本文介绍一种提取、分离和鉴定线粒体超复合体的方案，该方案最大限度地减少了去垢剂和考马斯亮蓝的使用。此方法在分辨率与酶活性保持之间实现了最佳平衡，同时降低了不稳定蛋白质-蛋白质相互作用丢失的风险。
本文内容
摘要
摘要
氧化磷酸化机器的复合物形成被称为超复合物（SCs）的超分子蛋白质结构，这些结构被认为赋予线粒体结构和功能上的优势。超复合物已在从酵母到哺乳动物的多种物种中被鉴定出来，越来越多的研究报道了其在遗传性和获得性人类疾病中的组织结构破坏。因此，越来越多的实验室对分析超复合物产生了兴趣，但这一过程在方法学上具有挑战性。本文介绍了一种优化的实验方案，结合了蓝色天然电泳（Blue-Native PAGE）和透明天然电泳（Clear-Native PAGE）方法的优点，能够以高效的时间成本分离和分析超复合物。通过这种混合型CN/BN-PAGE方法，使用适量温和去垢剂皂苷（digitonin）提取的线粒体超复合物在电泳开始时短暂接触阴离子染料考马斯亮蓝（Coomassie Blue, CB），而不接触其他去垢剂。这种对CB的短暂暴露能够像传统的BN-PAGE方法一样有效地分离和分辨超复合物，同时避免了高浓度CB对凝胶内活性测定以及超复合物内部不稳定蛋白质-蛋白质相互作用的不利影响。因此，利用该方案可以将精确且快速的凝胶内活性检测与涉及二维电泳、免疫检测和/或蛋白质组学的分析技术相结合，实现对超复合物的深入分析。
引言
线粒体通过氧化磷酸化产生能量，其中呼吸链复合物I-II-III-IV氧化底物并将电子传递给氧气，从而形成质子梯度，驱动ATP合酶（CV）催化ADP磷酸化生成ATP。近年来的大量研究表明，呼吸链复合物并非仅以线性方式单独存在于线粒体内膜中，而是还可组装成超复合物（SCs）结构1,2在哺乳动物线粒体中，超复合物（SCs）以不同的化学计量比存在：CI/CIII2/慢性免疫激活1-4 （称为呼吸体，具有NADH:O₂）2 氧化还原 体外)2, 复合物 I/复合物 III2，以及CIII2/慢性免疫激活1-2 3,4此外，呼吸链复合物以游离形式和超复合物（SCs）结构存在的比例各不相同。因此，据估计，85%–100%的复合物I（CI）、55%–65%的复合物III（CIII）以及15%–25%的复合物IV（CIV）存在于超复合物中。4这些超分子结构被认为能够减少活性氧（ROS）的产生，稳定或协助各复合物的组装，调控呼吸链活性，并防止蛋白质在富含蛋白质的线粒体内膜中发生聚集。5,6,7,8其在能量需求变化时的重塑能力及其在疾病发病机制中的重要性正在多个实验室中被研究。3,7,9,10,11,12,13,14研究表明，线粒体嵴膜（SCs）组装的病理改变存在于多种疾病中，包括但不限于心磷脂合成的遗传缺陷15，心力衰竭16缺血-再灌注17糖尿病12，以及衰老18.
天然电泳和免疫检测已广泛应用于超分子复合物（SCs）研究，以解析氧化磷酸化（OXPHOS）复合物的四级结构排列2,19,20,21。天然电泳还可进一步结合凝胶内特异性活性检测或二维SDS-PAGE，从而实现对各类SCs组装体的精确分子鉴定1,19。对SCs的研究能力在很大程度上取决于提取条件，包括所用去垢剂的类型和浓度、离子强度和pH值，同时也依赖于电泳迁移条件，如缓冲液组成、考马斯亮蓝（CB）的存在与否、凝胶尺寸以及丙烯酰胺百分比2。
不同文献中关于复合物的实验方案及超复合物（SCs）条带分辨率存在显著差异，导致研究间的比较困难，方法的优化与应用也颇具挑战性22。因此，本文提出一种稳健且优化的实验方案，利用非离子型去污剂皂苷素（digitonin）从不同来源的分离线粒体中提取超复合物（SCs），并实现高分子量超复合物条带的有效分离。通过优化去污剂浓度、提取缓冲液的组成，以及在样品制备过程中避免使用考马斯亮蓝，最大限度地减少了对蛋白质复合物结构的破坏。该方案（详见图1概览）结合了CN-PAGE与BN-PAGE技术，可在大尺寸凝胶上实现超复合物组装结构的最佳分辨率，并适用于凝胶内活性检测，有助于更清晰地观察活性条带，同时可结合免疫检测技术，对超复合物的排列方式与组成进行深入分析。
方案
1. SC 提取
- 配制 100 mL 提取缓冲液（见 表2通过将EDTA溶于水中来配制。加入KOH调节pH值至完全溶解，再用HCl调节pH至7.5。将剩余组分加入溶液中，加水定容至最终体积，并置于冰上保存。在离心管中，将皂苷素（digitonin）溶于提取缓冲液中配制成10%的储存液，充分涡旋至完全溶解后，置于冰上保存。
注意：提取缓冲液可预先配制，4 °C 保存，最长不超过 2 个月。若凝胶底部开始出现波浪状条带，表明提取缓冲液已过期。配制 10% 数字化皂苷（digitonin）溶液时，若使用小鼠肝脏线粒体，应按每份样品 500 µL 计算储备液体积。数字化皂苷的溶解度因来源和产品批次而异（见 材料清单). - 采用标准方案从动物组织（小鼠心脏、肌肉、肝脏；大鼠心脏）或细胞（人成纤维细胞）中分离线粒体23,24,25 可用于提取SCs。获得线粒体后，根据制造商的建议，使用二辛可宁酸试剂盒定量蛋白质含量。在此步骤中，根据需要向分离的线粒体中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂。
注意：超级复合物（SCs）可从新鲜或解冻的线粒体中提取。建议同时从所有样品中提取SCs，以确保它们使用相同批次的溶液并在相同条件下处理。 - 根据获得的线粒体蛋白浓度以及期望的最终毛地黄皂苷/蛋白比例，计算所需的储存液毛地黄皂苷溶液和提取缓冲液的体积 表1用于SC提取，加入1 µL提取缓冲液（表2) 每10 µg线粒体蛋白加入含皂苷（digitonin）的溶液。皂苷与蛋白的比例可在2至8 g/g之间调整。每次使用新的样品类型时，均应进行皂苷滴定实验（参见 图2 （例如）。
- 在1.5 mL离心管中，以16,000 x g离心沉淀线粒体 g 4 °C 下离心 10 分钟。
- 弃去上清液，将线粒体沉淀重悬于含有皂苷的预冷提取缓冲液中，缓冲液体积按计算量加入。将离心管置于微型旋转混合仪上，于4 °C以中等转速孵育30分钟。确保样品充分混匀。
- 以 20,400 x g 离心样品 g 4 °C 下孵育 45 分钟，以去除不溶性碎片。
- 将上清液转移至冰上的新离心管中，并进行蛋白质定量。该组分代表呼吸链超级复合物提取物。若当天不进行电泳，需将样品于 -80 °C 保存。
注意：1）避免提取物经历冻融循环，因为这会破坏联会复合体（SCs）的高级分子结构。如有需要，应在首次冻融循环前将样品分装。2）若要进行标准的BN-PAGE实验，此时应将考马斯蓝（CB）添加至联会复合体（SCs）提取物中。CB的添加量应相对于所用去垢剂的量按1 g∶8 g的比例加入。
2. 梯度凝胶制备与电泳
- 制备用于制备梯度胶的3倍梯度缓冲液和丙烯酰胺储备液，分装后于-20 °C保存（见表3）。
- 制备阳极和阴极缓冲液，并置于4 °C保存（见表5）。
- 打开灌胶室，将一块外层玻璃板（20 cm × 22 cm）放入灌胶室内。使用对齐卡将一组垫片（1.5 mm）定位，确保其紧贴灌胶室的侧边和角落。将内层玻璃板（20 cm × 20 cm）放置在垫片上方（形成胶夹心结构），并在玻璃板上方覆盖一张塑料隔离片。
- 重复步骤3，直至达到所需灌制的胶数量。本方案中灌制4块胶。我们使用的灌胶系统（见材料表）最多可同时灌制10块胶。通过先添加所需数量的丙烯酸块，必要时再添加玻璃板，以填满灌胶室中的剩余空间。
注意：组装必须密封严密；灌胶室内各胶夹心之间不得留有空隙。 - 在密封槽的凹槽中放置一段Parafilm封口膜，然后将密封垫圈牢固地嵌入密封槽内。将密封板装到灌胶室上，并拧紧全部6个螺丝。将灌胶室竖直放置。
- 将梯度混合器置于磁力搅拌器上，并在“轻”混合室中放入磁力搅拌子。将灌胶室的管路连接至梯度混合器，将管路固定在蠕动泵的卡槽中，并确保梯度混合器的旋塞处于关闭状态。
- 为灌制4块胶，于锥形瓶中分别配制60 mL的4%和60 mL的12%凝胶溶液（见表4），充分涡旋混匀。将60 mL的4%凝胶溶液倒入梯度混合器的“轻”混合室，60 mL的12%溶液倒入“重”储液室。将磁力搅拌器转速设为350 rpm，打开旋塞，启动蠕动泵，转速设为35 rpm。
- 当“轻”组分液面低于“重”组分时，暂停泵运行，打开“轻”与“重”储液室之间的阀杆，使两室液体体积平衡后，重新启动泵。
注意：必须确保无气泡进入系统并夹在玻璃板之间。若发生此情况，需拆卸组装，清洗后重新操作。 - 梯度胶完全灌注后，停止泵运行，并在每块胶夹心上方覆盖约1 mL水，以防止胶干燥。室温下聚合2小时。
- 于锥形瓶中配制25 mL浓缩胶，充分涡旋混匀。吸除水层，在每块胶夹心中插入15孔梳子。灌入浓缩胶，室温下聚合2小时。
注意：胶可提前制备并在4 °C保存1周。 - 将胶夹心装入夹具中，取出梳子。将短玻璃板朝下，将胶夹心插入冷却芯中。另一侧重复相同操作，然后将冷却芯放入电泳槽中。
- 向电泳槽内室加入300 mL蓝色阴极缓冲液。 向电泳槽外室加入2 L阳极缓冲液。
注意：电极必须完全浸入阴极缓冲液中，此过程约需300 mL缓冲液。 - 每孔上样量为75 μg至175 μg蛋白。在4 °C冷室中以150 V电压电泳1.5小时（或直至样品全部进入梯度胶）。
注意1：1）每孔至少上样75 μg蛋白，以获得良好的胶内活性条带分辨率；每孔上样超过175 μg蛋白将因酶活性过高而导致条带模糊。2）样品应设置重复孔，以便平行进行胶内活性检测和OXPHOS复合物的免疫印迹分析。平行检测CI、CII、CIV和CV的胶内活性（IGA）至少需要300 μg蛋白；平行进行CI、CII、CIII、CIV和CV的免疫印迹分析至少需要375 μg蛋白。 - 用移液器或真空装置移除蓝色阴极缓冲液，更换为300 mL无考马斯亮蓝的阴极缓冲液，在4 °C冷室中以200 V电压继续电泳过夜（16–20小时）。随后进行步骤3或步骤4，以进行胶内活性检测或免疫印迹分析。
3. 复合物I、II、IV和CV的凝胶内活性检测
- 电泳结束前，根据以下步骤配制凝胶内活性缓冲液 表6，并在室温下避光保存。每3个样品泳道需要20 mL的凝胶活性缓冲液。
注意：本凝胶内CV活性检测基于ATP合酶的逆向活性（即ATP水解），并使用钙作为辅因子，该辅因子会在凝胶中形成沉淀。与其它方案中使用的铅相比，钙的毒性较低。此外，本方案无需对凝胶进行预先活化或预处理。23. - 停止电泳并取出凝胶。如有需要，切下泳道，并将凝胶泳道放入塑料袋中（剪去三边，使塑料袋像书本一样打开）。使用热封机密封三条边中的两条。
注意：为了比较实验组间SC条带的组成，建议将相同样品在同块凝胶上进行重复上样。切割泳道，使每个重复样品分别在不同的凝胶活性缓冲液（CI、II、IV、V）中孵育。为验证检测的特异性，可额外制备重复样品，在凝胶活性检测中加入特定的呼吸链抑制剂。 - 对于3个实验样品（即3个孔），加入20 mL凝胶内活性缓冲液，去除气泡，并密封4th 塑料袋的一侧
注意：若进行阴性对照实验，需添加抑制剂：复合物 I：鱼藤酮 1 µM；复合物 II：丙二酸钠 10 mM；复合物 III：抗霉素 A 8 µM；复合物 IV：氰化钾 0.6 mM；复合物 V：寡霉素 0.5 µM。 - 在37 °C避光孵育凝胶泳道，每15分钟检查一次。孵育时间根据蛋白及复合物的量而有所不同。复合物I（CI）的反应速度比复合物IV（CIV）或复合物V（CV）更快。通常，CI在2小时、CIV在4小时、CII和CV在6小时达到最佳染色效果。
- 用清水冲洗凝胶泳道以终止反应，并在白色背景下成像用于CI、CII、CIV，或在黑色背景下成像用于CV。
注意：凝胶可在室温或4 °C下置于塑料袋中保存数月。
4. 免疫印迹
- 根据表7配制转膜缓冲液，并于室温保存。配制TBST缓冲液，并于室温保存。
- 将整块凝胶或选定的泳道放入容器中，加入含SDS（终浓度0.25%）的转膜缓冲液。将容器置于摇床上，室温孵育1小时。
- 剪取适当大小的PVDF膜（与凝胶尺寸相对应），在20 mL甲醇中振荡活化2分钟。随后更换为20 mL转膜缓冲液，继续振荡处理2分钟。
- 自下而上组装转膜夹心结构，确保凝胶与活化后的PVDF膜之间无气泡：胶盒透明侧 / 黑色海绵 / 滤纸 / 膜 / 凝胶 / 滤纸 / 黑色海绵 / 胶盒黑色侧。关闭并锁紧胶盒。
- 将转膜夹心结构放入转膜槽中，透明侧面向电极的红色端，并加入转膜缓冲液浸没凝胶。连接冷却系统并设定温度为4 °C。连接电源，设定电流为40 mA，运行24小时。
- 取出膜，用含5% BSA的TBST缓冲液封闭1小时，随后在含5% BSA的TBST缓冲液中稀释的一抗溶液中4 °C孵育过夜。
注：所用抗体详见表8。 - 用TBST缓冲液漂洗膜3次，每次10分钟。
- 将膜在含5% BSA的TBST缓冲液中稀释的二抗溶液中室温孵育2小时。
- 用TBST缓冲液漂洗膜3次，每次10分钟。
- 向膜上加入化学发光溶液并进行成像。
5. 分析
- 可以使用凝胶内活性检测图像或免疫印迹来分析 SCs。为了分析条带的组成，需对重复实验结果进行比对，并验证每个特定条带中发生阳性反应的复合物。
- 为了分析不同超分子组装体中复合物的分布情况，请在 ImageJ 中打开图像，并使用凝胶分析工具（示例见图5）。
- 使用矩形工具选择泳道，然后绘制泳道图谱。
- 绘制线条以封闭每个目标条带曲线下方的区域，然后使用魔棒工具点击各个区域，生成包含曲线下面积值的表格。
- 为计算复合物的分布情况，将每条条带的值相对于单体的值进行归一化处理。
结果
图2展示了洋地黄皂苷滴定实验的结果，该实验旨在确定提取超复合物（SCs）所需的合适洋地黄皂苷用量。该用量会因组织/细胞类型的不同以及样品是否经过冷冻而有所变化。本实验采用凝胶内CIV活性检测方法，以观察从新鲜小鼠肝脏线粒体中分离出的超复合物。实验测试了洋地黄皂苷与蛋白质质量比从2/1至10/1的多个比例。对于本样品，洋地黄皂苷的最佳用量为4 g/g，因为该比例可清晰分辨出CIV单体及高分子量超复合物。当比例较低时，电泳条带不清晰，并呈现弥散状；而使用过高的洋地黄皂苷比例则会导致高分子量超复合物的解体。
图3 和 图4 展示了一项完整实验的结果，该实验使用每克蛋白加入4 g皂苷素提取的小鼠肝脏线粒体样品进行。蛋白质通过杂交BN/CN-PAGE、标准BN-PAGE或CN-PAGE分离。三种凝胶在同一时间制备，各泳道加载相同的样品重复。电泳完成后，将各个泳道切下并分别进行凝胶内酶活性测定（图3 中的复合物I、II、IV和V）以及免疫印迹分析（图4 中的复合物I、II、III、IV和V）。
在电泳过程中，向阴极缓冲液中短暂加入CB（即杂交CN/BN-PAGE），或在样品及阴极缓冲液中持续加入CB（即BN-PAGE），与CN-PAGE相比，可显著改善超复合物（SC）条带以及各个呼吸复合物的迁移率和分辨率（图3）。采用凝胶内活性染色后，使用杂交法或BN-PAGE可清晰分辨CIV的条带；而在相同样品经CN-PAGE分离后，超复合物及单体CIV的活性条带均无法识别。
图3 和 图4 表明OXPHOS单体及超分子复合物在杂交CN/BN-PAGE与BN-PAGE中的分辨率和条带模式总体上具有可比性。然而，两者之间存在显著差异。首先，当蛋白质在杂交CN/BN-PAGE条件下分离时，OXPHOS复合物的电泳迁移率略有降低 与 标准BN-PAGE中，由于CB含量减少，导致迁移率变化，这种迁移率变化在CIV单体中最显著，其次是CV单体，以及CI图3 和 图4）。其次，与BN-PAGE相比，杂交CN/BN-PAGE中的蓝色背景较弱图3，左侧泳道）。因此，BN-PAGE 后出现的高背景水平完全掩盖了 CII 的凝胶内活性染色，并增强了与 CIV 二聚体活性相关的背景噪声图3）。第三，与BN-PAGE相比，样品在杂交CN/BN-PAGE条件下运行时，CV的活性更高（图3），由于CB含量降低，而CB已知会干扰CV的催化活性。26 CN/BN-PAGE 还能更好地保留连接蛋白（CV）的超分子组装结构，这体现在与CV二聚体相关的总CV活性比例更高（图3此外，在CN/BN-PAGE中可观察到CV寡聚体，而在BN-PAGE条件下CV寡聚体则完全解离。有趣的是，当样品在CN/BN-PAGE中运行时，在CV单体与二聚体之间也可观察到显示CV活性的不同条带。图2).
图5展示了OXPHOS复合物在超分子组装体中分布的代表性分析结果。该图像显示了来自4种不同健康小鼠肝脏线粒体样品的凝胶活性检测中复合物I（CI）的结果。通过密度测定分析，可测量CI反应性条带曲线下面积，从而呈现CI活性在单体形式（I1）和超分子形式（I1III2、I1III2IV1、I1III2IVn）中的相对分布。类似分析也可在免疫印迹后进行。
图1：检测流程图。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：使用毛地黄皂苷滴定法从新鲜小鼠肝脏线粒体中提取呼吸链超复合物。本示例展示了来自同一只小鼠的肝脏线粒体等分样品，通过逐步增加毛地黄皂苷的浓度来提取呼吸链超复合物。随后采用混合型CN/BN PAGE分离样品，并检测凝胶中细胞色素C氧化酶（CIV）的活性。CIV1：复合物IV单体；CIV2：复合物IV二聚体；SC：超复合物。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：经杂交CN/BN-PAGE、BN-PAGE或CN-PAGE分离后OXPHOS复合物的凝胶内活性。 从小鼠肝脏中分离线粒体，并用洋地黄皂苷（洋地黄皂苷/蛋白质量比为4 g/g）处理以提取呼吸链超复合物。将该样品等分后分别上样至三块不同的凝胶中，进行CN/BN-PAGE、BN-PAGE或CN-PAGE电泳。每块凝胶中的各重复泳道被切下后立即用于凝胶内活性检测（标记为CI、CII、CIV和CV）。其中一条泳道作为空白对照，用于显示考马斯亮蓝染色的背景信号（标记为BG）。OXPHOS复合物及超分子组装体采用标准命名法标注，下标数字表示各OXPHOS复合物的分子化学计量比。需注意的是，含CIII的超分子组装体的位置是基于免疫检测确定的，因为本实验未进行CIII的凝胶内活性检测。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：经杂交CN/BN-PAGE或BN-PAGE后OXPHOS复合物的免疫印迹分析。 来自图3图注中所述实验的重复样本被电转移至同一张膜上。转移后，将各个泳道切开，并分别与特异性识别CI、CII、CIII、CIV和CV的抗体孵育。OXPHOS复合物及超分子组装体采用标准命名法标识，下标数字表示各OXPHOS复合物的分子化学计量比。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：单体及超分子复合物中复合物I（CI）分布的定量分析。 （A）通过混合CN/BN-PAGE分离小鼠肝脏线粒体呼吸链超级复合物（SC）提取物后测定的凝胶内CI活性，样品来自4只小鼠。（B）使用ImageJ的凝胶分析工具获得的密度图，显示对应于CI单体（I1）以及多种含CI的超分子复合物（I1III2、I1III2IV1和I1III2IVn）的不同峰。（C）CI活性相对分布的定量结果。数据表示来自4只小鼠的平均值及标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。
| 皂苷/蛋白比例 (g/g) | 2 g/g | 4 g/g | 6 g/g | 8 g/g |
| 提取缓冲液体积 (µL) | 400 | 300 | 200 | 100 |
| 10% 皂苷储备液体积 (µL) | 100 | 200 | 300 | 400 |
| 总提取缓冲液总体积 (µL) | 500 | 500 | 500 | 500 |
表1：使用不同皂苷素/蛋白比例从5 mg线粒体蛋白中提取SC所需的体积。
| 化合物 | 终浓度 |
| EDTA, pH 7.5 | 1 mM |
| HEPES | 30 mM |
| 乙酸钾 | 150 mM |
| 甘油 | 12% |
| 6-氨基己酸 | 2 mM |
表2：精母细胞提取缓冲液（终浓度）。4 °C 保存，最长不超过3个月。
| 化合物 | 终浓度 |
| 3X 凝胶缓冲液： 分装后于 -20 °C 保存，pH 7.5 | |
| 咪唑/HCl，pH 7.0 | 75 mM |
| 6-氨基己酸 | 1.5 M |
| 丙烯酰胺缓冲液： 分装后于 -20 °C 保存 | |
| 丙烯酰胺 | 99.5% |
| 双丙烯酰胺 | 3% |
表3：凝胶储备缓冲液。
| 用于 2 块胶： | 4% (60 mL) | 12% (60 mL) | 浓缩胶 (4%) (25 mL) |
| 3X 胶缓冲液 | 19.8 mL | 19.8 mL | 8.25 mL |
| 丙烯酰胺缓冲液 | 4.8 mL | 14.4 mL | 2 mL |
| H2O | 35 mL | 13.1 mL | 14.6 mL |
| 甘油 | - | 12 mL | - |
| 10% APS | 360 μL | 60 μL | 150 μL |
| TEMED | 24 μL | 12 μL | 10 μL |
表4：4%–12% 浓度梯度凝胶。
| 化合物 | 终浓度 |
| 阳极缓冲液：4 °C 保存，pH 7.5 | |
| 咪唑 | 25 mM |
| 阴极缓冲液：4 °C 保存，pH 7.5 | |
| Tricine | 50 mM |
| 咪唑 | 7.5 mM |
| 含或不含考马斯亮蓝 (G250) | 0.022% |
表5：电泳缓冲液。
| 化合物 | 终浓度 |
| 复合物 I 活性缓冲液：用 5 mM TRIS-HCl pH 7.4 新鲜配制 | |
| Nitrotetrazolium blue | 3 mM |
| NADH | 14 mM |
| 复合物 II 活性缓冲液：用 5 mM TRIS-HCl pH 7.4 新鲜配制 | |
| Succinate | 20 mM |
| PMSF | 0.2 mM |
| Nitrotetrazolium blue | 3 mM |
| 复合物 IV 活性缓冲液：用 50 mM Na-Phosphate pH 7.2 新鲜配制 | |
| Cytochrome C | 0.05 mM |
| Diaminobenzidine | 2.3 mM |
| ATP合酶活性缓冲液：用水新鲜配制，用 KOH 调节 pH 至 8 | |
| Glycine | 50 mM |
| MgCl2 | 5 mM |
| HEPES | 50 mM |
| CaCl2 | 30 mM |
| ATP | 5 mM |
表6：凝胶内活性检测缓冲液。
| 化合物 | 终浓度 |
| 转膜缓冲液 | |
| Tris Base | 25 mM |
| Glycine | 192 mM |
| SDS | 4% |
| Methanol | 20% |
| TBST | |
| Tris Base | 20 mM |
| NaCl | 137 mM |
| Tween 20 | 0.1% |
表7：免疫印迹缓冲液。
| 复合物 | 亚基 | 克隆 |
| I | NDUFA9 | 20C11B11B11 |
| II | SDHA | 2E3GC12FB2AE2 |
| III | UQCRC2 | 13G12AF12BB11 |
| IV | COX4 | 1D6E1A8 |
| V | ATPB | 3D5 |
表8：用于免疫印迹检测呼吸链超复合物的抗体。 公司名称与批号详见材料表。
讨论
线粒体超复合物目前正被广泛研究，以阐明其生理功能以及在多种人类疾病（无论是获得性还是遗传性线粒体疾病）发病机制中的重要性3,7,9,10,11,12,13,14。为了获得可靠的结果，需要考虑多个方面。本方案已在小鼠肝脏线粒体、小鼠骨骼肌线粒体（结果未展示）、大鼠心脏线粒体以及人成纤维细胞线粒体（结果未展示）中进行过测试，但显然也可适用于其他来源的分离线粒体。该方法最优地结合了BN-PAGE和CN-PAGE方案的多个方面，与已发表的方案相比，可将线粒体对去垢剂和阴离子化合物的暴露程度降至最低20,27,28。
样品制备
样品制备是成功分离合胞体（SCs）的关键步骤。应谨慎选择缓冲液的组成，以实现蛋白质及其复合物的有效溶解，同时尽可能保持其功能和结构的完整性。提取缓冲液的离子强度和pH是两个需要考虑的重要因素。过低的盐浓度（< 50 mM 醋酸钾或NaCl）会导致在非离子型去垢剂存在下蛋白质溶解效果不佳；而盐浓度超过500 mM则会促进蛋白质堆积/聚集，并导致中间体（CB）和蛋白质沉淀29。因此，应使用接近生理离子强度的缓冲液提取合胞体（SCs）。关于pH，建议采用接近生理pH的条件。
去垢剂类型及去垢剂与蛋白质的比例对于获得最佳超分子复合物（SC）提取效果也至关重要。为了最大程度地保留天然状态的SC，优先选用皂苷素（digitonin）26。如本实验方案及其他已发表方法所示23,30,31,32，这种温和的去垢剂能够保持多种SC组装体的超分子组成，以及ATP合酶的二聚体和寡聚体结构（图3 和 图4）。对目标样品使用不同浓度的皂苷素进行滴定至关重要，以确定在保持酶活性和生理状态下蛋白质相互作用的同时实现最佳溶解效果的条件。滴定应采用2至8 g/g范围内的比例26。对于肝脏、骨骼肌和心肌线粒体，分别在使用4、5和6 g digitonin/g蛋白时获得最佳结果。需要注意的是，Triton X-100可在优化条件下替代皂苷素，其所得SC迁移行为和组成与使用皂苷素时相似2。然而，使用该去垢剂需格外谨慎，因为去垢剂与蛋白质比例的相对较小增加（例如从1增至1.5 g/g）即可导致SC组装体完全解离2，从而引起实验结果不一致。传统上，在将样品上样至凝胶前会添加考马斯亮蓝（Coomassie Blue），以赋予蛋白质电荷，但传统非变性凝胶电泳（CN-PAGE）除外20,26。为尽量减少蛋白质暴露于考马斯亮蓝以及不稳定蛋白质可能发生解离的风险，本方案中不在样品中添加考马斯亮蓝。
电泳
CN-PAGE 和 BN-PAGE 均已被用于研究线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）复合物，各自具有不同的优势和局限性。CN-PAGE 采用的条件较为温和（主要是不含考马斯亮蓝（CB），而 CB 具有类似去垢剂的作用），有助于更好地保留 ATP 合酶在凝胶中的活性，并减少高分子量超复合物（SCs）和 ATP 合酶组装体中不稳定蛋白的解离26。然而，由于蛋白提取物和电泳缓冲液中缺乏阴离子染料 CB，蛋白的迁移依赖于其固有电荷和等电点，从而降低了蛋白在凝胶中的电泳迁移率26。此外，在缺乏 CB 的情况下，带负电荷不足的蛋白容易发生聚集，进而降低凝胶中蛋白复合物的分辨率20,26。为克服这些局限性，Wittig 和 Schragger 开发了所谓的高分辨率 CN-PAGE 方法20。在该方案中，将脱氧胆酸钠（DOC）以及多种温和的非离子型去垢剂（如 DDM、Triton X100）添加至阴极缓冲液中，以维持膜蛋白的可溶性，并使蛋白带上负电荷，从而显著提高分辨率20。
当前这种杂交CN/BN方案的一个显著特点是，无需使用这些去污剂即可达到相当的分辨率。在电泳开始时，仅需在阴极缓冲液中短暂加入考马斯亮蓝（CB），就足以限制蛋白质聚集并提高其在凝胶中的迁移能力（图3 和 图4）。因此，该杂交技术能够实现对不同呼吸链超复合物（SC）组装体的优异分辨，同时使样品几乎不或完全不暴露于去污剂。凝胶中存在少量CB还有助于更好地保留细胞色素c氧化酶（CV）活性，更有效地维持CV二聚体和寡聚体结构的完整性（图3 以及 Wittig 和 Schägger 200526），并减少可能干扰凝胶内酶活性定量的蓝色背景噪声，尤其是对复合物II（CII）和复合物IV（CIV）而言（图2）。此外，在蛋白质提取过程中不添加CB，有助于减少对超复合物内不稳定蛋白相互作用的破坏。例如，ATP合酶与腺苷酸转位酶（ANT）的物理结合形成“合成体”（synthasome）33，或与亲环素D（Cyclophilin-D）结合以调控通透性转换孔（PTP）的开放34，在无CB条件下更易被观察到。因此，仅在电泳过程中短暂接触CB可能有助于揭示超复合物内部新的蛋白质相互作用。总体而言，这种杂交的CN/BN-PAGE方案使得精确且快速的凝胶内活性测定能够与二维电泳、免疫检测和/或蛋白质组学等分析技术相结合，从而实现对超复合物的深入分析。值得注意的是，随着对超复合物研究兴趣的日益增长，越来越多的研究采用较小的10 × 10 cm凝胶进行天然PAGE。尽管这种方法可能足以识别超复合物组装体丰度的明显变化，但小尺寸凝胶较低的分离能力可能难以分辨细微的结构重排，也不利于切取独立条带用于蛋白质组学分析。此外，已有若干使用较小凝胶的研究报道，呼吸体（respirasome）的迁移大小与ATP合酶二聚体相同，导致二者难以区分22。因此，应优先选用大尺寸凝胶。
致谢
作者感谢Jenna Rossi在技术方面的协助，以及Mireille Khacho博士、David Patten博士和Ujval Anil Kumar博士在本方法开发过程中提供的有益讨论。本研究由加拿大卫生研究院（CIHR）和加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）资助。AC获得了加拿大研究生奖学金——弗雷德里克·班廷和查尔斯·贝斯特博士奖（CIHR）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐水合物 | Sigma | D5637 | |
| 6-氨基己酸 | sigma | A2504 | |
| 丙烯酰胺 | Sigma | A3553 | |
| 腺苷-5'-三磷酸二钠盐水合物 | sigma | A3377 | |
| 抗ATPB抗体 [3D5] - 线粒体标记物 | Abcam | ab14730 | 批号 GR3174539-12, RRID AB_301438 |
| 抗SDHA抗体 [2E3GC12FB2AE2] | Abcam | ab14715 | 批号 GR3235943-1, RRID AB_301433 |
| 抗UQCRC2抗体 [13G12AF12BB11] | Abcam | ab14745 | 批号 GR304308-3, RRID AB_2213640 |
| 双丙烯酰胺 N,N'-亚甲基双丙烯酰胺 | Biorad | 1610201 | |
| 亮蓝G | Sigma | 27815 | |
| COX4单克隆抗体 (1D6E1A8) | Invitrogen | 459600 | 批号 TI2637158, RRID AB_2532240 |
| 马心细胞色素c | sigma | C7752 | |
| 皂苷 | Sigma | D141 | |
| Fisherbrand FH100M多通道蠕动泵 | Thermo Fisher | 13-310-660 | |
| 咪唑 | Sigma | I0250 | |
| 内层玻璃板，每包2片，20 x 20 cm，适用于20 cm PROTEAN II xi和PROTEAN II XL电泳槽，需与外层板配合使用 | Biorad | 1651823 | |
| 485型梯度混合器，40-175 ml丙烯酰胺梯度混合器，包含阀杆和管路套件，适用于Mini-PROTEAN多槽灌胶系统 | Biorad | 1654120 | |
| NDUFA9单克隆抗体 (20C11B11B11) | Invitrogen | 459100 | 批号 TD2536591, RRID AB_2532223 |
| 氯化硝基四氮唑蓝 | Sigma | N6639 | |
| 外层玻璃板，每包2片，22.3 x 20 cm，适用于20 cm PROTEAN II xi和PROTEAN II XL电泳槽，需与内层板配合使用 | Biorad | 1651824 | |
| 苯甲基磺酰氟 | Sigma | P7626 | |
| Powerpack 1000 | Biorad | 序列号 286BR 07171 | |
| PROTEAN II夹具，每包2个，用于运行凝胶，适用于20 cm PROTEAN II xi电泳槽，含左、右夹各一个 | Biorad | 1651902 | |
| PROTEAN II xi电泳槽，大尺寸垂直电泳槽，凝胶尺寸16 x 20 cm，可同时运行4块凝胶，含垫片和梳子 | Biorad | 1651811 | |
| PROTEAN II xi梳子，每包1个，15孔，1.5 mm厚度，适用于PROTEAN II xi电泳槽 | Biorad | 1651873 | |
| PROTEAN II xi多凝胶灌胶室，多凝胶灌胶室，凝胶尺寸20 x 20 cm，最多可制备10块1.5 mm厚凝胶，包含密封板、垫圈、隔离片、丙烯酸块和PROTEAN II XL对齐卡 | Biorad | 1652025 | |
| PROTEAN II xi垫片，每包4个，1.5 mm厚度，适用于20 cm PROTEAN II xi电泳槽 | Biorad | 1651849 | |
| SCIENCEWARE工具袋 (10 x 12") 4 mil，Bel-Art，每盒100个 | VWR | 11215-388 | |
| 厚型印迹纸，每包25张，15 x 20 cm，吸水滤纸，适用于Trans-Blot夹 | Biorad | 1703956 | |
| 带平板电极和超级冷却线圈的Trans-Blot转移槽，包含转移槽和冷却线圈(#170-3912)，2个凝胶夹、缓冲液槽、带电缆的盖子、纤维垫和1包印迹纸 | Biorad | 1703939 |
参考文献
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