研究缓症链球菌群在秀丽隐杆线虫中引起的氧化应激

摘要

线虫Caenorhabditis elegans是研究宿主-病原体相互作用的理想模型。本文介绍了一种利用草绿色链球菌群成员感染线虫，并检测其对由此类生物产生的H₂O₂所引发的氧化应激反应激活情况的实验方案。

摘要

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans），一种自由生活的线虫，已成为研究宿主-病原体相互作用的优选模型。本方案利用该模型通过H的产生来测定草绿色链球菌群的致病性₂O₂米提斯链球菌群是一种新兴的致病菌，可引起多种人类疾病，如菌血症、心内膜炎和眶周蜂窝织炎。本文所述方案用于测定这些线虫在H作用下的存活情况₂O₂ 由该类病原体产生的。利用该基因 skn-1 编码氧化应激反应转录因子，表明该模型对于鉴定抵抗链球菌感染所必需的宿主基因具有重要意义。此外，通过一种转基因报告线虫品系可监测在这些病原体存在下氧化应激反应的激活情况，其中SKN-1与绿色荧光蛋白（GFP）融合。这些检测方法为研究H的氧化应激反应提供了机会₂O₂ 来源于生物源，而非外源添加的活性氧（ROS）来源。

引言

轻链球菌群是人类口咽腔的共生菌¹。然而，这些微生物可逃离该生态位并引发多种侵袭性疾病²。这些微生物引起的感染包括菌血症、心内膜炎和眶周蜂窝织炎^2,3,4,5,6。此外，它们正逐渐成为免疫功能低下、中性粒细胞减少以及接受过化疗的癌症患者发生血流感染的致病因子^5,7,8,9。

由于目前鉴定出的毒力因子较少，口腔链球菌群（mitis group）致病机制尚不明确。已知该菌群能够产生过氧化氢（H₂O₂），其在口腔微生物群落中发挥着重要作用¹⁰。最近，多项研究强调了H₂O₂作为一种细....

方案

1. THY（Todd-Hewitt 酵母提取物）琼脂平板的制备

1. 配制1 L培养基时，向2 L锥形瓶中加入30 g Todd-Hewitt粉末、2 g酵母提取物和20 g琼脂。向瓶中加入970 mL去离子水，并放入一个搅拌子。在121 °C温度和15 lb/inch²压力下高压灭菌30分钟。随后将培养基置于磁力搅拌器上，边搅拌边冷却。
2. 在超净工作台中，将培养基倒入适当大小的无菌培养皿中（细菌培养与保藏使用100 mm × 15 mm培养皿，杀菌实验使用35 mm × 10 mm培养皿）。在超净台内静置干燥2小时。此后，培养皿可在4 °C保存1个月。

2. 线虫生长培养基（NGM）和RNAi饲喂平板（NGM RNAi）的制备

1. 使用搅拌子，在2 L的锥形瓶中将2.5 g蛋白胨和3 g NaCl溶解于970 mL去离子水中。向培养基中加入20 g琼脂。在121 °C温度和15 lb/inch²压力下高压灭菌30分钟。将培养基置于搅拌台上，轻轻搅拌使其冷却。
2. 为制备NGM平板，向培养基中加入以下溶液：25 mL 1 M磷酸钾缓冲液（pH = 6.0）、1 mL 1 M MgSO₄、1 mL 1 M CaCl₂、1 mL（5 mg/mL溶于95%乙醇）胆固醇、1 mL（10% v/w溶于乙醇）制霉菌....

结果

与 S. mutans、S. salivarius 以及非致病性 E. coli OP50 相比，S. mitis、S. oralis 和 S. gordonii 这些属于缓症链球菌组（mitis group）的细菌能迅速杀死线虫（图3A）。S. mitis、S. oralis 和 S. gordonii 组的中位生存时间分别为 300 分钟、300 分钟和 345 分钟。为确定杀伤作用是否由 H₂O₂ 介导，在 THY 琼脂中添加了过氧化氢酶（catalase）。在存在过氧化氢酶的情况下，线虫的死亡被完全抑制（图3B）。为进一步验证链球菌产生的 H₂O_.......

讨论

所述方法也可用于其他致病性细菌，例如在厌氧或微需氧条件下生长时同样产生 H₂O₂ 的Enterococcus faecium²⁶。通常情况下，大多数致病生物完成存活率检测需要数天至数周时间。然而，由于缓症链球菌组（mitis group）成员能够稳定地产生 H₂O₂，在所述条件下，这些检测可在 5–6 小时内完成。这确保了能够在较短时间内筛选出多个与宿主免疫和氧化应激反应相关的候选基因。

在本实验方案中，细菌产生的 H₂O₂ 直接与线虫的肠细胞接触，而不同于其他必须穿越多重屏障的外源性活性氧（ROS）来源。这确保了 H₂O₂ 能有效递送至肠细胞，因此在线虫中可观察到更强的杀伤反应。通过使用荧光标记的细菌发现，线虫需暴露于病原体中 30 分钟，才能实现肠道的完全定植¹⁵。建议使用少于一周的链球菌菌株.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>培养基与化学试剂
琼脂糖	Sigma Aldrich	A9539-50G
胰蛋白胨	Fisher Scientific	DF0118-17-0
BD Bacto Todd Hewitt 肉汤	Fisher Scientific	DF0492-17-6
BD BBL 脱纤维羊血	Fisher Scientific	B11947
BD Difco 琼脂	Fisher Scientific	DF0145-17-0
BD Difco LB 肉汤	Fisher Scientific	DF0446-17-3
血琼脂（添加绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂）	Fisher Scientific	R01200
氯化钙	Fisher Scientific	BP510-500
羧苄青霉素	Fisher Scientific	BP26481
过氧化氢酶	Sigma Aldrich	C1345-1G
胆固醇	Fisher Scientific	ICN10138201
IPTG	Fisher Scientific	MP21021012
硫酸镁	Fisher Scientific	BP213-1
制霉菌素	Acros Organics	AC455500050
磷酸氢二钾	Fisher Scientific	BP363-500
磷酸二氢钾	Fisher Scientific	BP362-500
叠氮化钠	Sigma Aldrich	S2002-25G
氯化钠	Fisher Scientific	BP358-1
氢氧化钠	Fisher Scientific	SS266-1
8.25% 次氯酸钠
磷酸氢二钠	Fisher Scientific	BP332-500
硫酸链霉素	Fisher Scientific	BP910-50
四环素	Sigma Aldrich	87128-25G
(−盐酸左旋咪唑	Sigma Aldrich	L9756
酵母提取物	Fisher Scientific	BP1422-500
<强>耗材
15 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管	Fisher Scientific	12-565-269
一次性聚苯乙烯刻度吸管 10 mL	Fisher Scientific	07-200-574
一次性聚苯乙烯刻度吸管 25 mL	Fisher Scientific	07-200-575
Falcon 细菌培养皿（带盖，35 mm × 10 mm）	Fisher Scientific	08-757-100A
1.5号  18 mm × 18 mm 盖玻片	Fisher Scientific	12-541A
直径60 mm、高15 mm、带透明盖的培养皿	Fisher Scientific	FB0875713A
带透明盖的培养皿（100 mm × 15 mm）	Fisher Scientific	FB0875712
普通载玻片（75 mm × 25 mm）	Fisher Scientific	12-544-4
<强>软件
Prism	Graphpad
<强>细菌菌株
S. oralis ATCC 35037
S. mitis ATCC 49456
S. gordonii DL1 查利斯
E. coli OP50
E. coli HT115
<强>线虫品系
<强>菌株	<强>基因型	<强>转基因	<强>来源
N2	秀丽隐杆线虫野生分离株		CGC
EU1	skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V)		CGC
LD002	IdIs1	SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)	Keith Blackwell