研究缓症链球菌群在秀丽隐杆线虫中引起的氧化应激

摘要

线虫Caenorhabditis elegans是研究宿主-病原体相互作用的理想模型。本文介绍了一种利用草绿色链球菌群成员感染线虫，并检测其对由此类生物产生的H₂O₂所引发的氧化应激反应激活情况的实验方案。

摘要

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans），一种自由生活的线虫，已成为研究宿主-病原体相互作用的优选模型。本方案利用该模型通过H的产生来测定草绿色链球菌群的致病性₂O₂米提斯链球菌群是一种新兴的致病菌，可引起多种人类疾病，如菌血症、心内膜炎和眶周蜂窝织炎。本文所述方案用于测定这些线虫在H作用下的存活情况₂O₂ 由该类病原体产生的。利用该基因 skn-1 编码氧化应激反应转录因子，表明该模型对于鉴定抵抗链球菌感染所必需的宿主基因具有重要意义。此外，通过一种转基因报告线虫品系可监测在这些病原体存在下氧化应激反应的激活情况，其中SKN-1与绿色荧光蛋白（GFP）融合。这些检测方法为研究H的氧化应激反应提供了机会₂O₂ 来源于生物源，而非外源添加的活性氧（ROS）来源。

引言

轻链球菌群是人类口咽腔的共生菌¹。然而，这些微生物可逃离该生态位并引发多种侵袭性疾病²。这些微生物引起的感染包括菌血症、心内膜炎和眶周蜂窝织炎^2,3,4,5,6。此外，它们正逐渐成为免疫功能低下、中性粒细胞减少以及接受过化疗的癌症患者发生血流感染的致病因子^5,7,8,9。

由于目前鉴定出的毒力因子较少，口腔链球菌群（mitis group）致病机制尚不明确。已知该菌群能够产生过氧化氢（H₂O₂），其在口腔微生物群落中发挥着重要作用¹⁰。最近，多项研究强调了H₂O₂作为一种细胞毒素的作用，可诱导上皮细胞死亡^11,12。属于该菌群的肺炎链球菌（S. pneumoniae）已被证实可产生高水平的H₂O₂，导致肺泡细胞发生DNA损伤和凋亡¹³。在急性肺炎动物模型中，相同研究人员证明细菌产生的H₂O₂赋予其毒力优势。关于肺炎球菌性脑膜炎的研究也表明，病原体来源的H₂O₂与肺炎溶素协同作用，触发神经元细胞死亡¹⁴。这些发现明确表明，该类细菌产生的H₂O₂在其致病性中具有重要作用。

有趣的是，已有研究表明，S. mitis 和 S. oralis 等属于米提斯组（mitis group）的成员可通过产生 H₂O₂^15,16 导致线虫 C. elegans 死亡。这种自由生活的线虫已被用作一种结构简单且遗传上易于操作的模型，用于研究多种生物学过程。近年来，该线虫更逐渐成为研究宿主-病原体相互作用的模型系统^17,18。此外，多项研究强调了利用该生物体研究氧化应激的重要性^19,20,21。其生命周期短、可通过RNAi技术敲低目的基因，以及可利用绿色荧光蛋白（GFP）融合报告基因监测基因表达等特性，使其成为一种极具吸引力的模型系统。更重要的是，该线虫中调控氧化应激和先天免疫的信号通路与哺乳动物高度保守^20,22。

在本方案中，将展示如何使用 秀丽隐杆线虫 阐明由链球菌衍生的H所引起的致病性₂O₂一种改良的存活率检测方法被展示，其中草绿色链球菌群的成员能够快速杀死线虫 通过 H的生成₂O₂利用缓症链球菌组（mitis group）成员可提供持续的生物性活性氧（ROS）来源，与诱导线虫氧化应激的化学来源相对。此外，这些细菌能够快速定植于线虫体内，从而实现H₂O₂ 直接靶向肠道细胞（相较于其他需穿越多重屏障的递送方式）。该检测方法的验证可通过以下任一方式进行：1）测定存活率 skn-1 突变菌株或 2) 通过敲低 skn-1 使用RNAi处理的线虫相对于N2野生型和载体对照处理的线虫。SKN-1是一种重要的转录因子，可调控氧化应激反应 秀丽隐杆线虫^23,24,25除了生存实验外，还使用表达 SKN-1B/C::GFP 转基因报告基因的线虫品系来监测氧化应激反应的激活情况 通过 H的生成₂O₂ 由草绿色链球菌群。

方案

1. THY（Todd-Hewitt 酵母提取物）琼脂平板的制备

1. 配制1 L培养基时，向2 L锥形瓶中加入30 g Todd-Hewitt粉末、2 g酵母提取物和20 g琼脂。向瓶中加入970 mL去离子水，并放入一个搅拌子。在121 °C温度和15 lb/inch²压力下高压灭菌30分钟。随后将培养基置于磁力搅拌器上，边搅拌边冷却。
2. 在超净工作台中，将培养基倒入适当大小的无菌培养皿中（细菌培养与保藏使用100 mm × 15 mm培养皿，杀菌实验使用35 mm × 10 mm培养皿）。在超净台内静置干燥2小时。此后，培养皿可在4 °C保存1个月。

2. 线虫生长培养基（NGM）和RNAi饲喂平板（NGM RNAi）的制备

1. 使用搅拌子，在2 L的锥形瓶中将2.5 g蛋白胨和3 g NaCl溶解于970 mL去离子水中。向培养基中加入20 g琼脂。在121 °C温度和15 lb/inch²压力下高压灭菌30分钟。将培养基置于搅拌台上，轻轻搅拌使其冷却。
2. 为制备NGM平板，向培养基中加入以下溶液：25 mL 1 M磷酸钾缓冲液（pH = 6.0）、1 mL 1 M MgSO₄、1 mL 1 M CaCl₂、1 mL（5 mg/mL溶于95%乙醇）胆固醇、1 mL（10% v/w溶于乙醇）制霉菌素和1 mL 25 mg/mL链霉素。
3. 为制备NGM RNAi饲喂平板，向培养基中加入以下溶液：25 mL 1 M磷酸钾缓冲液（pH = 6.0）、1 mL 1 M MgSO₄、1 mL 1 M CaCl₂、1 mL（5 mg/mL溶于95%乙醇）胆固醇、1 mL（10% v/w溶于乙醇）制霉菌素、1 mL 50 mg/mL羧苄青霉素和1 mL IM IPTG。
4. 在层流条件下将培养基倒入60 mm × 15 mm无菌培养皿中。在层流罩下静置干燥2小时。随后，平板可在4 °C保存1个月。

3. C. elegans 的培养与维持

1. 在NGM平板中央滴加50 µL过夜培养的E. coli OP50菌液进行接种。该E. coli菌种先前已在Luria-Bertani（LB）培养基中培养，并于4 °C保存数月。盖好平板，在超净工作台中静置干燥24小时，随后将平板存放在聚苯乙烯容器中。
2. 在体视显微镜下，用无菌线虫挑取针挑取10至12条性成熟成虫，转移至已接种E. coli OP50的NGM平板上。于20 °C培养过夜。
3. 次日，用无菌线虫挑取针移除成虫，让胚胎在20 °C继续发育至L4幼虫阶段（约2.5天）。

4. 蛔虫同步化年龄群体的制备

1. 用 M9W 缓冲液冲洗两到四个 NGM 平板上的成年 gravid 线虫，并收集至一个 15 mL 圆锥形离心管中。
   1. 制备 M9W 缓冲液：将 3 g NaCl、6 g Na₂HPO₄ 和 3 g KH₂PO₄ 溶解于 1 L 去离子水中，定容后高压灭菌，再加入 1 mL 1 M MgSO₄。
2. 以 450 × g 离心 1 分钟，弃去上清液，注意保持线虫沉淀完整。
3. 加入 400 µL 8.25% 次氯酸钠（家用漂白剂）和 100 µL 5 N NaOH，配制线虫裂解液。将裂解液加入线虫沉淀中，轻轻弹击离心管使内容物混匀，直至约 70% 的成年线虫被裂解。定期在解剖显微镜下观察管内样品，确保卵未被过度漂白。
4. 向离心管中加入 10 mL M9W 缓冲液，稀释漂白液混合物。
5. 以 450 × g 离心 1 分钟，弃去上清液，再加入 10 mL M9W 缓冲液。
6. 重复步骤 4.5 两次。
7. 将所得的卵沉淀重悬于 3–5 mL M9W 缓冲液中，将离心管置于旋转仪上，在室温（RT）下以 18 rpm 的速度旋转过夜。
8. 次日，以 450 × g 离心 1 分钟，使 L1 幼虫沉淀。用移液器吸除大部分 M9W 缓冲液，保留约 250 µL 液体。重悬 L1 幼虫，取 3 滴、每滴 5 µL 的线虫悬液置于培养皿盖上，使用解剖显微镜估算每 µL 中的线虫数量。

5. 在线虫中诱导RNAi

1. 使用无菌接种环或接种针，将含有RNAi的 E. coli 菌株（Ahringer和Vidal文库）从冻存菌种中取出，划线接种于含有50 µg/mL羧苄青霉素和15 µg/mL四环素的100 mm × 15 mm LB琼脂平板上。于37 °C培养24 h。
2. 从目标RNAi菌株平板上挑取单个孤立菌落，接种至含有2 mL LB培养基（补充50 µg/mL羧苄青霉素）的无菌15 mL锥形管中。于37 °C、150 rpm振荡培养16 h。
3. 次日，用无菌涂布棒将150 µL过夜培养的菌液均匀涂布于65 mm × 15 mm NGM RNAi喂养平板上。于37 °C培养24 h。
4. 将平板在37 °C培养后取出，冷却至室温。向接种了E. coli的NGM RNAi喂养平板中加入适量体积的M9缓冲液，其中含有约200条L1期幼虫（来自同步化发育的线虫群体）。于20 °C培养，直至幼虫发育至L4期（约2.5天）。

6. 感染用米提斯链球菌组的制备

1. 将目标链球菌菌株划线接种于100 mm × 15 mm的THY琼脂平板上（若平板储存于4 °C，接种前需将平板预热至37 °C），然后将平板置于烛缸中，于37 °C培养过夜（约18 h），以提供链球菌生长所需的微需氧环境（划线后的平板可在4 °C保存一周）。
2. 如需扩增链球菌的临床分离株，应使用胰蛋白酶大豆血琼脂平板。将平板置于烛缸中，于37 °C培养过夜（约18 h）。
3. 次日，从烛缸中取出平板，用无菌接种环挑取单个菌落，接种至含有2 mL THY液体培养基的15 mL无菌锥形管中。如需扩增链球菌的临床分离株，应在THY液体培养基中添加5% v/v的绵羊血。旋紧管盖，在37 °C静置培养。

7. 存活率检测

注意：本实验涉及的步骤如图1所示。为证明由缓症链球菌群产生的H₂O₂是导致线虫死亡的原因，可在培养基中添加过氧化氢酶，或使用S. gordonii的突变株ΔspxB及其互补株ΔspxB;spxB+。SpxB编码一种丙酮酸氧化酶，该酶负责缓症链球菌群中H₂O₂的生成。

1. 将 35 mm × 10 mm 的 THY 平板预热至 37 °C。加入 80 µL 过夜培养的目标链球菌菌株培养物，使用无菌涂布棒将细菌完全均匀涂布于琼脂表面。将平板置于烛缸中，于 37 °C 培养过夜（约 18 小时）。作为对照，将 80 µL 过夜培养的 E. coli OP50 菌液接种至两块 35 mm × 10 mm 的 NGM 平板上，于 37 °C 过夜培养。
2. 为验证由缓症链球菌群产生的 H₂O₂ 是导致线虫死亡的原因，在 THY 平板上加入含 1,000 单位过氧化氢酶（catalase c）的 50 µL 溶液。使用无菌涂布棒将过氧化氢酶溶液均匀涂布，并将平板置于超净工作台中干燥 30 分钟。随后按照步骤 7.1 所述方法，将相应的链球菌菌株接种至平板上。
3. 次日，从烛缸中取出平板，室温静置 10–15 分钟使其冷却。使用无菌线虫挑取工具，将 30 条 L4 期幼虫从 NGM 或 NGM RNAi 饲喂平板转移至接种了链球菌的 THY 平板。每种链球菌菌株使用两块接种平板，共 60 条线虫。将平板置于 25 °C 培养。
4. 使用体视显微镜，在多个时间点分别计数每块平板上存活和死亡的 L4 期幼虫数量。初始阶段每 30 分钟记录一次线虫存活状态；当线虫开始快速死亡后，改为每 15 分钟记录一次。使用无菌线虫挑取工具轻轻触碰线虫，判断其是否存活。若线虫对触碰无任何运动反应，则判定为死亡。
5. 该实验通常需 5–6 小时完成。重复实验两次。实验结束后，合并两块平板的数据。输入各组数据，比较生存曲线，并使用统计学软件进行 Kaplan-Meier 生存分析。

8. 显微镜用琼脂糖垫的制备

1. 将2% w/v琼脂糖溶于去离子水中，通过微波加热使溶液溶解。5 mL溶液足以制备20张载玻片。
2. 沿两条玻璃载玻片的长度方向粘贴实验室胶带，以确定琼脂糖垫的厚度。将一张洁净的玻璃载玻片置于两条贴好胶带的载玻片之间。
3. 在洁净载玻片中央加入100 µL熔融琼脂糖，立即在其上覆盖另一张洁净的玻璃载玻片，并轻轻按压形成垫片。待琼脂糖凝固后，移去上方的载玻片。琼脂糖垫即可使用。

9. 观察 SKN-1 在响应中的定位 链球菌 感染

注意：本实验涉及的步骤如图2所示。使用携带SKN-1B/C::GFP转基因的线虫品系检测SKN-1的定位。为证明由于缓症链球菌（mitis group）产生H₂O₂所导致的SKN-1定位变化，采用了野生型（WT）、ΔspxB突变株以及互补菌株 ΔspxB;spxB+的S. gordonii。此外，利用SKN-1B/C::GFP转基因报告品系及RNAi干扰技术，验证了p38 MAPK信号通路中的组分可调控SKN-1的定位。

1. 将 35 mm × 10 mm 的 THY 平板预热至 37 °C。加入 80 µL 过夜培养的目标链球菌菌株培养物，并使用无菌涂布棒将细菌完全涂布于琼脂表面。将平板置于烛缸中，于 37 °C 培养过夜（约 18 小时）。作为对照，将 80 µL 过夜培养的 E. coli OP50 菌液接种至三块 35 mm × 10 mm 的 NGM 平板上，并于 37 °C 培养约 18 小时。
2. 次日，从烛缸中取出平板，室温静置 10–15 分钟使其冷却。使用 M9W 缓冲液从 NGM 及 NGM RNAi 饲喂平板上冲洗 L4 期幼虫。将线虫收集至 15 mL 圆底离心管中。
3. 以 450 × g 离心 1 分钟。弃去上清液，加入 10 mL M9W 缓冲液。
4. 重复步骤 9.3 三次。
5. 将线虫重悬于约 250 µL M9W 缓冲液中，取三滴（每滴 5 µL）虫悬液置于洁净的培养皿盖上，使用解剖显微镜估算每 µL 中的线虫数量。
6. 向每块 THY 链球菌接种平板及 NGM E. coli 接种平板中各加入约 100 条 L4 期幼虫。每种细菌菌株使用三块平板。于 25 °C 培养 2 至 3 小时。
7. 随后，从培养箱中取出平板，用 M9W 缓冲液冲洗，并将线虫收集至 15 mL 圆底离心管中。
8. 按照步骤 9.3 所述方法清洗线虫 3 次。
9. 用移液法吸除大部分 M9W 缓冲液，向线虫沉淀中加入 500 µL 含 2 mM 叠氮化钠或 2 mM 盐酸四咪唑的 M9W 缓冲液。此步骤可麻醉线虫，确保在显微镜下观察时无运动发生。
   注意：操作叠氮化钠时需佩戴个人防护装备（PPE）。叠氮化钠溶液应在化学通风橱中配制。
10. 将线虫沉淀于室温孵育 15 分钟。然后取 15 µL 虫悬液点样于预先制备的琼脂糖垫上。轻轻将 1.5 号盖玻片覆盖在含有麻醉线虫的琼脂糖垫上。
11. 使用荧光显微镜，结合 FITC 和 DAPI 滤光片观察 SKN-1 的定位情况。以 10× 和 20× 放大倍数对线虫成像。
12. 根据 SKN-1 的定位水平对线虫进行评分。SKN-1 无核定位、SKN-1B/C::GFP 定位于线虫前部或后部、以及 SKN-1B/C::GFP 在所有肠细胞中均出现核定位，分别归类为低、中、高水平的定位。
13. 完成荧光显微图像评分后，使用统计学软件通过卡方检验和 Fisher 精确检验确定组间统计学差异。

结果

与 S. mutans、S. salivarius 以及非致病性 E. coli OP50 相比，S. mitis、S. oralis 和 S. gordonii 这些属于缓症链球菌组（mitis group）的细菌能迅速杀死线虫（图3A）。S. mitis、S. oralis 和 S. gordonii 组的中位生存时间分别为 300 分钟、300 分钟和 345 分钟。为确定杀伤作用是否由 H₂O₂ 介导，在 THY 琼脂中添加了过氧化氢酶（catalase）。在存在过氧化氢酶的情况下，线虫的死亡被完全抑制（图3B）。为进一步验证链球菌产生的 H₂O_...

讨论

所述方法也可用于其他致病性细菌，例如在厌氧或微需氧条件下生长时同样产生 H₂O₂ 的Enterococcus faecium²⁶。通常情况下，大多数致病生物完成存活率检测需要数天至数周时间。然而，由于缓症链球菌组（mitis group）成员能够稳定地产生 H₂O₂，在所述条件下，这些检测可在 5–6 小时内完成。这确保了能够在较短时间内筛选出多个与宿主免疫和氧化应激反应相关的候选基因。

在本实验方案中，细菌产生的 H₂O₂ 直接与线虫的肠细胞接触，而不同于其他必须穿越多重屏障的外源性活性氧（ROS）来源。这确保了 H₂O₂ 能有效递送至肠细胞，因此在线虫中可观察到更强的杀伤反应。通过使用荧光标记的细菌发现，线虫需暴露于病原体中 30 分钟，才能实现肠道的完全定植¹⁵。建议使用少于一周的链球菌菌株...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>培养基与化学试剂
琼脂糖	Sigma Aldrich	A9539-50G
胰蛋白胨	Fisher Scientific	DF0118-17-0
BD Bacto Todd Hewitt 肉汤	Fisher Scientific	DF0492-17-6
BD BBL 脱纤维羊血	Fisher Scientific	B11947
BD Difco 琼脂	Fisher Scientific	DF0145-17-0
BD Difco LB 肉汤	Fisher Scientific	DF0446-17-3
血琼脂（添加绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂）	Fisher Scientific	R01200
氯化钙	Fisher Scientific	BP510-500
羧苄青霉素	Fisher Scientific	BP26481
过氧化氢酶	Sigma Aldrich	C1345-1G
胆固醇	Fisher Scientific	ICN10138201
IPTG	Fisher Scientific	MP21021012
硫酸镁	Fisher Scientific	BP213-1
制霉菌素	Acros Organics	AC455500050
磷酸氢二钾	Fisher Scientific	BP363-500
磷酸二氢钾	Fisher Scientific	BP362-500
叠氮化钠	Sigma Aldrich	S2002-25G
氯化钠	Fisher Scientific	BP358-1
氢氧化钠	Fisher Scientific	SS266-1
8.25% 次氯酸钠
磷酸氢二钠	Fisher Scientific	BP332-500
硫酸链霉素	Fisher Scientific	BP910-50
四环素	Sigma Aldrich	87128-25G
(−盐酸左旋咪唑	Sigma Aldrich	L9756
酵母提取物	Fisher Scientific	BP1422-500
<强>耗材
15 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管	Fisher Scientific	12-565-269
一次性聚苯乙烯刻度吸管 10 mL	Fisher Scientific	07-200-574
一次性聚苯乙烯刻度吸管 25 mL	Fisher Scientific	07-200-575
Falcon 细菌培养皿（带盖，35 mm × 10 mm）	Fisher Scientific	08-757-100A
1.5号  18 mm × 18 mm 盖玻片	Fisher Scientific	12-541A
直径60 mm、高15 mm、带透明盖的培养皿	Fisher Scientific	FB0875713A
带透明盖的培养皿（100 mm × 15 mm）	Fisher Scientific	FB0875712
普通载玻片（75 mm × 25 mm）	Fisher Scientific	12-544-4
<强>软件
Prism	Graphpad
<强>细菌菌株
S. oralis ATCC 35037
S. mitis ATCC 49456
S. gordonii DL1 查利斯
E. coli OP50
E. coli HT115
<强>线虫品系
<强>菌株	<强>基因型	<强>转基因	<强>来源
N2	秀丽隐杆线虫野生分离株		CGC
EU1	skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V)		CGC
LD002	IdIs1	SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)	Keith Blackwell