
表1：再刺激实验设置的代表性孔板布局图。

讨论

这种重复性肿瘤细胞攻击实验提供了一种便捷的方法，用于评估CAR T细胞的功能效力，其体外实验体系可模拟体内肿瘤模型中的高肿瘤负荷状态。在为期7天的实验过程中，CAR T细胞经历四轮肿瘤攻击（初始共培养及三次重复再攻击），从而形成一种微环境，使得T细胞可能在初始强烈应答后逐渐耗竭，并丧失对后续肿瘤攻击的响应能力。该实验可获取两个基本的检测指标：肿瘤细胞清除能力和CAR T细胞扩增能力；同时，通过表面或细胞内标志物染色，可方便地分析CAR T细胞的表型特征，以反映T细胞的活化、耗竭和/或记忆状态。该实验体系还便于与CAR T细胞转录组、蛋白质组或磷酸化蛋白质组的非偏倚性分析相结合。21,26以及用于预测临床反应的T细胞多能性27此外，还可检测肿瘤细胞对T细胞免疫的适应性反应，例如细胞因子的分泌情况28由于在多个时间点收集样本，该检测不仅能够对CAR T细胞在应对过量肿瘤细胞时的行为进行静态分析，还能够进行动态分析。

该检测方法在比较靶向相同抗原但设计不同和/或生产工艺不同的CAR T细胞效应效力方面具有显著优势。我们已利用此方法发现，CD4+ CAR T细胞相较于CD8+ T细胞能够介导更优异的长期效应功能21。此外，研究还表明，体内CAR的疗效与此检测过程中较晚时间点（第5至第7天）的细胞毒性相关，进一步凸显了在体外评估CAR T细胞时采用重复性肿瘤攻击的必要性。尽管本实验以胶质母细胞瘤（GBM）细胞作为靶细胞的示例，但该检测方法可轻松适用于其他T细胞-肿瘤组合。值得注意的是，CAR T细胞的行为也会因抗原密度的不同而发生变化，而通过基因工程改造癌细胞以表达不同水平的靶向抗原，为研究CAR识别后发生的级联分子事件提供了有力工具29。因此，该检测还可用于分析特定CAR T细胞针对不同靶标的激活模式。

由于靶细胞活力和CAR T细胞扩增是本实验的两个首要检测指标，因此所有共培养体系必须起始于具有活性（>70%）的肿瘤细胞和T细胞。在进行再刺激操作时，吸取培养基（步骤5.3）的动作不应扰动孔底的肿瘤细胞和T细胞，以避免引入不必要的细胞计数差异。当本实验用于悬浮生长的靶细胞系时，建议在肿瘤细胞再刺激前通过离心收集残留细胞。

该实验的一个局限性在于，实验设置参数（初始共培养和再挑战的效靶比）需要根据不同CAR-肿瘤组合进行调整。例如，如果肿瘤细胞表达较高水平的免疫抑制分子（如PD-L1），则建议采用较高的效靶比，因为与PD-L1低表达的肿瘤细胞相比，总体杀伤效率会受到影响。在将该实验应用于新的CAR-肿瘤组合之前，建议先开展预实验以确定最佳条件，通常应使在实验中测试的最具活性的CAR T细胞在实验终点时能够清除>80%的肿瘤细胞。由于CAR T细胞介导的杀伤作用需要直接的细胞间接触，如果肿瘤细胞经过荧光标记，则流式细胞术分析的荧光通道需相应调整（例如，若肿瘤细胞标记了GFP，则不应使用FITC偶联的抗体）。

CAR T细胞在治疗B细胞恶性肿瘤方面的临床活性已促成两种获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物。然而，不同患者之间的治疗反应存在显著差异27,30,31，这种差异已被证实与CAR产品的表型特性相关30。本体外重复性肿瘤攻击实验提供了一种功能检测CAR效应细胞效力的方法，可作为表型分析和多功能细胞因子分泌检测的补充，并且相较于体内肿瘤模型，能够实现更高通量的临床产品筛选，同时保持较高的预测准确性。总体而言，该实验可用于CAR T细胞设计、临床前及临床开发阶段的T细胞功能检测。

披露

本研究中描述的CAR构建体已授权给Mustang Bio., Inc.，S.J.F.和C.E.B.将因此获得特许权使用费。其余所有作者声明不存在潜在的利益冲突。

致谢

本工作获得了加州再生医学研究所（CIRM）资助项目TR3-05641以及美国国立卫生研究院（NIH）资助项目P30 CA33572（核心设施）的支持。D.W. 获得了美国国家癌症研究所（NCI）F99奖学金1F99CA234923-01的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
不含钙和镁的HBSS中的0.05%胰蛋白酶/0.53 mM EDTA康宁MT25051CI
1 M HepesIrvine Scientific9319
200 mM L-谷氨酰胺Cambrex 生物科学17-605E
4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）—FluoroPure 级InvitrogenD21490
Accutase创新细胞技术AT104
Aldesleukin Proleukin（rhIL-2）诺华肿瘤学NDC 0078-0495-61
抗CD137，PEBD 生物科学5559564B4-1
抗CD19，PE-Cy7BD 生物科学557835SJ25C1
抗CD3，PERCPBD 生物科学340663SK7
抗CD4，FITCBD 生物科学340133SK3
抗CD45，PERCPBD 生物科学3406652D1
抗-CD45RO，PEBD 生物科学561137UCHL1
抗CD62L，APCBD 生物科学559772DREG-56
抗CD69，APCBD 生物科学340560L78
抗CD8，APC-Cy7BD 生物科学348793SK1
抗IL-13，PEBD 生物科学340508JES10-5A2
抗LAG-3，PEeBiosciences12-2239-413DS223H
抗PD-1，APC-Cy7BioLegend329921EH12.2H7
抗TIM-3，APCeBiosciences17-3109-42F38-2E2
B-27 无血清添加剂（50倍浓缩）Invitrogen17504-044
康宁 96 孔透明平底聚苯乙烯 TC 处理微孔板，单独包装，带盖，无菌（产品编号 #3596）康宁生命科学3596
无定型胎牛血清，HI IRHyclone LabsSH30070.03IH
DMEM F-12 50:50 (1x) 不含谷氨酰胺MediaTech, Inc.15-090-CV
DMEM高糖无L-谷氨酰胺，含丙酮酸钠，1 LInvitrogen11960051
DMEM-Ham's F12 50:50 培养基，含 L-谷氨酰胺和 15 mM HEPESFisher ScientificMT10092CV
HBSSIrvine Scientific9224
热灭活胎牛血清HycloneSH30070.03
肝素钠（1,000 U/mL）美国制药401811B
MACSQuantMilteni Biotech Inc.BIS013220 
PBS 1× 含 CA &和 MGIrvine Scientific9236
含1 mM EDTA的PBS（无Ca2+和Mg2+）VWR 科学产品PB15009A
重组人EGFR&D Systems236-EG-200
重组人 FGFR&D Systems233-FB
rhIL-15 工作稀释液（10 ng/µLCellGenix，美国业务部tF0297
叠氮化钠（NaN₃）3)SigmaS8032
Sorvall ST40R赛默飞世尔科技41693700
TC-HEPES缓冲液（1 M）溶液 100 mL IRVINE SCIENTIFIC 公司6472
Tecnol Procedure MaskKimberly-Clark47117
X-VIVO 15LonzaBW04-744Q

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