本文介绍了一种用于解剖的手术方法 果蝇 蛹期视网膜，以及用于免疫组织化学、蛋白质印迹分析和RNA提取的组织处理方案。
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本文内容
摘要
摘要
这 果蝇 蛹期视网膜为研究发育过程中形态发生过程提供了优良的模型系统。本文介绍了一种可靠且精细的蛹期视网膜解剖实验方案 果蝇 蛹期视网膜。我们的手术方法利用 readily-available 微解剖工具打开蛹体，精确分离出眼-脑复合体。若目标是检测细胞或亚细胞结构，可将复合体固定后进行免疫组织化学处理，随后将视网膜置于载玻片上并成像。或者，也可从未固定的样本中将视网膜从脑组织中分离，用适当的缓冲液裂解，用于蛋白质凝胶电泳或 mRNA 提取（分别用于检测蛋白或基因表达）。掌握所述微解剖方案可能需要大量练习和耐心，但一旦熟练掌握，即可相对快速地分离出基本无损伤的视网膜。
引言
Drosophila 视网膜由大约 750 个小眼组成，这些小眼被排列成蜂窝状晶格的色素细胞所包围1,2,3,4。每个小眼包含八个光感受器神经元、四个分泌晶状体的锥形细胞和两个初级色素细胞。每个小眼周围还分布着产生色素的晶格细胞和感觉刚毛群。由于其有丝分裂后特性和典型的六边形排列结构，Drosophila 蛹期视网膜为研究形态发生过程（包括细胞黏附5,6,7,8,9,10和细胞凋亡11,12,13,14
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方案
1. 组织制备
- 设置 果蝇 杂交（如前所述）20或培养物特异性 黑腹果蝇 建立果蝇培养物以获得所需基因型的蛹。为确保大量蛹同步羽化，应在富含营养的培养基或添加了足量酵母糊的标准培养基上设置两份平行培养。
- 维持 果蝇 在25 °C下培养。对于利用UAS-GAL4系统的杂交实验， GMR-GAL4 是在形态发生沟后方幼虫眼盘细胞中以及整个蛹期发育过程中表达的理想驱动基因21,22,23,24交叉 UAS-lacZ X GMR-GAL4 可作为理想的对照杂交，因其可驱动非内源性且无活性的β-半乳糖苷酶蛋白的表达。
- 使用经蒸馏水润湿的6英寸竹签尖端轻轻挑起白色预蛹（图1B) 从健康培养瓶的一侧图1A）并放入一个1.5 mL微量离心管中（图1C).
- 将试管放入塑料移液器吸头盒....
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结果
蛹眼是一种易于获取的组织，是研究驱动形态发生发育过程的优良模型。在此，我们解剖了视网膜，并利用免疫荧光标记检测顶膜粘附连接（图3A、C）或凋亡过程中被激活的Dcp-1 凋亡蛋白酶（图3D）（图3）25。这些方法可清晰地观察关键形态发生过程中的细胞行为，包括初级细胞的招募与形态发生（自18 h APF起）、每个小眼周围晶格细胞的嵌合（18–24 h APF）、三级生态位的建立（21–24 h APF）、细胞大小与形状的变化（18–40 h APF）以及细胞凋亡（18–约33 h APF）。这些形态发生事件的发生时间具有温度依赖性，因此在不同实验室条件下，培养箱温度的微小差异将导致其时间进程略有不同。然而，大约在40 h APF时，细胞的最终排列通常已形成（图3B、C），这是评估基因突变或基.......
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讨论
Drosophila 蛹眼解剖方法如本文所述，可在 10 至 15 分钟内分离出 6 到 10 个眼-脑复合体。然而，掌握解剖技术并提高解剖质量和速度需要耐心与练习。较短的解剖时间可确保每个眼睛大致处于相同的发育阶段，从而减少数据集中视网膜表型或基因表达的变异性。尽管其他替代方案可能更容易掌握，但本方案旨在系统性地分离脆弱的视网膜组织，同时最大限度地降低撕裂或剪切的风险，因为眼睛的损伤可能激活应激通路，甚至导致细胞死亡。我们建议初学者首先掌握培养至 40 小时 APF 的蛹的解剖，再尝试解剖更年轻的样本。我们建议为所有实验设置重复杂交组（步骤 1.1），以确保始终有足够数量的蛹可供收集（步骤 1.3）。根据研究人员关注的不同形态发生事件，可在蛹发育过程中的多个时间点进行视网膜解剖。这些事件可能包括初级细胞的招募与形态发生（18 小时 APF 起）、晶格细胞的嵌合（18–24 小时 APF）、三级微环境的建立（21–24 小时 APF）、细胞大小和形状的变化（18 至 40 小时 APF）以及细胞凋亡（18 至约 33 小时 APF）（图 3A）。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Zack Drum和我们的审稿人对稿件提出的宝贵意见。本工作由R15GM114729项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Adobe Photoshop | Adobe | 图像处理软件 | |
| Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| β-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| β-甘油磷酸 | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| 黑色解剖皿 | 玻璃培养皿，用SYLG170或SYLG184（加入细磨活性炭粉末染成黑色）填充至边缘。室温下静置24–48小时以聚合。 | ||
| 刀片夹持器 | Fine Science Tools | 10053 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete，无EDTA蛋白酶抑制剂混合片剂 | Roche | 4693132001 | |
| 共聚焦显微镜（Zeiss LSM 501） | Carl Zeiss | 或类似显微镜 | |
| 焦碳酸二乙酯（DEPC） | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| 双面胶带 | 3M | 665 | |
| Drosophila 食物培养基，营养丰富 | 7.5% 蔗糖，15% 葡萄糖，2.5% 琼脂，20% 啤酒酵母，5% 蛋白胨，0.125% MgSO4·7H2O，0.125% CaCl2·2H2O | ||
| Drosophila 食物培养基，标准配方 | Bloomington 果蝇品系中心玉米粉配方。 （https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html） | ||
| 乙二胺四乙酸 | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| 固定液 | 4% 多聚甲醛溶于PBS，pH 7.4。 | ||
| 荧光显微镜（TCS SP5 DM 显微镜） | Leica Microsystems | 或类似显微镜 | |
| 镊子 | Fine Science Tools | 91150-20 | 应频繁打磨以保持锋利。 |
| 甲醛 | Thermo Scientific | 28908 | |
| 玻璃9孔板 | Corning | 7220-85 | 也称为9孔板 |
| 玻璃盖玻片（22 × 22 mm） | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| 玻璃载玻片（25 × 75 × 1 mm） | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 玻璃培养皿 | Corning | 3160-100BO | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio 软件版本 5.2.5 | LI-COR Biosciences | 用于Western印迹定量的图像处理软件。 | |
| Laemmli 样品缓冲液 | Bio-Rad | 161-0737 | 2×浓缩蛋白样品缓冲液，根据制造商说明添加β-巯基乙醇。 |
| Lane marker 还原型样品缓冲液 | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5×浓缩蛋白样品缓冲液。 |
| 微量离心管 | Axygen | MCT-175-C | |
| 显微解剖剪 | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| 微孔板（72 × 10 µL 孔） | Nunc | 438733 | |
| 封片剂 | 含0.5% N-丙基没食子酸和80%甘油的PBS溶液 | ||
| N-丙基没食子酸 | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| 无核酸酶PBS（含0.1% DEPC的PBS，pH 7.4） | 将适量DEPC加入PBS中，充分混匀，并在室温下持续搅拌过夜。高压灭菌至少20分钟。4°C保存 | ||
| PBS（磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4） | Sigma-Aldrich | P5368 | 根据制造商说明配制 |
| PBS+pi（含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的PBS） | 含10 mM NaF、1 mM β-甘油磷酸和1 mM Na3VO4的PBS溶液，pH 7.4。 | ||
| PBT | 含0.15% TritonX 和 0.5% 牛血清白蛋白的PBS溶液，pH 7.4 | ||
| 针夹 | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| 一抗：山羊抗GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | 用于Western印迹，使用稀释比例为1:3000 |
| 一抗：兔抗cleaved Dcp-1 | Cell signaling | 9578S | 用于免疫荧光，使用稀释比例为1:100 |
| 一抗：大鼠抗DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | 用于免疫荧光，使用稀释比例为1:20 |
| 一抗：大鼠抗DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | 由Tadashi Uemura惠赠。使用稀释比例为1:100。 |
| RNA提取试剂盒：Relia Prep RNA组织小型提取试剂盒 | Promega | Z6110 | |
| RNase去污染试剂（RNase Away） | Molecular BioProducts | 7002 | |
| 手术刀片 | Fine Science Tools | 10050 | 折断一小段刀片并固定于刀片夹持器中。 |
| 二抗：488标记驴抗大鼠IgG（H+L） | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | 用于免疫荧光，使用稀释比例为1:200 |
| 二抗：Cy3标记山羊抗兔IgG（H+L） | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | 用于免疫荧光，使用稀释比例为1:100 |
| 二抗：HRP标记山羊抗大鼠IgG（H+L） | Cell Signaling Technology | 7077 | 用于Western印迹，使用稀释比例为1:3000 |
| 二抗：HRP标记兔抗山羊IgG（H+L） | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | 用于Western印迹，使用稀释比例为1:3000 |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| 氟化钠 | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| 钒酸钠 | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| 分光光度计（NanoDrop） | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| 体视解剖显微镜（M60 或 M80） | Leica Microsystems | 或类似显微镜 | |
| Sylgard（黑色） | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard（透明） | Dow Corning | SYLG184 | 用细磨木炭粉染成黑色 |
| 纸巾：Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma 盐酸盐，pH 7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| 细钨针 | Fine Science Tools | 10130-10 | 插入针夹中 |
| 坚固钨针 | Fine Science Tools | 10130-20 | 插入针夹中 |
| WTLB（Western组织裂解缓冲液） | 含150 mM NaCl、1.5% Triton X-100、1 mM EDTA、20% 甘油、10 mM NaF、1 mM β-甘油磷酸和1 mM Na3VO4的50 mM Tris-HCl溶液（pH 7.5）。每10 mL溶液加入一片cOmplete蛋白酶抑制剂混合片剂。 | ||
| 酵母糊 | （本地超市） | 约两汤匙Fleischmann's ActiveDry酵母（或类似产品）溶于约20 mL蒸馏H2O中 |
参考文献
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
- Wolff, T., Ready, D. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).
- Carthew, R. W.
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