在 Y-Maze 中集成视觉心理物理分析,以隔离视觉特征在导航决策中扮演的角色

动物不断感知和解释它们的栖息地,在与他人互动和在嘈杂的环境中航行时做出明智的决定。个人可以通过将社会信息纳入其行动来增强其情景意识和决策能力。然而,社会信息主要来源于通过意外的暗示(即避免捕食者的突然操作)的推论,这种暗示可能不可靠,而不是通过进化来传达特定信息的直接信号(例如,摇摆在蜜蜂跳舞)1。确定个人如何快速评估社会线索或任何感官信息的价值,对于调查人员来说可能是一项具有挑战性的任务,尤其是在个人成群结队旅行时。视觉在管理社会互动方面起着重要的作用2,3,4和研究已经推断出鱼学校中可能基于每个人的观点5的相互作用^{网络。 6}.然而,鱼群是动态系统,由于群体成员之间的相互作用所产生的固有的共线性和混淆因素,很难分离个体对特定特征或邻居行为的反应。此协议的目的是通过隔离替代视觉特征如何影响单独旅行或团体内旅行的个人的方向决策来补充当前工作。

当前协议的好处是将操纵实验与计算机可视化技术相结合,以隔离个人在自然界中可能体验的基本视觉特征。具体来说,Y-maze(图1)用于将方向选择折叠到二进制响应,并引入计算机动画图像,旨在模拟虚拟邻居的游泳行为。这些图像从迷宫下方投影,以模仿在一个或多个主体下游泳的共分体的轮廓。这些剪影的视觉特征,如其形态,速度,一致性和游泳行为很容易定制,以测试替代假设7。

本文通过隔离模拟社会鱼类物种"金神"(Notemigonus crysoleucas)对虚拟邻居的相对速度的反应,证明了这种方法的效用。此处的协议焦点是虚拟邻居的方向影响是否随速度而变化,如果是,则量化观察到的关系形式。特别是,定向提示是由有固定比例的轮廓作为领导者,并朝着一个或另一个手臂弹道移动产生。其余轮廓充当干扰者,随机移动以提供背景噪声,可以通过调整引线/干扰器比率来调谐。引线与干扰者的比率可捕获方向提示的一致性,并可相应地进行调整。干扰器剪影仍然局限于决策区域("DA",图1A),通过让轮廓反射出边界。领导者剪影,但是,允许离开DA区域,并进入其指定的手臂,然后慢慢褪色,一旦剪影穿过1/3的手臂的长度。当领导者离开 DA 时,新的领导者剪影将取而代之,并追溯其确切路径,以确保在整个实验过程中,领导者/干扰者比例在 DA 中保持不变。

使用虚拟鱼可以控制视觉感官信息,同时监控主体的方向响应,这可能揭示社交导航、运动或群体决策的新特点。此处使用的方法可应用于广泛的问题,例如亚致命性压力或掠夺对社会互动的影响,方法是操纵计算机动画以产生不同复杂程度的行为模式。

所有实验协议均获得美国马里兰州维克斯堡美国陆军工程师和研究与发展中心环境实验室机构动物护理和使用委员会的批准(IACUC# 2013-3284-01)。

1. 感官迷宫设计

1. 在专用房间的透明支撑平台顶部进行防水聚甲基甲基丙烯酸酯 Y-maze 平台(内部制造)的实验。平台厚1.9厘米,由4根7.62厘米的挤压铝梁支撑,宽1.3米,长1.3米,高0.19米。
2. 构造在施工中相同的持有和决策区域(图1A)。在这里,Y-maze臂长46厘米,宽23厘米,深20厘米,中心决定区直径约46厘米。
3. 在 Y 迷宫底部粘附白色投影影院屏幕,将视觉刺激投射到域中。
4. 用白色乙烯基涂覆 Y 迷宫的两侧,以限制外部视觉刺激。
5. 安装一个遥控的清门(通过透明单丝),将保持区域从中央决策区域分割,在适应后将主体释放到迷宫中。
6. 放置额外的百叶窗,以防止鱼查看灯光、外壳和设备,例如在门框中到达地板的遮光百叶窗,以尽量减少外部房间或走廊的光线影响和阴影移动。

2. 录音设备

1. 根据背景图像、虚拟鱼和主题鱼之间的对比度选择架空摄像机(黑白)。
2. 安装一个架空摄像头,从上面记录迷宫,并记录鱼和视觉投影的行为。
   1. 对于此演示,请使用 b/w 千兆字节以太网 (GigE) 摄像机,这样,在控制室中,使用 1 Gb 以太网卡的 9 m IP 电缆连接到计算机。
3. 将摄像机连接到相邻房间的计算机,观察器可以远程控制门、视觉刺激程序和摄像机录制软件。
4. 确保摄像机设置处于采样率和频率速率,以防止任何闪烁效果,当摄像机和软件与房间灯不相位时,就会发生闪烁效果。
   1. 检查位置的电气频率;偏移摄像机采样率(每秒帧数,fps),通过将交流频率乘以或除以整数来防止闪烁。
5. 设置摄像机设置,以便使用软件和计算机优化图像清晰度以可视化相关行为。
   1. 对于此演示,以 30 fps 的空间分辨率为 1280 像素 x 1024 像素执行采样。

3. 校准照明、投影仪和摄像机设置

1. 沿实验室的墙壁安装四个高架轨道照明系统。
2. 为灯光安装可调节的控制开关,从而在实现正确的室内环境光方面提供更大的灵活性。
3. 放置灯光以避免迷宫上的反射 (图 1B)。
4. 将短抛 (ST) 投影仪固定在迷宫支撑结构的底部边缘(图 1C)。
   1. 选择投影分辨率(此演示设置为 1440 像素 x 900 像素)。
5. 调整由顶灯和投影仪创建的环境光水平,以匹配受试者的外壳中的照明条件(此处设置为演示实验期间的 134 ± 5 lux,这相当于阴天的自然照明)。
   1. 在实验试验期间锁定或标记调光器开关的位置,以便轻松和一致。
6. 使用摄像机查看器程序配置摄像机来控制曝光模式、增益和白平衡控制。
   1. 在本演示中,将 Pylon 查看器设置为"连续拍摄"、8000 μs 曝光时间、0 增益和 96 白平衡,从而控制视频录制。

4. 校准视觉投影程序:背景

1. 将均匀背景投影到迷宫底部,并测量投影机的任何光失真。在这里,背景是使用处理(v.3)创建的,这是一个可处理且记录良好的平台,用于为科学项目创建自定义可视化(https://processing.org/examples/ )。
   1. 创建一个程序,该程序将运行要投影到迷宫底部的处理窗口。自定义窗口的背景颜色使用后台命令完成,该命令接受 RGB 颜色代码。几个小示例程序在"处理教程"(https://processing.org/tutorials/)中找到。
   2. 使用背景颜色程序校准投影仪和外部照明条件。
2. 使用图像处理程序测量投影仪创建的任何光失真,以识别与所创建的预期均质背景的任何偏差。以下步骤适用于使用 ImageJ(v. 1.52h;https://imagej.nih.gov/ij/)
   1. 捕获照明的 Y-maze 的静止帧图像,具有均匀的背景颜色并在 ImageJ 中打开。
   2. 使用直线、分段或徒手线工具从热点中心最亮的位置绘制一条直线垂直线到 Y-maze 的顶部(图 2A)。
   3. 在分析菜单中,选择"打印配置文件"以创建灰度值与距离(以像素为单位)的图形。
   4. 将像素数据另存为逗号分隔文件(.csv 文件扩展名),由索引列和像素值列组成。
3. 将投影区域与迷宫(图2B)对齐,并建模任何不需要的光失真,以减少投影机可能创建的任何颜色失真(图 2C)。下面概述了当前演示中采取的步骤。
   1. 使用适当的选项卡分隔读取功能(例如,从整洁的包中读取\csv 以逗号分隔的文件)导入 ImageJ 像素强度数据文件。
   2. 计算沿样品横断面的光强度的可变性,例如具有变异系数,为在背景中创建的失真水平提供基线参考。
   3. 转换原始像素值以反映强度从最亮到最暗的相对变化,其中最小的像素强度将接近图像程序中选择的所需背景颜色值。
   4. 绘制从异常最亮部分开始的变换像素强度值通常会产生强度值的衰减趋势,作为与源距离的函数。使用非线性最小二乘(函数nls)来估计最适合数据的参数值(此处为高斯衰减函数)。
4. 使用用于生成背景计数器图像的相同程序(处理 v. 3)创建计数器渐变,以减少投影机使用 R(v.3.5.1)可能创建的任何颜色失真。
   注: 渐变函数将生成一系列同心圆,以图像中最亮点为中心,这些圆的像素强度会随着与中心距离的函数而变化。通过从背景颜色中减去模型预测的像素强度变化来定义每个环的颜色。相应地,环半径也会随着与源的距离而增加。最佳拟合模型应减少(如果不是消除)渐变中的任何像素强度,以提供背景均匀性。
   1. 通过调整所需的参数,使用视觉刺激程序创建高斯渐变 ( )。
      1. 参数a影响高斯分布渐变的亮度/暗度。值越高,渐变越暗。
      2. 参数b影响渐变的方差。值越大,渐变在水平到所需的背景像素强度c之前延伸的越宽。
      3. 参数c设置所需的背景像素强度。值越大,背景越暗。
   2. 使用saveFrame函数将图像保存到文件夹,以便在实验期间上传固定的背景图像,以便在实验试验期间渲染刺激时将内存负载降至最低。
   3. 重新运行后台生成程序并直观地检查结果,如图2C所示。重复步骤 4.3,量化观察到的任何改进,以降低整个样品横断面的光强度的可变性程度。
5. 经验调整光照水平、模型参数或横断面覆盖的距离(例如,计数器渐变的外部半径),以进行任何其他手动调整,直到适应区的 RGB 值与决策区域相似。此测试中的模型参数为:a = 215,b = 800,c = 4。
6. 将最终筛选器添加到实验视觉刺激程序。

5. 校准视觉投影程序:视觉刺激

注: 在"处理"中也可以使用以下步骤作为参考线以及平台教程进行视觉刺激的渲染和动画处理。当前程序逻辑的示意图(图3)中提供,其他详细信息可在Lemasson等人(2018)7中找到。以下步骤提供了当前实验中执行的校准步骤的示例。

1. 打开视觉投影程序 Vfish.pde,将投影居中于迷宫的决策区域(图1A),并根据所测试的假设校准视觉投影(例如,校准轮廓的大小和速度以匹配那些测试对象)。使用预先选择的调试标志在主程序 (Vfish.pde) 的标头中手动调整校准。在调试模式 (DEBUG = TRUE) 中按顺序步骤执行每个 DEBUG_LEVEL_ 标志(数字 0-2)以进行必要的调整
   1. 将"调试_LEVEL_0"标志设置为"true",然后按草图窗口中的播放图标运行程序。更改 x 和 y 位置值(域参数 dx 和 dy,分别),直到投影居中。
   2. 将"调试_LEVEL_1"设置为"true"以缩放鱼轮廓的大小(呈现为椭圆)。运行程序并迭代地调整椭圆的宽度 (eW) 和长度 (eL),直到它与测试对象的平均大小匹配。之后,将"调试_LEVEL_2"设置为"true"以调整轮廓 (ss) 的基线速度。
   3. 将 DEBUG = FALSE 设置为退出调试模式。
2. 检查干扰器轮廓是否仍受决策区域(DA,图 1A)的约束,并且引线轮廓轨迹是否与任一臂正确对齐,并且 DA 中的引线/干扰器比率保持不变。
3. 逐步浏览程序的 GUI 以确保选项的功能。
4. 检查数据是否正确写入文件。
5. 确保记录软件能够跟踪主题鱼,并放置视觉投影。追踪鱼类的步骤之前已在凯达诺维奇-柏林等人(2011)8、霍尔科姆等人(2014年)9、Way等人(2016年)10和张等人(2018年)11中作了描述。

6. 动物准备

1. 根据研究问题和应用选择研究对象,包括性别、年龄、基因型。将受试者分配到实验储罐,并记录基线生物特征统计数据(例如,体长和质量)。
2. 将迷宫中的环境条件设置为保持系统的环境条件。行为基线实验的水质条件通常为物种和实验域设置提供最佳条件。
   1. 在本演示中,使用以下条件:12 小时光/12 h 暗循环,头顶无闪烁卤素灯设置为 134 ± 5 勒克斯、22 ± 0.3°C、97.4 ± 1.3% 溶解氧,pH 值为 7.8 ± 0.1。
3. 在实验开始前,将动物转移到领地,每天最多30分钟,为期5天,无需计算机产生视觉刺激(如鱼剪影)。
4. 确保当时被选择、分配、称重、测量和转移到实验池的受试者。
   注:在这里,金闪闪的标准长度和湿重分别为63.4 × 3.5毫米SL和1.8 × 0.3克WW。
5. 在水箱和迷宫之间移动鱼时,使用水到水转移,以减少处理和空气暴露带来的压力。
6. 在定期的固定光周期内进行实验,反映受试者的自然生物节律。这允许在每天的实验试验结束时给受试者喂食,以限制消化对行为的影响。

7. 实验程序

1. 打开房间投影仪和 LED 灯轨系统,使其达到预定的亮度级别(在本演示中为 134 ± 5 勒克斯),使灯泡能够加热(约 10 分钟)。
2. 打开摄像机查看器程序并加载从设置中保存的光圈、颜色和录制的设置,以确保获得最佳视频质量。
   1. 打开 Pylon 查看器并激活用于录制的摄像机。
   2. 从相机下拉菜单中选择"加载功能",然后导航到保存的相机设置文件夹。
   3. 打开保存的设置(此处标记为摄像机设置_20181001),以确保视频质量并单击连续拍摄。
   4. 关闭Pylon 查看器。
3. 打开可视化投影程序 Vfish.pde 并检查投影是否保持迷宫居中、DataOut 文件夹是否为空以及程序是否按预期运行
   1. 使用步骤 5.1.1 检查校准环是否居中在 DA 中。
   2. 打开"数据Out"文件夹,以确保该文件夹当天为空。
   3. 通过按 Vfish.pde 的草图窗口中的播放来运行视觉刺激程序,并使用虚拟变量来确保程序功能。
      1. 输入鱼 ID 号 (1-16),按Enter,然后按Y或N确认选择,表示"是"或"否"。
      2. 输入组大小(此处固定为 1),并确认选择。
      3. 输入所需的轮廓速度(0-10 BL/s)并确认选择。
      4. 按Enter可移动到适应期,并检查决策区域中虚拟鱼的投影。
      5. 按"暂停"以暂停程序并输入虚拟结果选项,即左 (1) 或右侧 (2)。
      6. 按"停止"以终止程序并将数据写入文件。
   4. 检查数据是否正确写入 DataOut 文件夹中的文件,并在将 fish 放入域以进行测试之前在实验室笔记中记录该文件,以便进行适应。
4. 使用时钟时间和秒表在实验室笔记本中记录试用的启动和停止时间,以补充以后由于某些复制试验持续时间短而可以从视频播放中提取的时间。
5. 进行水变化(例如,30%)在将主体转移到迷宫之前,使用保持系统池水。
6. 确认迷宫和保持系统之间的水质相似,并检查闸门是否正常工作,以确保其平稳滑向略高于水的高度。
7. 使用预先确定的实验时间表(在实验过程中随机显示受试者治疗暴露)输入为当前试验选择的值(在适应屏幕停止,步骤 7.3.3.1 - 7.3.3.3)。
   1. 将治疗组合数据记录到实验室笔记本中。
8. 将主体转移到 Y-maze 保持区域,持续 10 分钟的适应期。
9. 开始视频录制,然后在适应期结束时点击 Vfish.pde 窗口中的"返回"键。这将启动视觉投影。
10. 当虚拟鱼出现在域中时,记录时钟时间,然后抬起保持门(图4A)。
11. 当受试者身体50%进入选择臂(图4B)或指定时间段(例如5分钟)时,结束试验。
    1. 从秒表记录时钟时间、开始和停止时间以及受试者的选择(即左 (1)、右 (2) 或无选择 (0)。)。
    2. 停止视频录制,并在视觉刺激程序中按"暂停",这将提示用户输入试用结果数据(选择臂号或 0 表示未别无选择)。确认选择后,程序将返回到第一个屏幕,并等待下一次实验试验的预期值。
12. 收集主体并将其返回到相应的储罐。每次试验重复步骤 7.7-7.13。
13. 在会话结束时(AM 或 PM)在会议的最后一条鱼做出决定后,按程序中的"停止"。按停止会将会话的数据写入文件。
14. 在上午会议结束时重复换水,以确保水质稳定。
15. 在一天的最后一次试用之后,查看实验室笔记本并做所需的笔记。
    1. 在视觉刺激程序中按"停止",在当天的最后一次试用后将收集的数据输出到 DataOut 文件夹。
16. 验证可视化程序保存的数据文件的数量、名称和位置。
17. 记录水质,以及迷宫房间的光线水平,以便与早晨的设置进行比较。将曝气系统和加热器放入 Y 迷宫中。
18. 关闭投影仪和实验室跟踪照明。
19. 喂鱼预定的每日口粮。

8. 数据分析

1. 确保实验数据包含必要的变量(例如,日期、试用、主题 ID、程序选择的手臂、测试的视觉因素、主题选择、开始和停止时间以及注释)。
2. 检查是否有任何记录错误(人为或程序引起的)。
3. 表格反应并检查受试者的任何方向偏差迹象(例如,在控制条件下对手臂选择的二项测试)⁷。
4. 当实验使用对同一个体的重复测量设计时(如此处的情况)中,建议使用混合效果模型。

假设与设计

为了证明这个实验系统的效用,我们测试了一个假设,即Golden Shiner跟随视觉提示的精度会随着这个提示的速度而提高。野生型金闪器使用(N= 16,体长,BL,和湿重量,WW,是63.4 × 3.5毫米和1.8 × 0.3克,恭敬)。视觉刺激(引线/干扰物比)的一致性固定为0.67,而我们操纵我们的运动提示(即引线)相对于其干扰物移动的速度。提供方向提示的引线轮廓的速度级别范围为 0-10 BL/s(以 2 的增量),其范围通常被视为反映鱼12中持续、延长或突发游泳活动模式的速度范围。在控制级别 0,引线轮廓面向随机定向干扰器之间的目标臂,但没有移动任何轮廓。程序在每次试验中随机选择目标臂。距离单位以身体长度表示,由我们受试者的平均标准长度定义,时间以秒为单位。目前的代表性分析侧重于测量主要响应变量(决策速度和准确性),但实验的设计也使研究人员能够通过跟踪主体移动和分析其运动学。

我们的鱼类受试者按照议定书第6节进行安置。每个受试者每天接受一个级别的治疗。我们在不同天数的受试者治疗水平(提示速度)和每天测试受试者的顺序内随机进行随机化。线性和广义的线性混合效果模型(LMM和GLMM,分别)用于测试引线轮廓速度对受试者跟随视觉刺激的速度和准确性的影响。主题 ID 作为随机效果包含在两个模型中。

数据和调查结果

在没有任何运动提示的情况下,Golden Shiner 按预期操作,并随机选择方向(刺激速度 = 0,二项测试,n 左=33,n右侧= 40,= 0.45,P = 0.483)。虽然大多数受试者在区域内没有表现出压力行为的迹象,并在规定的时间内(5分钟)做出了果断的决定,但22%的受试者表示不愿离开拘留区或进入决策区域。分析中不包括这些优柔寡断的鱼类的数据。其余78%的受试者在跟随定向刺激的准确度上有了显著改善,因为这些刺激的速度增加(GLMM,z = 1.937,P = 0.053)。图 5A显示了这种关系的性质,我们发现每次刺激速度水平增加的方向精度都会提高 1.2 倍。这种关系只是适度的不相称,本身并不暗示对提示速度变化的阈值响应。刺激速度的提高也导致决策速度的显著增加(LMM,F 1,56= 4.774,P = 0.033)。 然而,如图5B所示,决策速度的趋势是不一致的,并且在刺激速度水平上变化很大。这些决策速度数据中显而易见的是,当刺激作用移动时,受试者平均需要5-20倍的时间做出决策(决策速度为4.6±2.3s和81.4±74.7s。 速度分别为 0 和 8,= 标准偏差,SD)。事实上,如果没有控制水平,我们发现决策速度作为刺激速度的函数没有显著变化。

图 1.Y 迷宫域。A.用于决策测试的 Y 迷宫设备的图像。注释代表以下内容:保留区域(HA、绿色)、决策区域(DA、蓝色)、左决策臂 (LDA) 和右侧决策臂 (RDA)。B. Y-maze 和房间的图像,具有可调节的轨道照明和 GigE 摄像机放置(四个架空灯条中只有一个可见)。C. Y-maze(侧视图)的图像,包括由滑动滑车锁定的投影机位置,以消除试验期间或试验之间的运动。请点击此处查看此图的较大版本。

图 2.背景和刺激校准。A.在保持区域和决策区域(DA(平均像素强度 112 × 1278)之间具有均匀背景色和像素强度横断(绿线)的发光 Y 迷宫的图像。投影机灯泡(热点)产生的光梯度清晰可见。B.显示投影与 DA 对齐的图像。C.迷宫的图像,其背景被过滤后,在 DA 中心投影的单独轮廓用于校准(大小、速度)。在 (C) 中添加计数器渐变背景会导致背景较暗(平均像素强度 143.1 ± 5.5),空间变异性(变异系数从 11.4 (A.) 下降到 0.03 (C.)。请点击此处查看此图的较大版本。

图 3.实验中使用的可视化程序中的一般操作流程的原理图。有关其他过程的详细信息,请参阅 7。请点击此处查看此图的较大版本。

图 4.实验试验与真实和虚拟的鱼剪影。A.图像 a (现场) 金色闪亮离开保持区域 (绿色圆圈)。B.在虚拟鱼剪影的决策区域(绿色圆圈)中的(实时)金神的形象。请点击此处查看此图的较大版本。

图 5.方向响应对运动提示相对速度变化的精度和速度。A.黄金信纳跟随"领导者"剪影的鱼决策准确性的图表,该剪影针对刺激速度 (BL/s) 绘制。B.根据刺激速度 (BL/s) 绘制的鱼决策速度图。数据是手段 + 标准错误, SE. 15 个虚拟剪影组被随机分布在整个决策区,具有 67% 的一致性级别(15 个轮廓中有 10 个充当领导者,其余 5 个剪影充当干扰器),我们改变了从 0-10 BL/s 的引线的速度。 干扰器速度在所有速度级别上都固定为 1 BL/s,但控制中没有一个轮廓移动。请点击此处查看此图的较大版本。

所有作者都为实验设计、分析和论文撰写做出了贡献。A.C.U. 和 C.M.W. 设置并收集数据。作者没有什么可透露的。