本方案详细描述了人干细胞来源神经元的重悬与培养步骤，这些神经元此前已在体外由神经前体细胞分化数周。该操作流程适用于基于成像的检测方法，可对神经突、突触以及晚期表达的神经元标志物进行分析，且兼容光学显微镜和高内涵筛选实验体系。
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摘要
摘要
由人多能干细胞衍生的神经前体细胞（NPCs）在二维培养条件下分化而来的神经元，是一种强大的模型系统，可用于探索疾病机制，并开展高内涵筛选（HCS），以检测化合物文库或鉴定基因突变的表型。然而，在人源细胞中，从NPC向功能成熟神经元的转变通常需要数周时间。在单层培养中，突触通常在分化后3周左右开始形成，而多种神经元特异性蛋白，例如晚期表达的泛神经元标志物NeuN，或大脑皮层第5/6层神经元标志物CTIP2，则在分化后约4-5周开始表达。这种漫长的分化周期可能与适用于小体积、多孔板HCS平台的最佳培养条件不兼容。其中诸多挑战包括：需要细胞贴壁良好、分布均匀且细胞聚集成簇最少，以及培养过程需支持长期存活和功能性突触的成熟。一种解决策略是在大体积培养体系中进行神经元分化，随后在特定时间点将其重新接种至适用于HCS的多孔板中。然而，采用这种重接种策略时面临的主要挑战在于可重复性和细胞存活率，原因在于树突和轴突网络在操作过程中会受到机械性损伤而产生应激。本文展示了一种详细且可靠的实验流程：将人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的神经元在大体积培养体系中分化4-8周后，通过酶法将其重新悬浮，转移至384孔微孔板，并继续培养1-3周，获得优异的细胞存活率。这种人神经元的重接种方法不仅可在重接种后两周内实现突触组装与成熟的研究，还可用于神经突再生及生长锥特征的分析。我们提供了基于384孔平台的可扩展化神经突生成和突触生成检测方法的实例。
引言
人多能干细胞（hiPSC）来源的神经元在基础研究、药物开发和再生医学领域的重要性日益凸显。目前，优化其培养与维持的流程以及提高向特定神经元亚型分化效率的方法正在迅速发展1,2。为了提升人干细胞来源神经元作为药物发现和靶点验证中适用于高内涵分析的模型系统的实用性和成本效益，有必要缩短获得成熟且具有功能的神经元所需的培养时间，同时最大限度地保持其稳健性、可重复性和表型相关性。尽管三维类器官培养正在推动神经发育研究的突破3，但二维单层培养由于组织厚度极小，特别适用于基于自动化成像的应用。
然而，将基于成像的筛选方法应用于人类神经系统疾病和神经发育疾病模型时面临一个重大挑战。人类神经系统在体内成熟所需的时间较长，因此需要延长体外培养时间，以适应基因表达的自然程序并实现神经元的成熟。
神经元分化程序耗时较长，其一个实际后果是，为了获得足够成熟的突触，必须将由hiPSC诱导的单层培养物维持数周之久。在此期间，仍处于未分化状态的神经前体细胞会持续分裂。这些细胞可能迅速过度生长，并消耗维持有活性的终末分化神经元所需的营养物质。活跃分裂的神经前体细胞（NPCs）还可能与神经元竞争生长基质，导致培养物容易出现贴壁不良的问题，从而不适合基于成像的检测分析。此外，许多研究者发现，培养体积越小，就越难长期维持分化神经元群体的健康状态，以致难以观察到神经元分化的晚期阶段。换句话说，利用高内涵筛选（HCS）方法对人源性神经元进行突触成熟检测极具挑战性。
为克服上述部分问题，已有研究采用将已分化的hiPSC来源神经元重新悬浮并再次接种的方法。首先，该方法可用于研究完全定向分化的神经元群体中的神经突生长（更准确地说，是神经突再生）。其次，将已在大体积培养容器（如10 cm培养皿或更大）中分化的神经元重新接种至小体积培养体系（如适用于高内涵筛选的96孔或384孔微孔板），可显著缩短在小体积条件下的总体培养时间。这有助于在体外后续数周内对突触的组装与成熟过程进行研究。
然而，将已经形成较长神经突起并建立了复杂连接网络的成熟神经元进行再接种，会面临多种挑战，其中之一是细胞死亡率有时较高且存在较大变异性。本文介绍一种再接种操作流程，可实现优异的细胞存活率和良好的可重复性。通常情况下，为在吹打前使细胞从培养基质上脱离，需将神经元短暂暴露于蛋白酶中（孵育时间通常约为3–10分钟）。这种短时间的蛋白酶消化常用于重悬和传代多种分裂细胞，包括非神经元细胞和未分化的前体细胞4,5,6。然而，对于具有长而相互连接的神经突的分化神经元而言，不仅需要使细胞从基质上脱离，还必须破坏树突和轴突网络，以在尽量减少损伤的前提下获得单个细胞。事实上，神经元形成的致密网状结构通常倾向于以整片形式从基质上脱落，而非解离为单个细胞。若未充分松解致密的神经突网络，则神经元不仅在吹打过程中会遭受不可逆损伤，而且其中许多细胞无法通过用于去除团块的滤膜，导致细胞得率低下。下文将介绍一种对广泛使用的蛋白酶孵育步骤的简单改进方法，以克服上述困难。
在下述实验方案中，将神经元与温和的蛋白酶（例如水解酶Accutase）共同孵育40–45分钟。加入酶后的最初5–10分钟内，神经元网络会以片状从基质上脱离。随后继续蛋白酶孵育30–40分钟，再进行轻柔吹打和过滤。延长孵育时间有助于充分消化细胞间基质，使细胞间网络松弛，从而确保后续吹打可获得单细胞悬液。该操作在重铺细胞时可最大程度地提高细胞分布的均匀性，同时将细胞死亡降至最低。我们已成功将此重铺方法应用于通过不同分化方案7,8以及来自不同hiPSC细胞系所获得的hiPSC来源神经元培养物。该方法理论上适用于大多数或全部干细胞来源神经元细胞系。我们观察到，对于小规格培养皿（例如直径35 mm）的培养物，延长蛋白酶孵育时间并非绝对必要；然而，如本文所示，在大直径培养皿（例如直径10 cm或更大）的重铺过程中，该步骤具有显著优势，原因可能是此类培养皿中的神经突可延伸出非常长的突起，并形成高度互联的网络结构。
本文展示了该方法，并简要说明其在早期神经突起形成和突触成熟检测中的应用，后者涉及突触前和突触后蛋白在树突和轴突上的聚集，随后在突触位点发生共定位。这些示例突显了该方案在保持细胞活力和实验可重复性方面的优势。首先，该方法允许研究者探究人类神经突起形成的早期阶段。实验条件类似于常用的大鼠或小鼠皮层或海马神经元原代培养体系，即从晚期胎儿或出生后早期脑组织中分离细胞，经温和蛋白酶处理后通过吹打分散细胞，使其启动神经突起形成或再生在操作过程中被切断的神经突起9,10。与这类啮齿类动物原代神经元相似，由人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的神经元在重新接种后数小时内即开始形成或再生神经突起，从而可在空间-时间成像条件最优的环境中对生长锥和神经突起形态进行成像，且周围未分化细胞较少。我们观察到，与神经元从祖细胞群体首次分化时常见的延迟时间不一和生长速率差异相比，神经突起的外延生长更为同步。此外，重新接种使得能够检测表达通常在神经发育后期出现的神经元亚型标志物的神经元，例如皮层第5/6层转录因子CTIP2（Chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor-interacting protein 2），或泛神经元标志物NeuN11。重新接种策略的一个特别有用的特点是，突触形成过程的时间进程与高通量筛选（HCS）兼容。
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方案
1. 传代前的分化时期
- 使用选定的方案7,8在10 cm培养皿中进行神经元分化，直至神经元形成密集的突起网络，并不仅表达早期神经元标志物（如MAP2或TuJ1），还表达晚期标志物（如NeuN）。
- 在神经元分化过程中，每4天更换一半选定的培养基。
注意： 更大量或更频繁的换液会稀释关键的营养因子，可能不利于神经元成熟。- 对于iPSC来源的WT126神经元，使用以下分化后培养基：在500 mL达尔伯克改良伊格尔培养基/营养混合物F-12（DMEM/F12）中加入5 mL 100倍N2补充剂、10 ng/mL BDNF、10 ng/mL GDNF、1 µg/mL层粘连蛋白、200 µM抗坏血酸、1 µM二丁酰-cAMP以及10 mL SM1。通过半量换液的方式逐步替换为神经基础培养基（材料表）及相同的补充成分。
- 对于iPSC来源的CVB WT神经元，使用以下分化后培养基：500 mL神经基础A培养基（材料表）与500 mL DMEM/F12培养基混合，其中包含2 µg/mL层粘连蛋白、10 mL谷氨酰胺补充剂（材料表）、0.75 mg/mL碳酸氢钠、5 mL最低必需培养基（MEM）非必需氨基酸、0.2 mM抗坏血酸、10 ng/mL BDNF、20 mL 50倍B27补充剂以及10 mL 100倍N2补充剂。
2. 包被多孔板
- 传代前一天，用多聚-L-鸟氨酸（PLO）包被。将PLO溶于无菌水中，配制成储存液（10 mg/mL），于-20 °C保存。包被玻璃表面时，将PLO按1:100比例稀释于水中，终浓度为50 µg/mL；包被塑料表面时，按1:1,000比例稀释（10 µg/mL）。
- 直接将包被液加入目标培养板中，根据培养板规格使用适当的包被体积（例如，24孔板每孔加入500 µL PLO溶液）。
- 将培养板置于室温避光条件下静置过夜。
- 在传代当天取出已包被的培养板，并转移至无菌生物安全柜中。
- 吸除PLO溶液，用无菌水冲洗两次。
- 将层粘连蛋白（laminin，1.15 mg/mL）用磷酸盐缓冲液（PBS）按1:400比例稀释。
注意：在4 °C条件下解冻层粘连蛋白，并迅速加入PBS中，以避免蛋白聚集和包被不均。 - 吸除无菌水，向先前已用PLO包被的孔中每孔加入500 µL层粘连蛋白包被液。
- 将培养板置于37 °C培养箱中孵育至少4–6小时；对于玻璃表面，可延长孵育时间至16小时。应保持孵育时间一致。
3. 重新接种已分化的神经元
- 用 PBS 轻柔地冲洗一次分化后的神经元培养板。沿培养板壁轻柔加入 PBS，避免直接加到细胞上，以防破坏细胞。
- 轻柔吸除 PBS，注意避免直接接触细胞，可在倾斜培养皿朝向操作者的一侧时从边缘吸液。
- 每 10 cm 培养板至少加入 1 mL 蛋白酶（材料表），然后将细胞放回培养箱。若组织培养室因湿度较低导致蒸发较快，可适当增加加入体积。
- 将细胞在蛋白酶中孵育 40–45 分钟，以使其从培养板上脱落，并从神经网络中彼此分离。
注意：此步骤的时间至关重要。过早终止蛋白酶反应可能导致重铺后细胞死亡率升高。蛋白酶生产商建议，在较低温度（远低于 37 °C）下使用更长的孵育时间进行细胞系传代（例如在 4 °C 过夜）。然而，应避免在 4 °C 下操作神经元，因为它们在冷暴露后通常存活率较差。生产商还指出，在 37 °C 下孵育 60 分钟会导致该酶的酶活性失活。但根据作者经验，在 37 °C 下对 hiPSC 来源的神经元培养物进行 40–45 分钟的孵育，足以实现有效解离，并在重铺后获得良好的神经元存活率。 - 在孵育期间使用相差显微镜观察神经元，继续蛋白酶处理，直至神经网络完全从培养板上脱落，并在显微镜下轻微晃动培养板时开始分裂成较小的片状结构。
- 使用每 1 mL 蛋白酶对应 5 mL 新鲜 DMEM 培养基终止 10 cm 培养板中的酶消化反应。使用移液管轻柔吹打细胞 5–8 次以破坏神经网络。吹打时注意不要施加过大压力，因为分化后的神经元较为脆弱。请勿使用 P1000 枪头，因其末端过于尖锐狭窄，可能剪切或损伤神经元。
- 将含细胞的溶液逐滴通过孔径为 100 µm 的细胞筛网，滤入新的 50 mL 锥形管中。
- 待细胞完全滤过后，用额外的 5 mL 新鲜 DMEM 培养基冲洗筛网。
- 在台式离心机中以 1,000 × g 离心 5 分钟。
- 将锥形管放回生物安全柜中，吸除大部分培养基，保留约 250 µL 以确保细胞保持湿润。
- 用 2 mL 新鲜 DMEM 培养基轻柔重悬细胞。不要将细胞沉淀在管壁上反复吹打。建议轻柔倒置锥形管 2–3 次，并通过 5 mL 移液管末端轻柔吹打使细胞脱离管底。
- 取 10 µL 重悬的神经元溶液加至血细胞计数板边缘。
- 在此重悬步骤中，向细胞液滴中加入 8–10 µL 台盼蓝以评估细胞活力。取 10 µL 此混合液加入血细胞计数板或其他自动细胞计数仪中。将呈相位明亮且排除台盼蓝染料的细胞判定为活细胞。
- 计算每毫升活细胞数量，并根据所需细胞密度准备稀释锥形管中的细胞悬液。
- 384 孔板每孔接种约 10,000 个细胞；24 孔板每孔接种约 150,000–200,000 个细胞。
- 向重悬细胞的锥形管中加入新鲜 DMEM 培养基以达到适当稀释倍数，并根据特定细胞系的需求添加适当的补充物，如 B27 和/或 BDNF。
- 轻柔倾斜锥形管混合 2–3 次。
- 使用 16 通道移液器吸除 24 孔板或 384 孔多孔板中的层粘连蛋白包被液，并用 PBS 冲洗一次。
- 使用 P1000 移液器吸除 24 孔板中的 PBS，或使用 16 通道移液器吸除 384 孔板中的 PBS。
- 以“8”字形运动方式将细胞悬液加入各孔，以避免细胞聚集。也可使用自动化液体处理设备优化接种的均匀性。
注意：在重铺后 2–4 天开始，在培养基中添加层粘连蛋白有助于维持细胞的均匀分布。 - 对每个孔重复步骤 3.19 和 3.20。
- 将培养板放回设定为 37 °C 和 5% CO2 的培养箱中。
- 两天后，开始每 4 天更换一半培养基，使用第 1.2 节所述的分化后培养基。在达到所需的成熟时间后，于 37 °C 使用 3.7% 甲醛固定细胞，并根据实验需求对细胞进行染色。
4. 重铺后细胞活力检测
- 轻轻涡旋混匀储备液后，加入早期细胞死亡报告试剂（VivaFix：每孔500 µL培养基中加入0.5 µL的50 µL储备液）。
- 将细胞接种于玻璃底多孔板中培养后，20分钟后直接进行成像，无需洗涤步骤，因为染料仅在细胞内发生一次荧光标记；或者可在共染4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和/或其他抗体后固定样本，再使用共聚焦显微镜成像。
5. 免疫染色
- 在 PBS 中加入 3.7% 多聚甲醛和 120 mM 蔗糖，于 37 °C 固定细胞 20 分钟。
- 用 0.2% Triton X-100 在室温下清洗并透化 5 分钟，然后用 2% 牛血清白蛋白（BSA）封闭 30 分钟。
- 吸除 BSA 溶液，无需清洗，于室温下与以下一抗共同孵育 1 小时：兔抗 MAP2 抗体（1:1,000）、鼠抗 β3 微管蛋白（TuJ1）抗体（1:2,000）、鸡抗 NeuN 抗体（1:100）和大鼠抗 CTIP2 抗体（1:500）；或用于突触染色的鼠抗 PSD95 抗体（1:200）、兔抗突触素 1 抗体（1:200）和鸡抗 MAP2 抗体。
- 用 PBS 洗涤后，在 37 °C 下与 Alexa Fluor 标记的二抗及 DAPI 共同孵育 45 分钟。
- 最后，在成像前用 PBS 洗涤两次。
6. 钙成像
- 在重铺板后第10天，用AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE（The Salk Institute for Biological Studies，GT3核心设施）感染培养的细胞，并在重铺板后3-4周进行成像，以评估自发性钙瞬变。
7. 图像采集与分析
注意：有关采集系统的详细信息，请参阅 Calabrese 等人的研究12。
- 使用成像模块进行手动或自动图像采集，并使用图像分析软件模块（如 CellProfiler13）进行形态计量学测量。
- 通过测量每个视野中 TuJ1 阳性神经突和 MAP2 阳性树突的总长度，除以同一视野内神经元的数量（DAPI + MAP2 或 TuJ1 阳性细胞），计算其平均长度。
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结果
对已分化数周的hiPSC来源神经元进行重铺板具有多项优势。然而，分离和重铺这些具有长而相互连接的树突和轴突的已分化神经元（图1A）可能导致大量神经元发生不可逆损伤。
如方案部分所述，我们使用蛋白水解酶孵育法将神经元从基质上解离。通常情况下，由于神经突具有致密的网状结构（图1A），细胞倾向于整体脱落，形成一层类似合胞体的结构，且常开始在孔内漂浮（图1C）。这一过程发生较快，可能因此大多数实验室通常仅在蛋白水解酶孵育5分钟后即收集细胞，并立即通过吹打（反复移液）将细胞层打散。然而，这种机械操作似乎会给神经元带来较大应激。我们认为应激程度可能与神经网络覆盖的面积成正比，因为我们发现，在10 cm或更大的培养皿中，因蛋白酶孵育不足所导致的明显损伤比在35 mm或更小的培养皿中更为严重。因此，出乎意料的是，我们将酶...
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讨论
我们展示了一种简单直接的人类神经元培养物重悬与再接种操作流程，该方法在保持与高内涵筛选平台及其他药物发现相关检测兼容的同时，优化了细胞存活率、分化成功率以及亚细胞成像效果。图6展示了整体工作流程及此类应用的示例。
尽管本文重点关注定向分化为皮层神经元命运的hiPSC来源神经元，但我们预计该方法同样适用于人胚胎干细胞来源的神经元，以及定向分化为其他神经元表型的干细胞来源神经元14,15,16,17,18。此外，我们推测这种延长的蛋白酶处理步骤可能对其他需要重悬已形成神经突网络的细胞的情形也有益处，例如用于原代神经元的FACS分选或单细胞分析19,...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作是国家合作重编程细胞研究组（NCRCRG）研究精神疾病项目的一部分，由美国国立卫生研究院（NIH）基金 U19MH107367 资助。初期工作还得到了 NIH 基金 NS070297 的支持。我们感谢索尔克研究所（The Salk Institute）的 Carol Marchetto 博士和 Fred Gage 博士提供了神经前体细胞的 WT 126 细胞系，以及加州大学圣地亚哥分校（UC San Diego）的 Eugene Yeo 博士和 Lawrence Goldstein 博士提供了神经前体细胞的 CVB WT24 细胞系。我们感谢安妮·邦（Anne Bang）博士实验室、桑福德伯纳姆普雷比斯医学发现研究所（Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute）的 Deborah Pre 在讨论中提供的有益建议。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 传代后培养基 | |||
| L-抗坏血酸 | Sigma | A4403 | 将1 mL 200 mM 储液加入1 L N2B27培养基中 |
| 二丁酰-cAMP | Sigma | D0627 | 添加至终浓度1 µM |
| 人源BDNF | Peprotech | 450-02 | 终浓度为10 ng/mL |
| B27 (50倍浓缩液) | Thermofisher Scientific | 17504044 | 向1 L N2B27培养基中加入20 mL |
| 含Glutamax的DMEM/F12 | Thermofisher Scientific | 31331093 | 加入N2后分装至50 mL离心管中；用封口膜密封管盖 |
| 人源GDNF | Peprotech | 450-10 | 终浓度为10 ng/mL |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | 向1 L N2B27培养基中加入10 mL；谷氨酰胺补充剂 |
| 小鼠层粘连蛋白 | Sigma | P3655-10mg | 向50 mL N2B27中加入100 µL |
| MEM非必需氨基酸 | Thermofisher Scientific | 11140035 | 向1 L N2B27培养基中加入5 mL |
| N2 (100倍浓缩液) 补充剂 | Life Technologies | 17502048 | 向500 mL培养基中加入5 mL |
| Neurobasal A 培养基 | Thermofisher Scientific | 10888022 | 与DMEM/F12混合配制N2B27培养基，用于CVB wt细胞；神经基础A培养基 |
| Neurobasal 培养基 | Thermofisher Scientific | 21103049 | 用于WT126细胞；神经基础培养基 |
| SM1 补充剂 | StemCell Technologies | 5711 | 按1:50比例加入培养基 |
| 碳酸氢钠 | Thermofisher Scientific | 25080-094 | 向1 L N2B27培养基中加入10 mL |
| 培养板制备 | |||
| 10 cm 组织培养皿 | Fisher Scientific | 08772-E | 塑料材质，经组织培养处理 |
| 6孔组织培养皿 | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST品牌培养板 |
| 小鼠层粘连蛋白 | Life Technologies | 23017-015 | 以1:400比例包被塑料表面 |
| 多聚鸟氨酸 | Sigma | P3655-10mg | 以1:1,000比例包被塑料表面 |
| 超纯去离子水 | Life Technologies | 10977-015 | 用于稀释多聚-L-鸟氨酸 |
| 传代试剂 | |||
| 100 mM 细胞筛 | Corning | 431752 | 无菌，独立包装 |
| 未包被384孔板 | PerkinElmer | 6007550 | 需用PLO和层粘连蛋白包被 |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | 杜氏磷酸盐缓冲液 |
| 聚-D-赖氨酸预包被384孔板 | PerkinElmer | 6057500 | 包被层粘连蛋白前需清洗 |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | 每10 cm培养皿加1 mL，作用30–45分钟；蛋白水解酶 |
| 固定材料 | |||
| 37% 甲醛 | Fisher Scientific | F79-1 | 溶于PBS中 |
| 蔗糖 | Fisher Scientific | S5-12 | 每10 mL固定液中加入0.8 g |
| 免疫染色材料 | |||
| Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠二抗 | Invitrogen | A-11001 | 二抗 |
| Alexa Fluor 568 山羊抗鸡二抗 | Invitrogen | A-11041 | 二抗 |
| Alexa Fluor 647 山羊抗鸡二抗 | Invitrogen | A-21449 | 二抗 |
| Alexa Fluor 561 山羊抗大鼠二抗 | Invitrogen | A-11077 | 二抗 |
| DAPI | Biotium | 40043 | 用于DNA染色 |
| 小鼠抗β3-微管蛋白抗体 (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | 早期神经元标志物 |
| 大鼠抗CTIP2抗体 | Abcam | ab18465 | 大脑皮层第5/6层神经元标志物 |
| 鸡抗MAP2抗体 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | 早期神经元标志物 |
| 鸡抗NeuN抗体 | Millipore | ABN91 | 晚期神经元标志物 |
| 兔抗MAP2抗体 | Shelley Halpain | N/A | 早期神经元标志物 |
| 小鼠抗PSD-95抗体 | Sigma | P-246 | 突触后标志物 |
| 兔抗Synapsin 1抗体 | Millipore | AB1543 | 突触前标志物 |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 配制成10% PBS溶液用于封闭 |
| 吐温X-100 | Sigma | 9002931 | 用PBS稀释至0.2%用于细胞通透 |
| 细胞活力标记物 | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | 细胞死亡标志物 |
| 钙成像 | |||
| 试剂/设备名称 | 公司 | 货号 | 备注/说明 |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | 基于病毒递送系统的钙离子报告分子 |
| 人诱导多能干细胞来源的神经前体细胞 | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto 等, 2010 |
| CVB WT24 | Yeo 和 Goldstein 实验室 | N/A | 未发表 |
参考文献
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