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方法文章

用于免疫组织化学、Western 印迹分析和 RNA 提取的 Drosophila 蛹期视网膜解剖

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DOI：

10.3791/59299

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2019年3月15日

 , 
1Department of Biology, Wesleyan University

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于解剖的手术方法 果蝇 蛹期视网膜，以及用于免疫组织化学、蛋白质印迹分析和RNA提取的组织处理方案。 

摘要

这 果蝇 蛹期视网膜为研究发育过程中形态发生过程提供了优良的模型系统。本文介绍了一种可靠且精细的蛹期视网膜解剖实验方案 果蝇 蛹期视网膜。我们的手术方法利用 readily-available 微解剖工具打开蛹体，精确分离出眼-脑复合体。若目标是检测细胞或亚细胞结构，可将复合体固定后进行免疫组织化学处理，随后将视网膜置于载玻片上并成像。或者，也可从未固定的样本中将视网膜从脑组织中分离，用适当的缓冲液裂解，用于蛋白质凝胶电泳或 mRNA 提取（分别用于检测蛋白或基因表达）。掌握所述微解剖方案可能需要大量练习和耐心，但一旦熟练掌握，即可相对快速地分离出基本无损伤的视网膜。

引言

Drosophila 视网膜由大约 750 个小眼组成，这些小眼被排列成蜂窝状晶格的色素细胞所包围1,2,3,4。每个小眼包含八个光感受器神经元、四个分泌晶状体的锥形细胞和两个初级色素细胞。每个小眼周围还分布着产生色素的晶格细胞和感觉刚毛群。由于其有丝分裂后特性和典型的六边形排列结构，Drosophila 蛹期视网膜为研究形态发生过程（包括细胞黏附5,6,7,8,9,10和细胞凋亡11,12,13,14,15）提供了一个极佳的模型系统。 

已有若干已发表的实验方案利用气压法从黑腹果蝇（Drosophila）蛹中提取眼脑复合体16,17,18。本文所述方案则采用显微解剖工具，以精细且准确的方式分离眼脑复合体，旨在获得无损伤的视网膜组织。若视网膜将用于形态学、蛋白质或基因表达分析，则这一点至关重要，因为视网膜的损伤可能引发细胞应激或死亡，从而改变细胞表型或基因表达。此外，经过练习后，可在10至15分钟内分离出6至10个眼脑复合体，有助于最大限度减少所获取眼组织在年龄和发育阶段上的差异。

以下所述的固定、免疫染色及整体装片方案适用于制备果蝇（Drosophila）眼睛以进行荧光显微镜观察。视网膜可与靶向目的蛋白的抗体进行孵育。例如，可利用针对黏附连接组分的抗体来显示细胞的顶端周缘，从而评估细胞类型、形状和排列等特征19。在固定前，眼睛也可从脑部分离，用于提取蛋白质以进行Western印迹分析，或提取RNA用于qRT-PCR或RNA测序。

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方案

1. 组织制备

  1. 设置 果蝇 杂交（如前所述）20或培养物特异性 黑腹果蝇 建立果蝇培养物以获得所需基因型的蛹。为确保大量蛹同步羽化，应在富含营养的培养基或添加了足量酵母糊的标准培养基上设置两份平行培养。
  2. 维持 果蝇 在25 °C下培养。对于利用UAS-GAL4系统的杂交实验， GMR-GAL4 是在形态发生沟后方幼虫眼盘细胞中以及整个蛹期发育过程中表达的理想驱动基因21,22,23,24交叉 UAS-lacZ X GMR-GAL4 可作为理想的对照杂交，因其可驱动非内源性且无活性的β-半乳糖苷酶蛋白的表达。
  3. 使用经蒸馏水润湿的6英寸竹签尖端轻轻挑起白色预蛹（图1B) 从健康培养瓶的一侧图1A）并放入一个1.5 mL微量离心管中（图1C).
  4. 将试管放入塑料移液器吸头盒中，并放入一小块浸有蒸馏水的组织，以维持足够的湿度，防止蛹体干燥图1D在25 °C下培养蛹直至解剖。
  5. 使用一根干燥的6英寸竹签轻轻将蛹从微量离心管中推出，置于黑色解剖皿上。在远离蛹的位置，于解剖皿上放置一片新的双面胶带。
  6. 使用镊子小心地将蛹背面向上放置（即蛹盖朝上） 图1B）转移到胶带（图 2A）。确保蛹牢固地粘附在胶带上。
    注意：蛹壳表面的水分会抑制其在胶带上的牢固粘附；若出现此情况，应将蛹置于空气中干燥后再粘附到双面胶带上。

2. 眼脑复合体的解剖

  1. 用镊子取下每只蛹的盖片（图 2C）。
  2. 使用显微解剖剪切开或剪开每只蛹的蛹壳。将蛹壳掀开，暴露头部、胸部和腹部前段，并将蛹壳边缘固定在双面胶带上（图 2C）。
    注意：无需完全暴露蛹体。
  3. 用尖头镊子刺穿每只蛹的腹部以夹住个体，并将其从蛹壳中取出（图 2C）。
  4. 将蛹置于黑色解剖皿中，远离胶带，并加入约 400 µL 冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）覆盖。
  5. 用镊子夹住每只蛹的腹部，使用显微解剖剪在整个胸部进行整齐的横切，将蛹体切成两半（图 2D）。
  6. 将每具蛹体后段残余部分从 PBS 中取出，放置在解剖皿一侧（请勿丢弃，参见步骤 3.2.1）。
  7. 使用两把精细镊子，打开每只蛹的胸部和头部以暴露眼脑复合体（图 2E）。操作时，夹住胸部上皮的切口边缘，逐步撕开胸部，然后撕开头壳，从而暴露眼脑复合体及其周围的脂肪组织。
  8. 在不直接夹取组织的情况下，用镊子将眼脑复合体从头壳残余部分移开，或将其从撕开的头壳中轻轻舀出。
    注意：眼脑复合体呈哑铃形，颜色为乳白色，比周围乳黄色的脂肪组织更透明（图 2B、E）。
  9. 用镊子小心去除与眼脑复合体相连的大部分脂肪组织，避免接触眼部组织。

3. 免疫荧光组织处理

  1. 按照所述方法解剖至少6-10只蛹（步骤2.1-2.9）。
    注意：每次解剖通常进行3至4次独立重复实验，以获得足以验证假设的数据。
  2. 洗涤与固定
    1. 使用洁净的剃刀片切割P20或P100移液枪头的尖端，使开口半径扩大至约1 mm，并通过反复吸取PBS与脂肪混合物进行润滑。该脂肪可从步骤2.6中移除的残余组织中获取。
    2. 将眼-脑复合体转移至盛有约400 µL PBS的9孔玻璃培养皿中，置于冰上。使用已润滑的枪头及P20或P100空气置换移液器进行转移。
      注意：若枪头未润滑，眼-脑复合体会在移液过程中黏附于枪头，导致组织损伤或丢失。
    3. 通过反复吸取PBS使眼-脑复合体轻柔旋转，以去除与眼组织相连的残余脂肪。在此步骤及后续所有洗涤步骤中，切勿直接反复吸取眼-脑复合体，以免损伤脆弱的眼组织。
    4. 将眼-脑复合体以最小体积（<20 µL）的PBS转移至至少250 µL固定液中。通过反复吹打混匀溶液，在冰上孵育35 分钟。
      注意：可使用步骤3.1.1中制备的同一润滑枪头完成此转移。
    5.  使用同一移液枪头将眼-脑复合体转移至另一孔中，该孔含有约400 µL PBS。通过反复吹打混匀溶液，在冰上孵育5-10分钟以进行洗涤。至少重复洗涤两次。
      注意：在进入步骤3.3.1之前，眼-脑复合体可在最后一次PBS洗涤液中于冰上或4 °C保存数小时。
  3. 抗体染色
    1. 为在抗体溶液处理前封闭组织，将眼-脑复合体转移至约400 µL PBT中。使用润滑枪头及P20或P100空气置换移液器进行转移。在冰上孵育10至60分钟。
    2. 通过将适当的抗体稀释于PBT中，配制一抗溶液。由于眼-脑复合体将被孵育于10 µL一份的抗体溶液中，因此所配制的总体积应为10 µL的整数倍。
    3. 取10 µL抗体溶液分装至72孔微孔板的洁净孔中（参见讨论部分）。
    4. 使用洁净的剃刀片切割P10移液枪头尖端，使开口半径扩大至约0.5 mm，并通过反复吸取PBT进行润滑。
    5. 使用P10空气置换移液器及已润滑枪头，将不超过5个眼-脑复合体以小于<3 µL PBS的体积转移至每份10 µL的抗体溶液孔中。
    6. 通过反复吹打使抗体溶液均匀混合。切勿反复吹打眼-脑复合体，以免损伤组织。
    7. 为减少抗体溶液蒸发，可在微孔板内放置一小块浸有蒸馏水的组织，并密封微孔板（例如使用配套盖子）。于4 °C孵育过夜。
    8.  将眼-脑复合体从微孔板转移至9孔玻璃培养皿中约400 µL PBT中进行洗涤。使用P10空气置换移液器及PBT润滑枪头（按步骤3.3.4所述方法制备）。通过反复吹打混匀溶液，在冰上孵育5-10分钟。
    9. 至少重复洗涤两次。使用P20或P100空气置换移液器及PBT润滑枪头在不同洗涤液之间转移眼-脑复合体。
    10. 根据需要将合适的荧光标记二抗稀释于PBT中，配制二抗溶液。每批6-10只蛹使用100 µL二抗溶液已足够。将二抗溶液分装至9孔玻璃解剖皿中。
    11. 将眼-脑复合体转移至二抗溶液中。使用P20或P100空气置换移液器及PBT润滑枪头进行转移。
    12. 在室温下孵育1-2小时，或在4 °C孵育3-5小时。为防止荧光染料被光漂白，应用铝箔包裹样品。
      注意：二抗孵育的最佳时间可能因所使用的一抗和二抗种类而异。
    13. 将眼-脑复合体转移至9孔玻璃培养皿中约400 µL PBT中进行洗涤。通过反复吹打混匀溶液，在冰上孵育5-10分钟。此洗涤步骤至少重复两次。
  4. 二次固定
    1. 进行二次固定时，将眼-脑复合体转移至至少200 µL固定液中，在室温下孵育20分钟，或在4 °C孵育35分钟。
      注意：二次固定可使眼组织变硬，有助于后续封片（步骤3.5）。
    2. 使用P20或P100空气置换移液器及PBT润滑枪头，将眼-脑复合体转移至9孔玻璃培养皿中约400 µL PBT中，在冰上洗涤5分钟。
    3. 至少重复洗涤一次。
    4. 使用P20或P100空气置换移液器及PBT润滑枪头，将眼-脑复合体转移至9孔玻璃培养皿中约400 µL PBS中，在冰上漂洗1-2分钟。通过反复吹打PBS（而非组织本身）使组织保持悬浮状态，防止眼-脑复合体在PBS漂洗过程中沉降并黏附于玻璃皿底部。
  5. 封片
    1. 将眼-脑复合体转移至约200 µL封片剂中。使用P20或P100空气置换移液器及PBT润滑枪头进行转移。让组织在封片剂中平衡1-2小时。
    2. 在洁净的显微镜载玻片上滴加5-8 µL新鲜封片剂。
    3. 使用洁净的剃刀片切割P10枪头，使开口半径扩大至约0.5 mm，配合P10空气置换移液器，将含5-8 µL封片剂的眼-脑复合体转移至载玻片上的封片剂液滴中。
    4. 使用两根钨针将眼睛与视叶分离。用较粗的钨针将一个眼-脑复合体固定在载玻片上，再用细钨针将每只眼睛从其相连的视叶上切下（图 2F）。
    5. 使用细钨针将每只眼睛调整至载玻片表面，使每只眼睛的基底面紧贴载玻片。轻轻盖上洁净的盖玻片，并用指甲油封固。
      注意：将眼睛排列得彼此靠近或呈直线排列，有助于后续显微成像。
    6. 使用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察视网膜。
      ​注意：若不立即成像，载玻片应存放于4 °C。

4.  用于蛋白质印迹分析的眼组织制备：

  1.  解剖10-16只蛹（步骤2.1-2.9），并作如下修改：a) 分两批收集和解剖蛹，间隔10-15分钟；b) 在添加了蛋白酶和磷酸酶抑制剂的磷酸盐缓冲液（PBS+pi）中进行解剖。
  2. 使用P20或P100空气置换移液器及润滑过的吸头（按步骤3.2.1制备），将眼-脑复合体转移至置于冰上的9孔玻璃培养皿中约400 µL的PBS+pi溶液中，短暂漂洗。
    注意：该润滑吸头可用于后续步骤4.3和4.4。
  3. 重复漂洗步骤两次。
  4. 将所有眼-脑复合体转移至已倾倒于洁净黑色解剖皿上的约400 µL冰冷PBS+pi溶液中。
  5. 使用坚固的钨针（用于固定眼-脑复合体）以及精细剃刀刀片或显微解剖剪刀，将每只眼从视叶上干净地切下。
    注意：此阶段眼睛具有“粘性”，可能会轻微附着在解剖皿表面。这一特性有利，有助于将眼睛从视叶上分离（见讨论部分）。
  6. 使用一对精细镊子的一侧刀口，将所有眼睛在解剖皿的PBS+pi溶液中“扫”成一堆。
  7. 用干净的剃刀刀片切割P10吸头，使吸头开口半径扩大至约0.5 mm，并通过反复吸取Western组织裂解缓冲液（WTLB）润滑吸头内壁。
  8. 使用该润滑吸头和P10空气置换移液器，将眼-脑复合体以5 µL PBS+pi转移至一个500 µL微量离心管中。
  9. 将微量离心管置于冰上，向样品中加入等体积（5 µL）的WTLB，以及10 µL 2倍浓度的蛋白上样缓冲液（或2.5 µL 5倍浓度的蛋白上样缓冲液），通过轻弹管壁混匀。
  10. 短暂涡旋震荡微量离心管，然后使用台式迷你离心机离心沉降样品。
  11. 将样品储存于-20 °C直至分析，按标准流程进行检测。

5. 用于RNA提取的眼组织制备：

  1. 佩戴手套后，先用70%乙醇，再用RNase去污染试剂清洁实验台面、显微镜、解剖工具和黑色解剖皿。静置晾干。
  2. 按照上述方法（步骤 2.1–2.9）解剖 30–40 个蛹，但作如下修改：a）分批收集并解剖蛹，每批 6 至 8 个，间隔 15–20 分钟；b）在无核酸酶的 PBS 中进行解剖；c）每批眼睛单独分离，但将所有视网膜组织收集至同一微量离心管中（步骤 5.5）。
    注意：由两人同时进行解剖可加快高效分离出优质眼组织。
  3. 每批样品中，分离眼脑复合体（步骤 2.1–2.9），并用 P20 或 P100 空气置换移液器配合润滑枪头（按步骤 3.1.2 所述方法制备），将样品转移至盛有约 400 µL 无核酸酶 PBS 的 9 孔玻璃培养皿中，冰上短暂漂洗。
    注意：此润滑过的尖端可用于后续步骤 5.4、5.5 和 5.8。
  4. 重复洗涤步骤两次。
  5. 将眼-脑复合体转移至洁净的黑色解剖皿中一个新鲜的400 µL冰上预冷的无核酸酶PBS液滴中。
  6. 使用坚固的钨针（用于固定眼脑复合体）和精细的剃刀刀片或显微解剖剪，将每只眼睛从视叶上完整剥离。
    注意：此阶段眼球具有“黏性”，可能会轻微黏附在解剖皿上。这一特性具有优势，有助于将眼球从视叶中分离（见讨论部分）。
  7. 使用精细镊子的一侧刀口，将解剖皿中无核酸酶的PBS内的所有眼球扫集成堆。
  8. 将眼睛组织转移至无菌无RNase的微量离心管中，并在液氮中速冻。
  9. 重复解剖每批蛹（步骤5.3-5.8）。将每批眼睛转移至 相同 置于液氮中保存的微量离心管（步骤5.5），用于收集所有眼球至同一管中。
  10. 将样品于 -80 °C 保存，直至进行 RNA 提取。

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结果

蛹眼是一种易于获取的组织，是研究驱动形态发生发育过程的优良模型。在此，我们解剖了视网膜，并利用免疫荧光标记检测顶膜粘附连接（图3A、C）或凋亡过程中被激活的Dcp-1 凋亡蛋白酶（图3D）（图3）25。这些方法可清晰地观察关键形态发生过程中的细胞行为，包括初级细胞的招募与形态发生（自18 h APF起）、每个小眼周围晶格细胞的嵌合（18–24 h APF）、三级生态位的建立（21–24 h APF）、细胞大小与形状的变化（18–40 h APF）以及细胞凋亡（18–约33 h APF）。这些形态发生事件的发生时间具有温度依赖性，因此在不同实验室条件下，培养箱温度的微小差异将导致其时间进程略有不同。然而，大约在40 h APF时，细胞的最终排列通常已形成（图3B、C），这是评估基因突变或基...

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讨论

Drosophila 蛹眼解剖方法如本文所述，可在 10 至 15 分钟内分离出 6 到 10 个眼-脑复合体。然而，掌握解剖技术并提高解剖质量和速度需要耐心与练习。较短的解剖时间可确保每个眼睛大致处于相同的发育阶段，从而减少数据集中视网膜表型或基因表达的变异性。尽管其他替代方案可能更容易掌握，但本方案旨在系统性地分离脆弱的视网膜组织，同时最大限度地降低撕裂或剪切的风险，因为眼睛的损伤可能激活应激通路，甚至导致细胞死亡。我们建议初学者首先掌握培养至 40 小时 APF 的蛹的解剖，再尝试解剖更年轻的样本。我们建议为所有实验设置重复杂交组（步骤 1.1），以确保始终有足够数量的蛹可供收集（步骤 1.3）。根据研究人员关注的不同形态发生事件，可在蛹发育过程中的多个时间点进行视网膜解剖。这些事件可能包括初级细胞的招募与形态发生（18 小时 APF 起）、晶格细胞的嵌合（18–24 小时 APF）、三级微环境的建立（21–24 小时 APF）、细胞大小和形状的变化（18 至 40 小时 APF）以及细胞凋亡（18 至约 33 小时 APF）（图 3A）。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Zack Drum和我们的审稿人对稿件提出的宝贵意见。本工作由R15GM114729项目资助。 

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Adobe PhotoshopAdobe图像处理软件
Bamboo splints, 6" Ted Pella Inc116
β-巯基乙醇Sigma-AldrichM3148
β-甘油磷酸Sigma-Aldrich50020
黑色解剖皿玻璃培养皿，用SYLG170或SYLG184（加入细磨活性炭粉末染成黑色）填充至边缘。室温下静置24–48小时以聚合。
刀片夹持器Fine Science Tools10053
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA7906
cOmplete，无EDTA蛋白酶抑制剂混合片剂Roche4693132001
共聚焦显微镜（Zeiss LSM 501）Carl Zeiss或类似显微镜
焦碳酸二乙酯（DEPC）Sigma-Aldrich40718
双面胶带3M665
Drosophila 食物培养基，营养丰富 7.5% 蔗糖，15% 葡萄糖，2.5% 琼脂，20% 啤酒酵母，5% 蛋白胨，0.125% MgSO4·7H2O，0.125% CaCl2·2H2O
Drosophila 食物培养基，标准配方Bloomington 果蝇品系中心玉米粉配方。 （https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html）
乙二胺四乙酸Sigma-AldrichE6758
固定液4% 多聚甲醛溶于PBS，pH 7.4。
荧光显微镜（TCS SP5 DM 显微镜）Leica Microsystems或类似显微镜
镊子 Fine Science Tools91150-20应频繁打磨以保持锋利。
甲醛Thermo Scientific28908
玻璃9孔板 Corning7220-85也称为9孔板 
玻璃盖玻片（22 × 22 mm）Fisher Scientific12-542-B
玻璃载玻片（25 × 75 × 1 mm）Fisher Scientific12-550-413
玻璃培养皿Corning3160-100BO
甘油Sigma-AldrichG5516
Image Studio 软件版本 5.2.5LI-COR Biosciences用于Western印迹定量的图像处理软件。
Laemmli 样品缓冲液Bio-Rad161-07372×浓缩蛋白样品缓冲液，根据制造商说明添加β-巯基乙醇。
Lane marker 还原型样品缓冲液 ThermoFisher Scientific390005×浓缩蛋白样品缓冲液。
微量离心管 AxygenMCT-175-C
显微解剖剪 Fine Science Tools15000-03
微孔板（72 × 10 µL 孔）Nunc438733
封片剂含0.5% N-丙基没食子酸和80%甘油的PBS溶液
N-丙基没食子酸Sigma-AldrichP3130
无核酸酶PBS（含0.1% DEPC的PBS，pH 7.4）将适量DEPC加入PBS中，充分混匀，并在室温下持续搅拌过夜。高压灭菌至少20分钟。4°C保存
PBS（磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4）Sigma-AldrichP5368根据制造商说明配制
PBS+pi（含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的PBS）含10 mM NaF、1 mM β-甘油磷酸和1 mM Na3VO4的PBS溶液，pH 7.4。  
PBT含0.15% TritonX 和 0.5% 牛血清白蛋白的PBS溶液，pH 7.4
针夹Fine Science Tools26016-12
一抗：山羊抗GAPDHImgenexIMG-3073用于Western印迹，使用稀释比例为1:3000
一抗：兔抗cleaved Dcp-1Cell signaling9578S用于免疫荧光，使用稀释比例为1:100
一抗：大鼠抗DEcadDevelopmental Studies Hybridoma BankDCAD2用于免疫荧光，使用稀释比例为1:20
一抗：大鼠抗DEcadDOI: 10.1006/dbio.1994.1287DCAD1 由Tadashi Uemura惠赠。使用稀释比例为1:100。
RNA提取试剂盒：Relia Prep RNA组织小型提取试剂盒 PromegaZ6110
RNase去污染试剂（RNase Away）Molecular BioProducts7002
手术刀片Fine Science Tools10050折断一小段刀片并固定于刀片夹持器中。
二抗：488标记驴抗大鼠IgG（H+L） Jackson ImmunoResearch712-545-153用于免疫荧光，使用稀释比例为1:200
二抗：Cy3标记山羊抗兔IgG（H+L）Jackson ImmunoResearch111-165-144用于免疫荧光，使用稀释比例为1:100
二抗：HRP标记山羊抗大鼠IgG（H+L）Cell Signaling Technology7077用于Western印迹，使用稀释比例为1:3000
二抗：HRP标记兔抗山羊IgG（H+L）Jackson ImmunoResearch305-035-003用于Western印迹，使用稀释比例为1:3000
氯化钠Sigma-AldrichS3014
氟化钠Sigma-Aldrich215309
钒酸钠Sigma-Aldrich50860
分光光度计（NanoDrop）ThermoFisher Scientific2000c 
体视解剖显微镜（M60 或 M80）Leica Microsystems或类似显微镜
Sylgard（黑色）Dow CorningSYLG170
Sylgard（透明）Dow CorningSYLG184用细磨木炭粉染成黑色
纸巾：KimwipesKIMTECH34120
TritonXSigma-AldrichT8787
Trizma 盐酸盐，pH 7.5Sigma-AldrichT5941
细钨针Fine Science Tools10130-10插入针夹中
坚固钨针Fine Science Tools10130-20插入针夹中
WTLB（Western组织裂解缓冲液）含150 mM NaCl、1.5% Triton X-100、1 mM EDTA、20% 甘油、10 mM NaF、1 mM β-甘油磷酸和1 mM Na3VO4的50 mM Tris-HCl溶液（pH 7.5）。每10 mL溶液加入一片cOmplete蛋白酶抑制剂混合片剂。
酵母糊（本地超市）约两汤匙Fleischmann's ActiveDry酵母（或类似产品）溶于约20 mL蒸馏H2O中

参考文献

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