分化后再蛋白的人类多能干细胞衍生神经元，用于高含量的内尿成生和突合性成熟筛查

Summary

该协议描述了一个详细的程序，用于重新悬浮和培养人类干细胞衍生神经元，这些神经元以前在体外与神经祖细胞分离了数周。该程序有助于以与光显微镜和高含量筛选相兼容的格式对神经亮物、突触和晚表达神经元标记进行基于成像的检测。

Abstract

在二维培养中与人类多能干细胞衍生神经祖细胞（NPC）区分的神经元，是探索疾病机制和进行高含量筛选（HCS）以询问化合物的强大模型系统库或识别基因突变表型。然而，随着人类细胞从NPC过渡到功能，成熟的神经元需要几个星期。突触通常在单层培养中分化 3 周后开始形成，并且几种神经元特异性蛋白质（例如后来表达的泛神经元标记 NeuN 或第 5/6 层脑皮质神经元标记 CTIP2）开始表达分化后约4-5周。这种较长的区分时间可能与用于小容量多井 HCS 平台的最佳培养条件不兼容。许多挑战包括需要粘附良好、均匀分布的细胞，并实现最小的细胞聚类，以及培养促进长期活力和功能突触成熟的过程。一种方法是以大体积格式区分神经元，然后在 HCS 兼容多孔的稍后时间点重新加板。使用这种再镀层方法时，由于树突状和斧状网络的紧张中断，一些主要的挑战涉及可重复性和细胞活力。在这里，我们演示了酶重新悬浮人类诱导多能干细胞（hiPSC）衍生神经元的一个详细和可靠的程序，在它们分化4-8周后，以大体积的形式，将它们转移到384孔微蒂板，并培养他们进一步1-3周与优秀的细胞生存。这种人类神经元的再光，不仅允许在两周内研究突触组装和成熟，而且还能研究神经素再生和生长锥体特性。我们使用384井平台为神经生成和突触发生提供可扩展的测定示例。

Introduction

人类多能干细胞（hiPSC）衍生的神经元在基础研究、药物开发和再生医学领域越来越相关。工作流程和程序，以优化他们的文化和维护，提高效率分化成特定的神经元亚型，正在迅速演变1，2。为了提高人类干细胞衍生神经元的效用和成本效益，作为在药物发现和目标验证中适应高含量分析的模型系统，减少成熟、功能性生成所需的培养时间是有益的神经元，同时保持最大的鲁棒性、可重复性和表型相关性。虽然三维有机体培养物正在推动神经发育研究的突破3，但二维单层培养物由于其最小的组织厚度，与基于自动成像的应用特别兼容。

然而，根据人类神经和神经发育疾病模型调整基于成像的筛查方法面临重大挑战。人类神经系统在体内成熟的漫长时间要求延长培养时间，以适应基因表达的自然程序，实现神经元成熟。

冗长的神经元分化程序的一个实际后果是，hiPSC衍生的单层培养物的维持必须持续数周，以实现足够的突触成熟。在此期间，保持未分化的神经祖体继续分裂。这些可以迅速过度生长的培养和篡夺所需的营养成分，以保持可行的后分体神经元。大力分割神经祖细胞（NPC）也可以与神经元竞争生长基质。这会使这些培养物受到粘附不良问题的影响，这种情况不适合基于成像的测定。此外，许多研究者发现，培养体积越小，维持健康人群的分化神经元的难度越大，足以观察神经元分化的晚期。换句话说，使用高含量筛选 （HCS） 方法进行突触成熟检测对于人类衍生的神经元来说可能非常具有挑战性。

为了规避其中一些问题，使用了重新悬浮和重新镀层以前分化的hiPSC衍生神经元的过程。首先，它允许研究神经质外生长（或更准确地说，神经质再生）在完全承诺的神经元群体。其次，将先前分化的神经元从大体积格式（如 10 厘米板或更大）重新调出，再到小体积格式（如 HCS 兼容的 96 或 384 孔微小质板），可显著减少总培养时间。小体积条件。这有利于研究突触组装和随后在体外几周的成熟。

然而，已经建立长神经酸盐和复杂连接网络的成熟神经元的重新电化带来了几个挑战，其中之一是细胞死亡率有时很高且可变。在这里，我们描述了一个再电化过程，它能产生优异的细胞存活率和可重复性。通常，神经元暴露于蛋白水解酶短的潜伏期（通常±3-10分钟），以便在三次三次分离之前从基质分离细胞。这个短暂的蛋白解时间通常用于重新悬浮和传递许多类型的分裂细胞，包括非神经细胞和未分化的祖细胞4，5，6。然而，对于具有长、相互连接的神经质的分化神经元，不仅要从基底分离细胞，而且必须破坏树突状和斧状网络，以便分离单个细胞，同时尽量减少损伤。事实上，神经元的厚网状通常倾向于从基底分离为单个表，而不是单个细胞。如果不注意放松厚厚的神经酸盐网络，神经元不仅在三聚过程中变得不可逆转地受损，而且其中许多神经元无法通过用于去除团块的过滤器，导致细胞产量差。下面我们描述了对广泛使用的蛋白酶孵化程序的简单修改，以对抗这些困难。

在下面描述的协议中，神经元用温和的蛋白酶（如蛋白酶）孵育40-45分钟，如蛋白酶（例如，Accutase）。在加入酶后的前 5-10 分钟，神经元网络从基底以片形上升出。在进行温和的三聚和过滤之前，使用蛋白酶孵育30-40分钟。这种额外的孵育时间有助于确保材料的消化放松细胞间网络，从而确保随后的三次三次培养产生单个细胞的悬浮。此过程在重新镀层时最大化细胞分布的均匀性，同时最大限度地减少细胞死亡。我们已经成功地将这种再电化方法应用于由各种分化协议7、8和从HiPSCs各行生成的hiPSC衍生神经元培养物。该程序名义上适用于大多数或所有干细胞衍生神经元的行。我们观察到，延长蛋白酶孵育时间对于从小尺寸板（例如直径35毫米）重新镀层培养物并非绝对必要;然而，正如我们在这里展示的，它提供了一个显著的好处，当从大直径板（例如，直径10厘米或更大），可能是因为神经酸盐在此类板可以延长很长的过程，并形成一个密集互连的阵列。

在这里，我们演示了这种方法，并简要说明了它在早期神经生成和突触成熟测定中的应用，这涉及到沿树突和斧头聚集前和后发蛋白，然后它们后来在突触部位进行联合定位。这些示例强调了该协议在保持细胞活力和可重复性方面的优势。首先，它允许研究者研究人类神经发生的早期步骤。实验环境类似于常用的啮齿动物皮质或海马神经元的主要培养物，其中细胞从晚期胎儿或产后早期大脑提取，在温和的蛋白酶治疗后通过三聚体分离，并允许启动神经酸盐或再生在程序9，10中被切断的中微子。与这种啮齿动物原神经元类似，hiPSC衍生的神经元在重新镀层后几小时内开始形成或再生其神经质，允许在最佳环境中对生长锥和神经质形态进行成像，而较少周围未分化的细胞。我们观察到，与神经元首次开始从祖体群中分化时看到的可变延迟和不同的生长速率相比，神经质外生长更加同步。此外，重新镀层能够检测神经元表达神经元亚型标记，通常出现在稍后的神经发育，如皮质层5/6转录因子CTIP2（鸡奥巴平上游启动子转录因子相互作用蛋白2），或泛神经元标记NeuN1。重新镀层方法的一个特别有用的特征是突触发生在与HCS兼容的时限内进行。

Protocol

1. 再镀层前的分化期

1. 在10厘米的菜肴上区分神经元，使用选择7，8的协议，直到神经元已经形成了一个厚厚的网络与他们的过程，并表达不仅早期的神经元标记，如MAP2或TuJ1，但也后期标记，如NeuN。
2. 在神经元分化过程中，每4天改变一半选择的介质。
   注:更广泛或频繁的介质变化会稀释必要的营养因素，并可能不利于成熟。
   1. 对于 iPSC 衍生的 WT126 神经元， 使用以下分化后培养介质:5 mL 100x N2 补充剂、10 纳克/mL BDNF、10 纳克/mL GDNF、1 μg/mL 层宁、200 μM 抗坏血酸、1 μM 二丁基林-cAMP 和 10 mL SM1，用于 500 mL Dulbecco 的改性鹰的介质/营养混合物F-12（DMEM/F12）。逐渐，使用半介质的变化，替换为神经基础介质（材料表）和相同的补充。
   2. 对于 iPSC 衍生的 CVB WT 神经元，使用以下分化后培养介质:500 mL 神经基础 A 介质（材料表）和 500 mL DMEM/F12 介质，含有 2 μg/mL 拉米宁、10 mL 谷氨酰胺补充剂（材料表），0.75 mg/mL 碳酸氢钠，5 mL 最低必需介质 （MEM） 非必需氨基酸，0.2 mM 抗坏血酸，10 纳克/mL BDNF，20 mL 50x B27 和 10 mL 100x N2 补充剂。

2. 涂覆多井

1. 重新镀层前一天，涂上多L-球质（PLO）。将PLO溶解在无菌水中，以制作库存溶液（10mg/mL）。将此库存储存在 -20°C。稀释 PLO 1:100 在水中，在涂覆玻璃时产生 50 μg/mL 的浓度，在涂覆塑料时产生 1:1，000 比 （10 μg/mL） 的浓度。
2. 将涂层直接涂在目标板上。使用适合板尺寸的涂层体积（即，对于 24 孔板，每孔应用 500 μL 的 PLO 溶液）。
3. 让盘子在室温下在黑暗中过夜。
4. 在重新镀层当天取回涂层板，并转移到无菌生物安全柜中。
5. 吸出PLO溶液，用无菌水冲洗两次。
6. 在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中稀释拉米宁 （1.15 mg/mL），稀释 1:400。
   注:在4°C下解冻层压，并迅速添加到PBS中，以避免层宁和不均匀涂层聚集。
7. 吸气无菌水，将500μL的层压涂层涂在以前涂有PLO的井上。
8. 将板放入 37°C 培养箱中，至少 4-6 小时。对玻璃表面使用更长的孵育，长达 16 小时。使用一致的孵育时间。

3. 重新镀分分化的神经元

1. 用PBS轻轻冲洗一盘分化的神经元。将PBS轻轻从板壁上向下散开，而不是直接放在细胞上，以避免干扰它们。
2. 轻轻吸吸PBS，小心避免直接接触细胞，但从盘子的边缘吸气，同时向研究人员倾斜。
3. 每10厘米板至少应用1mL的蛋白解物酶（材料表），并将细胞返回到培养箱。如果组织培养室由于湿度低而表现出较高的蒸发率，则增加稍高的体积。
4. 用蛋白解酶孵育细胞40-45分钟，以便将它们从板中分离出来，并从神经元网络内的其他神经元分离。
   注:此步骤的计时至关重要。过早淬火蛋白酶会导致重新镀层后细胞死亡增加。蛋白解酶制造商建议，温度应远低于37°C，对传形细胞系的孵育期较长（例如，在4°C过夜）。然而，应避免在4°C下处理神经元，因为它们在冷暴露后通常表现出较差的存活率。制造商还指出，在37°C下用这种酶孵育60分钟会导致酶失活。然而，根据作者的经验，在37°C下培养40-45分钟的hiPSC衍生神经元培养物，足以在重新电镀时进行有效的解散和优异的神经元存活。
5. 在孵育期间检查相对比显微镜上的神经元，并允许蛋白酶治疗继续进行，直到神经网络从板中完全分离，并在短暂地摇动下板后，开始在较小的片中分离。显微镜。
6. 在10cm的板中，使用每1mL蛋白酶的5 mL新鲜DMEM培养基来抑制蛋白酶活性，以阻止消化。使用血清移液器，将细胞轻轻三聚于板上5-8次，以破坏网络。当三角化时，小心不要施加太大的压力，因为分化的神经元是脆弱的。不要使用P1000尖端，因为末端太锋利和狭窄，因此可以纯粹或损坏神经元。
7. 通过直径为 100 μm 网格的细胞滤网将溶液与细胞一起涂抹到新的 50 mL 锥形管中。
8. 在细胞过滤后，用额外的 5 mL 新鲜 DMEM 介质冲洗滤网。
9. 在台式离心机中旋转细胞，在 1，000 x g下旋转 5 分钟。
10. 将锥形管返回到生物安全柜并吸出大部分介质，留下约 250 μL，以确保细胞保持水分。
11. 在 2 mL 的新鲜 DMEM 介质中轻轻重新悬浮细胞。请勿将颗粒移移到管侧。相反，轻轻反转圆锥形2-3次，并通过5mL血清液液的末端的细胞将其移开。
12. 在细胞仪的边缘上应用10μL的再悬浮神经元。
13. 加入8-10 μL的锥蓝色到细胞滴，以评估细胞的活力在此重新悬浮步骤。将10μL的混合物涂抹于血细胞计或其他自动细胞计数器上。评估那些相亮的细胞，并排除锥片蓝色染料。
14. 确定活细胞/mL的量，并准备根据所需的细胞密度稀释锥形管的含量。
15. 384孔板每孔板10，000个细胞;板 £150，000-200，000 细胞每孔为 24 孔板。
16. 根据特定细胞系的要求，在再悬浮细胞的锥形管中加入新鲜的DMEM，以实现适当的稀释，并添加额外的适当补充剂，如B27和/或BDNF。
17. 轻轻倾斜锥形管，混合2-3次。
18. 使用 16 通道移液器从 24 孔板或 384 孔多孔板吸气层压片中吸气层，并用 PBS 冲洗一次。
19. 使用 P1000 的 P1000 吸气 PBS 用于 24 孔板，或用于 384 孔板的 16 通道移液器。
20. 在图八运动中将细胞溶液应用于每个孔，以避免结块。电镀均匀性也可以通过使用自动化液体处理设备进行优化。
    注:从重新镀层后2-4天开始向介质中添加层压酰辛也有助于维持细胞的同质分布。
21. 对每口井重复步骤 3.19 和 3.20。
22. 将板返回到 37°C 和 5% CO₂的培养箱设置。
23. 2 天后，使用第 1.2 节中所述的分化后培养介质，开始每 4 天更换一半介质。在所需的成熟时间后，在37°C下使用3.7%甲醛修复培养物，并根据实验要求染色细胞。

4. 细胞活力测定后再镀

1. 在短暂涡旋库存溶液后，添加早期细胞死亡报告器（VivaFix:每孔 50μL 培养基50μL库存溶液的0.5 μL）。
2. 在玻璃底多孔上培养的活细胞和死细胞，20分钟后，没有任何洗涤步骤，因为染料在细胞内只产生一次荧光，或在成像前与4'，6-二酰胺-2-phenylindole（DAPI）和/或其他抗体一起修复和共同染色使用共聚焦显微镜。

5. 免疫染色

1. 在 37°C 下用 3.7% 甲醛加 120 mM 蔗糖固定培养物 20 分钟。
2. 在室温下用0.2%Triton X-100冲洗和渗透5分钟，然后用2%牛血清白蛋白（BSA）块住30分钟。
3. 在室温下用兔抗MAP2抗体1:1，000吸气BSA，小鼠抗β3图布林（TuJ1）抗体1:2，000，鸡抗NeuN抗体（1:100）和大鼠抗CTIP2抗体（1:500），或小鼠抗PSD95（1:500）孵育1小时1:200），兔抗突生1（1:200）和鸡抗MAP2抗体，用于突触染色。
4. 用PBS冲洗，并在37°C下用Alexa氟结合的二级抗体加DAPI孵育45分钟。
5. 最后，在成像前用PBS洗涤两次。

6. 钙成像

1. 在重新镀层后 10 天内用 AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE（Salk 生物研究所，GT3 核心设施）感染培养细胞，以评估重新镀层后 3-4 周的自发钙瞬变。

7. 图像采集和分析

注:有关收购系统的详细信息，请参阅 Calabrese 等人¹²。

1. 使用图像模块进行手动或自动图像采集，使用图像分析软件模块（如 CellProfiler^13）进行形态测量。
2. 通过测量每个视场的总长度除以同一场内的神经元数（DAPI = MAP2 或 TuJ1 阳性细胞），计算 TuJ1 阳性神经酸盐和 MAP2 正树突的平均长度。

Results

重插出经过数周差异化的hiPSCs衍生神经元具有若干优点。然而，分离和重新镀灭具有长、相互连接的树突和斧头的分化神经元（图1A）可能导致大量不可逆转的受损神经元。

如协议部分所述，我们使用培养与蛋白解酶分离神经元从基质。通常，由于中微石的厚网状（图1A），细胞往往一次性分离为单个同步层，通常开始在井中漂浮（图1C）。这种情况发生得相当快，也许这也是为什么大多数实验室倾向于在孵育5分钟后用他们选择的蛋白解酶收集细胞，并立即通过三聚体（上下移）来分解细胞片。然而，这种机械操作似乎导致神经元的高压力。我们认为，压力程度可能与神经元网络覆盖的区域成正比，因为我们发现蛋白酶孵育不足对10厘米或更大的板的明显损伤大于35毫米或更小的板。因此，与直觉相反，我们发现，将酶孵育时间延长到40-45分钟可减少细胞分离时细胞死...

Discussion

我们展示了一种直接的人类神经元培养物的再悬浮和再镀层程序，以与高含量筛选平台兼容的方式优化生存能力、分化成功和亚细胞成像，和其他与药物发现有关的测定。图 6说明了整个工作流和此类应用程序的示例。

虽然在这里，我们专注于hiPSC衍生的神经元，这是针对皮质神经元的命运，我们期望这种方法应同样适用于人类胚胎干细胞衍生神经元，以及干细胞衍生神经元，针对其他神经元表型14，15，16，17，18。此外，我们假设这种扩展蛋白酶程序可能有利于其他需要重新悬浮具有已建立神经质网格的细胞的情况，例如用于FACS排序或主神经元的单细胞^分析19,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<强>重新接种培养基
L-抗坏血酸	Sigma	A4403	将 1 mL 的 200 mM 原液添加到 1 L N2B27 培养基中
二丁酰基-cAMP	Sigma	D0627	添加 1 和微量;M
人 BDNF	Peprotech	450-02	10 ng/ml 终浓度
B27 （50x）	Thermofisher Scientific	17504044	将 20 mL 加入 1 L N2B27 培养基
DMEM/F12 中，含 Glutamax	Thermofisher Scientific	31331093	添加 N2 并分布在 50 mL 锥形瓶中;封口膜包装盖
人 GDNF	Peprotech	450-10	10 10 ng/mL 终浓度
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050038	向 1 L N2B27 培养基中加入 10 ml;谷氨酰胺补充剂
层粘连	蛋白	Sigma P3655-10mg	添加 100 &微量;L 至 50 mL N2B27
MEM 非必需氨基酸	Thermofisher Scientific	11140035	添加 5 mL 至 1 L N2B27 培养基
N2 （100x） 补充剂	Life Technologies	17502048	添加 5 mL 至 500 mL 培养基
Neurobasal A 培养基	Thermofisher Scientific	10888022	与 DMEM/F12 结合，生成用于 CVB wt 细胞的 N2B27 培养基;神经基础 A 培养基
Neurobasal 培养基	用于	WT126 细胞	21103049
SM1 补充剂	StemCell Technologies	5711	向培养基中加入 1：50
氢钠	Thermofisher Scientific	25080-094	向 1 L N2B27 培养基中加入 10 mL
板制备
10 cm 组织培养皿	Fisher Scientific	08772-E	塑料 TC 处理培养皿
6 孔组织培养皿	Thomas Scientific	1194Y80	NEST 板
小鼠层粘连	Life Technologies	23017-015	上以 1：400 的比例添加
			1：1,000
超纯蒸馏水	Life Technologies	10977-015	稀释Poly-L-鸟氨酸
Replating 试剂
100 mM 细胞过滤器	康宁	431752	无菌、独立包装
的 384 孔板、无涂层	珀金埃尔默	6007550	涂层，含 PLO 和层粘连蛋白
DPBS	Life Technologies	14190144	Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水
聚-D-赖氨酸预包被 384 孔板	PerkinElmer	6057500	涂覆层粘连蛋白
StemPro Accutase	Life Technologies	A1110501	涂覆 1 mL/10 cm 板 30-45 分钟;蛋白水解酶
<强>固定材料
37% 甲醛	Fisher Scientific	F79-1	溶于 PBS
蔗糖	费舍尔科学	S5-12	每 10 mL 固定剂 0.8 克
免疫染色材料
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠	Invitrogen	A-11001	二抗
Alexa Fluor 568 山羊抗鸡	Invitrogen	A-11041	二抗
Alexa Fluor 647 山羊抗鸡	Invitrogen	A-21449	二抗
Alexa Fluor 561 山羊抗大鼠	Invitrogen	A-11077	二抗
DAPI	Biotium	40043	可视化 DNA
小鼠抗体 抗 b3-微管蛋白 （TuJ-1）	神经组学	MO15013	早期神经元标志物
抗 CTIP2 的大鼠抗体	Abcam	ab18465	第 5/6 层皮质神经元
针对 MAP2 的鸡抗体	Lifespan Biosciences	LS-B290	早期神经元标志物
针对 NeuN	Millipore	ABN91	晚期神经元标志物
针对 MAP2	Shelley Halpain	N/A	早期神经元标志物
针对 PSD-95	Sigma	P-246	突触后标志物的小鼠抗体
突触蛋白 1	Millipore	AB1543	突触前标志物
牛血清白蛋白 （BSA）	GE Healthcare Life Sciences	SH30574.02	10% 的 PBS 溶液用于阻断
Titon X-100	Sigma	9002931	稀释至 0.2% 的 PBS 用于透
Vivaability Markers
Vivafix649/660	Biorad	135-1118	细胞死亡标志物
钙成像
/设备名称	公司	货号	注释/描述
AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE	SALK INSTITUTE，GT3 核心设施	N/A	病毒递送系统中的钙报告基因
hiPSC 衍生的 NPC
WT 126 （Y2610）	Gage 实验室	N/A	Marchetto et al.， 2010
CVB WT24	Yeo and Goldstein labs	N/A	未发表