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方法文章

使用成熟细胞器分离试剂盒快速分离脂滴的实验方案

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DOI：

10.3791/59290

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2019年4月19日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案建立了一种利用已成熟的小鼠内质网分离试剂盒，从小鼠肝脏中分离和纯化脂滴的新方法。

摘要

脂滴（LDs）是存在于大多数真核细胞以及某些原核细胞胞质中的生物活性细胞器。LDs由中性脂质核心构成，外层包裹着单层磷脂和蛋白质。肝脏中脂滴的脂类成分（如神经酰胺）以及相关蛋白质与多种导致肝脂肪变性的疾病相关。尽管已有用于分离脂滴的既往方法，但这些方法需要耗时的试剂配制过程，且未设计用于同时分离多个亚细胞组分。本研究旨在建立一种新方案，以实现从单个小鼠肝脏中同时分离脂滴、内质网（ER）和溶酶体。

此外，本方案中使用的所有试剂均可从商业途径获得，所需试剂制备极少，且不会影响脂滴（LD）的纯度。本文展示了将该新方案与标准蔗糖梯度法进行比较的数据，结果显示两者在纯度、形态学特征及得率方面相当。此外，我们还可利用同一样本分离内质网（ER）和溶酶体，从而深入揭示脂质及其相关蛋白的形成过程及细胞内动态变化。

引言

脂滴（LD）是存在于大多数真核细胞以及某些原核细胞胞质中的生物活性细胞器1,2,3。脂滴的核心由中性脂质组成，例如甘油三酯（TG）和胆固醇酯。它们还含有神经酰胺，即参与细胞信号通路的生物活性脂质4,5。脂滴被一层磷脂单分子层包裹，并覆盖有多种蛋白质，包括脂滴包被蛋白perilipin 2（PLIN2）和perilipin 3（PLIN3）1,5,6。此外，还存在与多种肝脂肪变性疾病相关的脂质合成酶、脂肪酶以及膜运输蛋白，这些疾病包括非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病和丙型肝炎3,5,6,7,8,9,10。

脂滴被认为起源于内质网的外膜，并含有由内质网来源的游离脂肪酸合成的甘油三酯11。然而，目前尚不清楚这些聚集的脂质是出芽形成、仍与内质网保持连接，还是从内质网被切割下来6,11，这使得在技术上难以获得完全不含内质网污染的脂滴。脂滴表面的脂肪酶可水解释放出游离脂肪酸，用于能量生成或膜结构合成。此外，脂滴还可通过脂噬作用被降解，作为一种调控机制并产生游离脂肪酸12。

除了内质网和溶酶体外，还有其他一些细胞器——如线粒体、内体、过氧化物酶体以及质膜——常与脂滴（LDs）紧密关联11。这种紧密的多配偶样关系使得难以实现脂滴的纯化提取。然而，可利用中性脂质固有的低密度特性，通过离心进行分离5。

传统上，脂滴（LDs）的分离通常采用蔗糖密度梯度法1,5,13。然而，这些方法并非专为同时分离其他细胞器而设计，且需要耗时的试剂配制过程。本实验方案改进了一种 commercially available 内质网（ER）分离试剂盒（见材料表），使其适用于脂滴的分离。我们使用试剂盒提供的提取缓冲液，并增加一步脂滴分离操作。此外，该方案还可利用同一样本进行内质网和溶酶体的分离，从而更全面地揭示脂滴生命周期的动态变化。为验证该新方法的有效性，我们检测了脂滴的得率、形态、大小及纯度，并将本方案所得结果与广泛使用的蔗糖梯度法分离脂滴的结果进行比较。

我们使用一只禁食16小时的10至12周龄、体重20 g的雌性C57BL/6小鼠（于下午5:00撤除食物，次日上午9:00进行脂滴分离），自由饮水。甘油三酯（TG）的典型产量为每克肝脏0.6 mg，脂滴蛋白的产量为每克肝脏0.25 mg。这些材料足以进行约10次SDS-PAGE免疫印迹分析。以下方案详细列出了所用试剂及适用于1 g肝脏样本的操作步骤。蔗糖梯度分离方案改编自Sato14和Wu15。

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方案

所有实验均在实验室台面上进行，并穿戴适用于生物安全等级1的个人防护装备，包括实验服、手套和护目镜。实验操作均依照宾夕法尼亚大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的方案进行。所有操作均尽可能减少动物的不适，动物均得到人道的护理与对待。

1. 使用内质网分离试剂盒进行LD分离

  1. 准备
    注意：所列用量适用于单个1 g小鼠肝脏。
    1. 通过将2 mL 5x等渗提取缓冲液（IE缓冲液，来自内质网分离试剂盒）与8 mL超纯水混合，配制10 mL 1x IE缓冲液。将缓冲液置于冰上冷却。
    2. 通过将10 mL 10x磷酸盐缓冲液（PBS）与90 mL超纯水混合，配制100 mL 1x PBS。将缓冲液置于冰上冷却。
    3. 通过将500 µL PGPE加入9.5 mL超纯水中，配制10 mL 5%聚乙二醇p-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚（PGPE）。由于PGPE黏稠，使用1 mL注射器量取。将溶液置于冰上冷却。
    4. 将所有离心管置于冰上预冷：1.7 mL微量离心管、15 mL离心管、50 mL高速离心管和13 mL超速离心管。
    5. 将所有所需离心机预冷至4 °C：微量离心机、适用于15 mL管的高容量离心机、适用于50 mL管的高速离心机以及超速离心机。
    6. 通过高压灭菌对镊子和解剖剪进行灭菌处理。
  2. 组织准备
    1. 将小鼠置于充满100% CO­2的密闭室中10分钟以实施安乐死。通过颈椎脱位确认动物死亡。
    2. 使用无菌镊子和解剖剪沿腹部前后轴方向剪开皮肤和肌肉层，暴露肝脏。
    3. 剪断肝脏与膈肌和肠道之间的韧带。用镊子将肠道向后方牵拉，远离肝脏，以暴露韧带。
    4. 从前往后方向，在肝脏与背侧肋骨之间剪开，直至完全游离肝脏。
    5. 将肝脏转移至含有10 mL冷1x PBS的5 cm培养皿中。
    6. 在5 cm培养皿中，于4 °C条件下，在10 mL冷1x PBS中于摇床上洗涤肝脏2次，每次5分钟。最后一次洗涤后弃去PBS。
    7. 使用10号无菌手术刀片（见材料表），在5 cm培养皿中将肝脏切成3–5 mm大小的组织块（图1A）。
    8. 在5 cm培养皿中，用10 mL冷1x PBS洗涤切碎的肝脏2次，每次5分钟，温度为4 °C。
      注意：如需进行溶酶体分离，请将0.5 g肝脏转移至洁净的45 mL匀浆器中，并按照溶酶体提取试剂盒说明书操作（见材料表）。
    9. 倾去PBS，将切碎的肝脏组织转移至预冷的45 mL Dounce匀浆器中。确保所有组织块均落入匀浆器底部。
    10. 加入7 mL冷1x IE缓冲液（来自内质网分离试剂盒），在冰上上下移动研杵20次进行匀浆。每次研磨时确保研杵到达匀浆器底部。
    11. 将匀浆液（图1B）转移至预冷的15 mL离心管中。
    12. 用1 mL冷1x IE缓冲液（来自内质网分离试剂盒）冲洗匀浆器，并将冲洗液加入匀浆液中。
  3. 脂滴（LD）分离
    1. 在4 °C条件下，将匀浆液于高容量离心机中以1,000 x g离心10分钟，去除细胞核（图1C）。
    2. 将上清液（即核后上清，PNS）转移至新的预冷50 mL离心管中。为防止脂滴损失，在转移PNS前应确保15 mL管顶部聚集的脂质重新悬浮。
    3. 取100 µL PNS样品用于纯度分析，置于预冷的1.7 mL微量离心管中，冰上保存备用。
    4. 为去除线粒体，将PNS样品（非 aliquot 样品）于4 °C条件下，在冷藏高速离心机中以12,000 x g离心15分钟。
      1. 可选：对于粗制脂滴（CLD）分离物（含细胞质和细胞膜污染），使用玻璃移液管收集顶部脂层，并转移至1.7 mL微量离心管中。继续进行第1.4节操作。
    5. 将线粒体后上清液（PMS）转移至超速离心管中。为防止脂滴损失，在转移PMS前应确保顶部聚集的脂质重新悬浮。
    6. 取100 µL PMS样品用于纯度分析，置于预冷的1.7 mL微量离心管中，冰上保存备用。
    7. 用冷1x IE缓冲液将超速离心管完全注满，以防止超速离心过程中管壁塌陷。
    8. 平衡样品后，在4 °C条件下，于超速离心机中以100,000 x g离心60分钟（图1D）。
    9. 将离心管倾斜45°角，使用玻璃移液管吸除脂滴层。将沉淀物转移至预冷的1.7 mL微量离心管中。
      注意：沉淀物含有分离的内质网（ER）。将此组分用于后续内质网分离。
    10. 从脂层下方收集100 µL内质网后上清液（PER），用于纯度分析。
  4. 脂滴洗涤
    1. 向收集于1.7 mL微量离心管中的脂滴组分加入1x PBS，使总体积达到1.3 mL。
    2. 涡旋震荡样品。
    3. 在4 °C条件下，于微量离心机中以最高速度离心5分钟，使细胞碎片沉淀。用手轻轻温热离心管以助脂层重新悬浮。将上清液（包括脂层）转移至新的1.7 mL微量离心管中。
    4. 重复步骤1.4.1–1.4.3共2–3次，直至沉淀不可见。
    5. 向不含沉淀的脂滴上清液中加入1x PBS，终体积为1.5 mL。在4 °C条件下，于微量离心机中以最高速度离心5分钟，洗涤脂质组分。
    6. 使用玻璃移液管小心移除脂层下方的1 mL 1x PBS，避免扰动脂层。
    7. 重复步骤1.4.5和1.4.6共4–5次，直至1x PBS肉眼观察透明无浑浊。
    8. 使用玻璃移液管完全移除脂层下方的所有1x PBS（图1E）。
    9. 所得纯化脂滴组分可用于后续分析。
  5. 通过双辛可宁酸法（BCA）测定脂滴蛋白含量
    注意：若需评估脂滴形态，则不应使用双辛可宁酸法（BCA）。
    1. 将脂滴重悬于500 μL 5% PGPE中。
    2. 在95 °C下煮沸样品5分钟，涡旋震荡，然后于室温孵育5分钟以冷却。
    3. 额外重复步骤1.5.2共2次。
    4. 以中等强度进行超声处理5分钟，采用30秒开/30秒关循环模式。
    5. 通过BCA法测定所有纯度分析样品及脂滴组分的蛋白浓度，对样品进行归一化处理。

2. 使用蔗糖密度梯度分离LD

  1. 准备
    1. 配制 200 mL TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl [pH 7.4]，1 mM EDTA [pH 8.0]）。将缓冲液置于冰上冷却。
    2. 在 TE 缓冲液中溶解 60 g 蔗糖，定容至 100 mL，配制 100 mL 的 60% (w/v) 蔗糖溶液。将溶液置于冰上冷却。
    3. 将 4 mL 60% 蔗糖溶液与 2 mL TE 缓冲液混合，配制 6 mL 的 40% (w/v) 蔗糖溶液。将溶液置于冰上冷却。
    4. 将 2.5 mL 60% 蔗糖溶液与 3.5 mL TE 缓冲液混合，配制 6 mL 的 25% (w/v) 蔗糖溶液。将溶液置于冰上冷却。
    5. 将 0.7 mL 60% 蔗糖溶液与 3.3 mL TE 缓冲液混合，配制 4 mL 的 10% (w/v) 蔗糖溶液。将溶液置于冰上冷却。
    6. 将蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片加入 10 mL TE 缓冲液中，配制 10 mL 蛋白酶和磷酸酶抑制剂溶液。
    7. 将 4 mL 蛋白酶和磷酸酶抑制剂溶液加入 50 mL 60% 蔗糖储备液中，配制组织匀浆缓冲液。将缓冲液置于冰上冷却。
    8. 将 2 mL 蛋白酶和磷酸酶抑制剂溶液加入 50 mL TE 缓冲液中，配制覆盖缓冲液。将缓冲液置于冰上冷却。
    9. 将 10 mL 10x PBS 用超纯水稀释至 100 mL，配制 100 mL 1x PBS。将缓冲液置于冰上冷却。
    10. 将 500 µL PGPE 加入 9.5 mL 超纯水中，稀释配制 10 mL 5% PGPE。由于 PGPE 黏稠，使用 1 mL 注射器量取。将溶液置于冰上冷却。
    11. 将以下离心管置于冰上预冷：1.7 mL 微量离心管、15 mL 离心管、50 mL 高速离心管和 13 mL 超速离心管。
    12. 将所需离心机预冷至 4 °C：微量离心机、大容量离心机（用于 15 mL 管）、高速离心机（用于 50 mL 管）和超速离心机。
  2. 组织制备
    1. 使用步骤 1.2.1–1.2.9 准备用于匀浆的组织。
    2. 加入 7 mL 冷的组织匀浆缓冲液，在冰上上下移动研杵 20 次进行匀浆。前五次研磨时，确保研杵到达匀浆器底部。
    3. 将匀浆液转移至预冷的 15 mL 离心管中。
    4. 用 1 mL 冷的组织匀浆缓冲液冲洗匀浆器，并将冲洗液转移至之前使用的 15 mL 离心管中。
    5. 用组织匀浆缓冲液将匀浆液体积补至 10 mL。
    6. 在 4 °C 条件下，于大容量离心机中以 1,000 x g 离心 10 分钟。
    7. 将 8 mL 上清液转移至 50 mL 离心管中。
    8. 将剩余上清液中的 100 µL 作为 PNS 样品用于纯度分析。
  3. 蔗糖梯度
    1. 将含有 8 mL PNS 的 50 mL 离心管倾斜至 45° 角。小心加入 6 mL 40% 蔗糖溶液，确保两相保持分离。
    2. 以类似方式，缓慢加入 6 mL 25% 蔗糖溶液；然后加入 4 mL 10% 蔗糖溶液；最后加入 8 mL 覆盖缓冲液。
    3. 在 4 °C 条件下，于高速离心机中以 30,000 x g 离心 30 分钟。
    4. 将含有脂滴（LDs）的上层转移至 1.7 mL 微量离心管中。
    5. 对脂滴进行洗涤时，请遵循第 1.4 节中的步骤。

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结果

我们使用ER试剂盒对约30只小鼠进行了脂滴（LD）分离，并将结果与使用蔗糖梯度法对约40只小鼠进行分离的结果进行了比较。所报告的发现对两种方法均具有代表性。为提高脂滴产量，小鼠在实验前禁食过夜，但可自由饮水。脂滴分离实验采用蔗糖梯度法与ER试剂盒脂滴分离方法平行进行。在ER试剂盒脂滴分离过程中，分别收集了PNS、PMS、PER、CLDs和LDs样品。由于蔗糖梯度法在操作流程上的限制，仅收集了PNS和脂滴分离物样品。

用于荧光显微镜观察， 50 µL 分离的脂滴与等体积的 100 µM 4,4-二氟-1,3,5,7,8-五甲基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省（DPBDI）。样品避光，室温孵育30分钟。加入1 mL 1×PBS洗涤样品，随后离心并去除多余缓冲液。取LD组分， 1 µL 置于显微镜载玻片上并加盖盖玻片。分别从内质网试剂盒脂滴分离和蔗糖梯度脂滴分离中采集具有代表性的20倍荧光和明场脂滴图像（图2...

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讨论

肝细胞脂滴（LD）生物学在健康和疾病状态下对肝细胞生理功能的调控作用正日益受到重视。作为真正的细胞器，脂滴具有动态特性，可与其他细胞结构相互作用，并含有参与脂质和葡萄糖稳态的生物活性成分。蔗糖梯度法常用于脂滴的分离，可使研究人员研究脂滴结构，但该方法需要配制多种缓冲液。我们已证实，利用 commercially available 的内质网（ER）分离试剂盒是另一种可用于脂滴分离的工具，同时还能实现内质网和溶酶体的串联分离，从而在不显著增加实验流程复杂性的前提下，更全面地揭示细胞在不同实验条件下动态变化的情况。

本新方案的优势在于使用商业化或易于获得的试剂即可轻松建立实验体系，并能同时分离多种细胞器。然而，该新方法也存在一些潜在的缺点需要注意。本方案中的多个步骤可能不利于从肝脏中分离超大脂滴（LD）。Dounce匀浆可能通过剪切力破坏较大的脂滴。使用松配合的Dounce匀浆器可能在一定程度上减轻对大脂滴的机械应力。此外，本方案采用100,000 × g 离心，以实现脂滴与内质网（ER）的分离，但该转速也可能导致大脂滴的丢失；已有文献报道，肝脏脂滴纯化建议使用2,0...

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披露

Carr 博士从 Intercept Pharmaceuticals 获得研究资助。

致谢

感谢Abramson家族癌症研究所。本研究获得以下资助：NIH/NIAAA R01 AA026302-01、NIH/NIAAA K08-AA021424、罗伯特·伍德·约翰逊基金会、Harold Amos医学教师发展奖、7158、IDOM DRC试点奖 P30 DK019525（R.M.C.）；NIH/NIAAA F32-AA024347（J.C.）。本研究部分由NIH P30-DK050306及其核心设施（分子病理与影像核心、分子生物学/基因表达核心及细胞培养核心）及其试点资助项目支持。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BioExpress 涡旋混合器GeneMateS-3200-1涡旋混合器
Centrifuge 54242 REppendorf54242 R制冷台式微量离心机
转子：FA-45-24-11
Centrifuge Sorvall RC6 +Thermo ScientificRC6+制冷高速离心机
转子：F21S-8x50y
Centrifuge Sorvall Legend RT+Thermo ScientificLegend RT+制冷大容量离心机
转子：75006445 吊篮：75006441
cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物Sigma Aldrich04 693 116 001蛋白酶抑制剂片剂
Diagenode Bioruptor UCD-200DiagenodeUCD-200超声破碎系统
Dounce 组织研磨器（45 mL）Wheaton357546使用松配合研杵
杜氏磷酸盐缓冲液（1×）Corning21-031-CM
内质网分离试剂盒Sigma AldrichER0100用于内质网试剂盒提取：
包含：
等渗提取缓冲液 5× 100 mL
低渗提取缓冲液 10 mL
氯化钙，2.5 M 溶液 5 mL
OptiPrep 密度梯度介质 100 mL
钝头针 1 个
用于荧光激发的外部光源LeicaLeica EL6000
盐酸Sigma AldrichH1758盐酸
ImageJ图像分析软件
倒置调制对比显微镜LeicaLeica DM IRB
组织和培养细胞溶酶体富集试剂盒Thermo Fisher Scientific89839用于溶酶体分离
显微镜相机QimagingQICAM fast 1394
Optima XL-100K 超速离心机Beckman-CoulterXL-100K超速离心机
转子：SW41Ti
巴斯德吸管Fisher Scientific22-042817
5 cm 培养皿Fisher ScientificFB0875713A
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒Thermo Fisher Scientific23225
PhosSTOPSigma Aldrich04 906 845 001磷酸酶抑制剂片剂
无菌手术刀片 #10PioneerS2646
蔗糖Fisher ScientificS5-500结晶蔗糖/符合 ACS 标准
Triglyceride Liquicolor 试剂盒Stanbio 2200-225比色法甘油三酯检测试剂盒
Tris 碱Fisher ScientificBP152-1用于 TE 缓冲液
Triton X-100Fisher BioReagentsBP151-1005%，聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚，蛋白裂解试剂
UltraPure EDTA（0.5 M，pH 8.0）Thermo Fisher Scientific15575-038用于 TE 缓冲液

参考文献

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