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方法文章

乳腺组织类器官的培养及辐照后表征

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DOI：

10.3791/59293

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2019年5月3日

 ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 3Department of Radiation Oncology, Vanderbilt University Medical Center

本文内容

摘要

由小鼠乳腺组织开发的类器官经辐射处理后进行表征，以评估上皮特性及其与免疫细胞的相互作用。经辐射的类器官可用于更有效地评估可能引起肿瘤细胞在辐射正常组织中募集的细胞间相互作用。

摘要

由消化组织获得的类器官是多细胞三维（3D）结构，相较于单层细胞培养，能更好地模拟体内环境。尽管它们无法完全重现体内的复杂性，但保留了原始器官的部分功能。在癌症模型中，类器官常用于研究肿瘤细胞的侵袭行为。本方案旨在建立并表征来自正常及经辐照小鼠乳腺组织的类器官，以评估正常组织对辐射的响应。这些类器官可应用于未来的体外癌症研究，用以评价肿瘤细胞与经辐照类器官之间的相互作用。乳腺组织被切除后接受20 Gy辐照，并在胶原酶VIII溶液中进行消化。通过离心分离法获得上皮类器官，并在96孔低吸附微孔板中培养形成3D类器官。类器官表达特征性上皮标志物细胞角蛋白14。在共培养实验中观察到巨噬细胞与类器官之间的相互作用。该模型可能有助于研究在经辐照微环境中肿瘤与间质的相互作用、免疫细胞的浸润以及巨噬细胞的极化现象。

引言

大约60%的三阴性乳腺癌（TNBC）患者选择保乳治疗（BCT）作为治疗方式1。在这种治疗模式中，含有肿瘤的部分乳腺组织被切除，周围正常组织则接受电离辐射，以杀灭任何残留的肿瘤细胞。该治疗可降低大多数乳腺癌患者的复发风险；然而，约13.5%的TNBC治疗患者会出现局部区域复发2。因此，研究辐射如何招募循环肿瘤细胞（CTCs），将有助于深入理解局部复发的机制3,4。

既往研究表明，正常组织受到辐射会增加多种细胞类型的募集5。在三阴性乳腺癌（TNBC）的临床前模型中，正常组织的照射可促进巨噬细胞以及随后肿瘤细胞向正常组织的募集5。免疫状态影响肿瘤细胞向受照部位的募集，在免疫功能低下个体中可观察到肿瘤细胞的迁移。利用乳腺组织来源的类器官重现这些相互作用，将能够通过显微镜和活细胞成像实时观察细胞迁移及细胞-基质间的相互作用，从而明确辐射损伤在改变肿瘤细胞行为中的作用。

小鼠乳腺类器官有助于阐明乳腺发育过程中的关键步骤。乳腺类器官是由分离的乳腺上皮细胞构成的多细胞三维结构，其尺寸大于50 μm6,7,8,9,10。Simian 等人利用原代上皮类器官评估了乳腺分支发育所必需的因素7。Shamir 等人发现，上皮细胞在未经历上皮-间质转化的情况下仍可发生播散，这一发现为理解转移级联过程提供了新视角8。目前，从乳腺组织中生成和表征类器官的方法已较为成熟6,11,12,13。然而，据我们所知，尚未有报道关于从乳腺组织中培养经辐射处理的类器官的方法。建立一种用于培养和表征经辐射处理类器官的实验方案，将是重现辐射诱导的免疫细胞和肿瘤细胞募集过程的关键步骤。

本文报道了一种在涂有亲水性聚合物的低吸附微孔板中培养和表征经辐照的乳腺上皮类器官的方法，该聚合物可支持球状体的形成。这些类器官与巨噬细胞共培养，以研究免疫细胞浸润的动力学。本研究可进一步扩展，包括将类器官与脂肪细胞共培养以模拟乳腺特性，与乳腺癌细胞共培养以观察肿瘤细胞的募集，以及与CD8+ T细胞共培养以研究肿瘤-免疫细胞相互作用。已有建立的实验方案可用于评估经辐照的类器官。先前的模型通过共培养乳腺类器官与免疫细胞，揭示了转移和扩散的机制。DeNardo等发现，CD4+ T细胞对肿瘤相关巨噬细胞的调控增强了乳腺腺癌的转移表型14。共培养模型还被用于阐明生物学发育的机制。Plaks等阐明了CD4+ T细胞在乳腺器官发生中作为下调调节因子的作用15。然而，我们课题组首次建立了可视化正常组织辐照如何影响免疫细胞行为的实验流程。由于已有研究表明正常组织辐照可增强肿瘤细胞的募集5，本方案可进一步发展为分析正常组织和细胞经辐照后如何改变肿瘤细胞行为，从而加深对癌症复发机制的理解。

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方案

动物实验均遵循范德比尔特大学机构动物护理和使用委员会批准的机构指南和方案进行。

1. 小鼠准备与细胞获取（改编自 Nguyen-Ngoc 等人11）

  1. 使用 CO2 窒息法处死裸鼠（Nu/Nu，8-10 周龄），随后进行颈椎脱位。用 70% 乙醇清洁皮肤。
  2. 使用预先灭菌的剪刀和镊子切除小鼠的腹部和腹股沟乳腺组织。在切除前去除淋巴结。用无菌的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗组织（图 1A）。
  3. 将组织放入含 10 mL DMEM/F12 培养基的 15 mL 离心管中用于运输。样品可在 4 °C 保存过夜，或立即处理。处理过程中保持冰上操作。
  4. 使用铯源对样品进行 20 Gy 的照射（图 1B）。
  5. 照射后 45 分钟，将乳腺组织置于 35 mm 无菌细胞培养皿中，用手术刀切碎（图 1C,D）。大约切 40 次，直至组织松散，获得面积不超过约 1 mm2 的组织碎片。
  6. 将组织转移至含胶原酶溶液的 50 mL 离心管中。胶原酶溶液由 2 mg/mL 胶原酶（见 材料表）、2 mg/mL 胰蛋白酶、5% v/v 胎牛血清（FBS）、5 μg/mL 胰岛素和 50 μg/mL 庆大霉素溶于 DMEM/F12 培养基中组成。每只小鼠使用 10 mL 胶原酶溶液。
  7. 将离心管置于 37 °C 水浴中，每 10 分钟涡旋震荡一次，持续 30-60 分钟。当胶原酶溶液变浑浊时，表明消化完成（图 1E,F）。
  8. 在室温（RT）下以 450 × g 离心 10 分钟。可见三层结构：上层为脂肪，中层为水相溶液，下层为沉淀。沉淀呈红色，为上皮细胞、单个基质细胞和红细胞的混合物（图 1G）。
  9. 在接触前，使用牛血清白蛋白（BSA）溶液预包被所有移液管、移液枪头和离心管。BSA 溶液由 2.5 w/v % BSA 溶于杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中组成。预包被时，只需将 BSA 溶液加入移液枪头和离心管内壁，随后吸出即可。BSA 溶液可重复使用，但每次实验前应进行无菌过滤。
  10. 为提高回收率，将上清液转移至新的经 BSA 包被的 15 mL 离心管中。剧烈吹打以分散脂肪层。在室温下以 450 × g 离心 10 分钟。吸走上清液，管内保留少量培养基，避免吸走细胞沉淀。
  11. 从含有原始沉淀的离心管中吸除水相层。
  12. 向含有原始沉淀的离心管中加入 10 mL DMEM/F12 培养基，并转移至第二个离心管中。剧烈吹打以混合并重悬两个沉淀。
  13. 在室温下以 450 × g 离心 10 分钟。吸走上清液，向管中加入 4 mL DMEM/F12 培养基。
  14. 向悬浮液中加入 40 μL 脱氧核糖核酸酶（DNase），在室温下手动轻轻摇晃 2-5 分钟。DNase 溶液由 4 U/mL DNase 溶于 DMEM/F12 培养基中组成。
  15. 加入 6 mL DMEM/F12 培养基并充分吹打。在室温下以 450 × g 离心 10 分钟。
  16. 将上清液吸至 0.5 mL 刻度线处。用 10 mL DMEM/F12 培养基重悬沉淀，并充分吹打。
  17. 短暂离心至 450 × g，达到该转速后 4 秒停止。
  18. 重复步骤 1.16–1.17 三次，通过离心差速分离法进一步纯化类器官。此时沉淀应呈乳白色，仅由上皮类器官组成（图 1H）。
    注意：也可使用无菌 40 μm 网格滤器过滤类器官。在完成步骤 1.16 后，将含有类器官的培养基通过滤器吹入离心管，再用 5 至 10 mL DMEM/F12 培养基冲洗。将滤器翻转至新的 50 mL 离心管上方，从反方向加入 10 mL DMEM/F12 培养基冲洗，以回收截留物。截留物应为类器官，而滤过液主要含基质细胞，可根据需要丢弃或保留。

2. 确定类器官的密度并进行铺板

  1. 用 10 mL DMEM/F12 重悬沉淀，充分吹打以形成均一溶液。
  2. 取 50 µL 转移至 30 mm 培养皿中，在 20 倍相差显微镜下观察，使用计数器统计类器官数量。
    注意：此处所用移液器吸头的最小直径始终为 457 μm，约为接种类器官直径的 5–10 倍。当转移体积为 2 mL 或更大时（例如步骤 1.16 和 2.1），应使用尖端直径超过 1,500 μm 的刻度移液管。
  3. 使用以下公式计算类器官密度：
    计算管中类器官浓度的公式，以比例图形式显示。
    目标密度为 1,000 个类器官/mL，以便后续稀释。若密度过低，则在 450 × g 离心 5 分钟，吸除培养基，加入适量培养基使浓度达到 1,000 个类器官/mL，并充分吹打形成均一混合液。
    1. 若需在蛋白基质中培养类器官，应将类器官以 1 个/μL 的浓度接种于稀释至 87% 的 I 型胶原或 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤来源的基底膜提取物中。操作过程中样品应始终保持在冰上。
    2. 若需冻存类器官，将所需体积转移至另一离心管中，在 450 × g 离心 5 分钟，吸除培养基后加入等体积的 90% FBS/10% DMSO。重悬类器官后分装至冻存管中，先置于 -80 ˚C，一周内转移至液氮中保存。
    3. 解冻时，于 37 ˚C 水浴中温育 1 分钟。在 450 × g 离心 5 分钟后吸除冻存液，用无菌 DPBS 洗涤一次，再次离心。吸除 DPBS 后加入类器官培养基。
  4. 将 50 µL（含 50 个类器官）吹打加入低吸附培养板的每孔中（图 1I）。
  5. 每孔加入 150 µL 类器官培养基，使工作总体积达到 200 µL。类器官培养基由含 1% 青霉素-链霉素和 1% 胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）的 DMEM/F12 培养基组成。
  6. 每隔 2 天小心更换培养基。
    注意：低吸附培养板未经组织培养处理，细胞易于脱落。吸除培养基时应倾斜培养板，并将移液器吸头置于每孔边缘缓慢吸取，保留少量培养基于孔底。添加新培养基时应缓慢，避免对类器官施加不必要的剪切力。

3. 与巨噬细胞共培养

  1. 在补充有10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养GFP或dTomato标记的RAW 264.7巨噬细胞。将1 × 104、5 × 104或1 × 105个细胞/mL接种至类器官培养基中。
  2. 利用活细胞相差显微镜和荧光成像技术随时间监测巨噬细胞的浸润情况。

4. 类器官的免疫荧光染色

注意：类器官可以在低吸附孔板中进行染色，也可以转移至腔室载玻片。如需转移，需用移液器轻柔吹打，直至类器官从培养板上脱离。将类器官转移至腔室载玻片，并孵育4–8小时，使其贴附于板面。

  1. 小心吸除孔中的类器官培养基，加入10%中性缓冲福尔马林，在室温下固定15分钟。
  2. 用1× PBS洗涤3次，每次5分钟。如需要，固定后的样品可在4 °C保存一周，用于后续染色。
  3. 用0.1% 4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇处理5分钟进行通透。
    注意：若需对F-肌动蛋白（F-actin）染色，请将样品在含1:1,000稀释的鬼笔环肽（phalloidin）和1.67 nM双苯并咪唑核染料的1% PBS/BSA溶液中，室温孵育1小时，然后进入步骤4.8。
  4. 用0.5× PBS进行平衡。样品可在4 °C保存，用于后续成像分析，包括明场图像和免疫荧光图像。用含5%正常山羊血清的0.1% PBS/聚山梨酯（PBST）在室温封闭1小时。用PBS洗涤3次，每次5分钟。
  5. 在含1% NGS的PBST中，加入抗细胞角蛋白14（Anti-Cytokeratin 14，1:1,000稀释）、E-钙黏蛋白（E-Cadherin，1:200稀释）或紧密连接蛋白1（Tight Junction Protein One，1:100稀释）抗体，室温孵育1小时。用PBST洗涤3次，每次5分钟。
  6. 加入1% NGS/PBST稀释的山羊抗兔二抗（1:200稀释），室温孵育1小时。用铝箔包裹以避免光照。
  7. 用PBS洗涤3次，每次5分钟。使用核染料（见材料表）对细胞核进行染色。
  8. 用PBS洗涤3次，每次5分钟。若使用腔室载玻片，加盖盖玻片封片。用铝箔包裹后于4 °C保存，最长可保存2周。

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结果

通过小鼠乳腺组织成功获取了经辐照的上皮类器官，并进行了处理，随后在低黏附培养板上进行培养（图1）。通过在不同生长环境中接种，检测了类器官的得率（图2A-G）。将细胞直接接种至经组织培养处理的10 cm细胞培养板时，成纤维细胞出现过度生长。在相差显微镜下，成纤维细胞出现在类器官的同一焦平面或其附近，并在接种后数天内迅速从类器官中迁移生长出来。当将类器官接种于基底膜和胶原蛋白基质中时，也观察到成纤维细胞的过度生长现象（图2E,F）。

在优化辐照类器官生长的实验中，测试了多种条件（图2H）。在类器官消化步骤中，使用了来自clostridium histolyticum的I型和VIII型胶原酶作为消化酶12,16,...

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讨论

在本实验方案中，我们建立了一种可重复地培养和表征经辐照的乳腺类器官的方法（图1）。采用20 Gy的辐照剂量，以模拟既往关于肿瘤细胞募集的体内模型5。在乳腺类器官形成前，对乳腺组织进行离体辐照，可单独研究辐射损伤效应，同时避免免疫细胞的继发性浸润。建立体外辐照正常组织模型，可实现实时观察可能参与辐射诱导循环肿瘤细胞（CTC）募集的细胞间相互作用11,12。

严格遵循步骤1.5至1.18对于最大化类器官产量至关重要。我们将浓缩的胶原酶冻存分装液加入消化液中。由于浓缩胶原酶分装液具有高度黏稠性，其加入量可能存在一定差异，从而导致酶活性波动，因此必须密切监测类器官的消化过程，以避免过度消化。使用50 mL离心管进行类器官消化也十分重要，因为这可提供均匀的消化表面积。其他研究曾采用过滤法纯化类器官19,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Laura L. Bronsart 博士提供表达 GFP 和 dTomato 的 RAW 264.7 巨噬细胞。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 #R00CA201304 提供经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% 中性缓冲福尔马林VWR16004-128
抗细胞角蛋白 14 抗体abcamab181595批号: GR3200524-3
牛血清白蛋白SigmaA1933-25G
I 型胶原蛋白Corning354236
梭状芽孢杆菌来源的胶原酶，VIII 型SigmaC2139
I 型胶原酶Gibco17018029
DMEM/F12 培养基Thermofisher11320-033
脱氧核糖核酸酶（DNAse）Roche10104159001
DPBS 缓冲液Fisher14190250
E-钙黏蛋白抗体Cell Signaling24E10批号: 13
胎牛血清（FBS）SigmaF0926
庆大霉素Gibco15750
山羊抗兔二抗abcamab150077绿色
批号: GR3203000-1
山羊抗兔二抗abcamab150080红色
批号: GR3192711-1
Hoechst 33342 染料Fisher62249批号: TG2611041
胰岛素（10 mg/mL）SigmaI9278
胰岛素-转铁蛋白-硒溶液（100 倍浓缩）Gibco51500-056
Matrigel 基底膜（从小鼠 Engelbreth-Holm-Swarm 肉瘤中提取的基底膜）Corning356237
正常山羊血清Vector LaboratoriesS-1000
Nuclon Sphera 96 孔板Thermo174927
PBS 缓冲液VWR10128-856
青霉素-链霉素双抗（Pen/strep）Fisher15140122
鬼笔环肽（Phalloidin）abcamab176757批号: GR3214582-16
紧密连接蛋白 1 抗体NovusNBP1-85047批号: C115428
Triton X-100（4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇）SigmaX100-100ML
胰蛋白酶（Trypsin）Gibco27250-018
Tween-20（聚乙二醇单月桂酸山梨醇酯）SigmaP1379-100ML

参考文献

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