本方案详细描述了人干细胞来源神经元的重悬与培养步骤，这些神经元此前已在体外由神经前体细胞分化数周。该操作流程适用于基于成像的检测方法，可对神经突、突触以及晚期表达的神经元标志物进行分析，且兼容光学显微镜和高内涵筛选实验体系。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
由人多能干细胞衍生的神经前体细胞（NPCs）在二维培养条件下分化而来的神经元，是一种强大的模型系统，可用于探索疾病机制，并开展高内涵筛选（HCS），以检测化合物文库或鉴定基因突变的表型。然而，在人源细胞中，从NPC向功能成熟神经元的转变通常需要数周时间。在单层培养中，突触通常在分化后3周左右开始形成，而多种神经元特异性蛋白，例如晚期表达的泛神经元标志物NeuN，或大脑皮层第5/6层神经元标志物CTIP2，则在分化后约4-5周开始表达。这种漫长的分化周期可能与适用于小体积、多孔板HCS平台的最佳培养条件不兼容。其中诸多挑战包括：需要细胞贴壁良好、分布均匀且细胞聚集成簇最少，以及培养过程需支持长期存活和功能性突触的成熟。一种解决策略是在大体积培养体系中进行神经元分化，随后在特定时间点将其重新接种至适用于HCS的多孔板中。然而，采用这种重接种策略时面临的主要挑战在于可重复性和细胞存活率，原因在于树突和轴突网络在操作过程中会受到机械性损伤而产生应激。本文展示了一种详细且可靠的实验流程：将人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的神经元在大体积培养体系中分化4-8周后，通过酶法将其重新悬浮，转移至384孔微孔板，并继续培养1-3周，获得优异的细胞存活率。这种人神经元的重接种方法不仅可在重接种后两周内实现突触组装与成熟的研究，还可用于神经突再生及生长锥特征的分析。我们提供了基于384孔平台的可扩展化神经突生成和突触生成检测方法的实例。
引言
人多能干细胞（hiPSC）来源的神经元在基础研究、药物开发和再生医学领域的重要性日益凸显。目前，优化其培养与维持的流程以及提高向特定神经元亚型分化效率的方法正在迅速发展1,2。为了提升人干细胞来源神经元作为药物发现和靶点验证中适用于高内涵分析的模型系统的实用性和成本效益，有必要缩短获得成熟且具有功能的神经元所需的培养时间，同时最大限度地保持其稳健性、可重复性和表型相关性。尽管三维类器官培养正在推动神经发育研究的突破3，但二维单层培养由于组织厚度极小，特别适用于基于自动化成像的应用。
然而，将基于成像的筛选方法应用于人类神经系统疾病和神经发育疾病模型时面临一个重大挑战。人类神经系统在体内成熟所需的时间较长，因此需要延长体外培养时间，以适应基因表达的自然程序并实现神经元的成熟。
神经元分化程序耗时较长，其一个实际后果是，为了获得足够成熟的突触，必须将由hiPSC诱导的单层培养物维持数周之久。在此期间，仍处于未分化状态的神经前体细胞会持续分裂。这些细胞可能迅速过度生长，并消耗维持有活性的终末分化神经元所需的营养物质。活跃分裂的神经前体细胞（NPCs）还可能与神经元竞争生长基质，导致培养物容易出现贴壁不良的问题，从而不适合基于成像的检测分析。此外，许多研究者发现，培....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 传代前的分化时期
- 使用选定的方案7,8在10 cm培养皿中进行神经元分化，直至神经元形成密集的突起网络，并不仅表达早期神经元标志物（如MAP2或TuJ1），还表达晚期标志物（如NeuN）。
- 在神经元分化过程中，每4天更换一半选定的培养基。
注意： 更大量或更频繁的换液会稀释关键的营养因子，可能不利于神经元成熟。- 对于iPSC来源的WT126神经元，使用以下分化后培养基：在500 mL达尔伯克改良伊格尔培养基/营养混合物F-12（DMEM/F12）中加入5 mL 100倍N2补充剂、10 ng/mL BDNF、10 ng/mL GDNF、1 µg/mL层粘连蛋白、200 µM抗坏血酸、1 µM二丁酰-cAMP以及10 mL SM1。通过半量换液的方式逐步替换为神经基础培养基（材料表）及相同的补充成分。
- 对于iPSC来源的CVB WT神经元，使用以下分化后培养基：500 mL神经基础A培养基（材料表）与500 mL DMEM/F12培养基混合，其中包含2 µg/mL层粘连蛋白、10 mL谷氨酰胺补充剂（材料表）、0.75 mg/mL碳酸氢钠、5 mL最低必需培养基（MEM）非必....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
对已分化数周的hiPSC来源神经元进行重铺板具有多项优势。然而，分离和重铺这些具有长而相互连接的树突和轴突的已分化神经元（图1A）可能导致大量神经元发生不可逆损伤。
如方案部分所述，我们使用蛋白水解酶孵育法将神经元从基质上解离。通常情况下，由于神经突具有致密的网状结构（图1A），细胞倾向于整体脱落，形成一层类似合胞体的结构，且常开始在孔内漂浮（图1C）。这一过程发生较快，可能因此大多数实验室通常仅在蛋白水解酶孵育5分钟后即收集细胞，并立即通过吹打（反复移液）将细胞层打散。然而，这种机械操作似乎会给神经元带来较大应激。我们认为应激程度可能与神经网络覆盖的面积成正比，因为我们发现，在10 cm或更大的培养皿中，因蛋白酶孵育不足所导致的明显损伤比在35 mm或更小的培养皿中更为严重。因此，出乎意料的是，我们将酶.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
我们展示了一种简单直接的人类神经元培养物重悬与再接种操作流程，该方法在保持与高内涵筛选平台及其他药物发现相关检测兼容的同时，优化了细胞存活率、分化成功率以及亚细胞成像效果。图6展示了整体工作流程及此类应用的示例。
尽管本文重点关注定向分化为皮层神经元命运的hiPSC来源神经元，但我们预计该方法同样适用于人胚胎干细胞来源的神经元，以及定向分化为其他神经元表型的干细胞来源神经元14,15,16,17,18。此外，我们推测这种延长的蛋白酶处理步骤可能对其他需要重悬已形成神经突网络的细胞的情形也有益处，例如用于原代神经元的FACS分选或单细胞分析19,.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作是国家合作重编程细胞研究组（NCRCRG）研究精神疾病项目的一部分，由美国国立卫生研究院（NIH）基金 U19MH107367 资助。初期工作还得到了 NIH 基金 NS070297 的支持。我们感谢索尔克研究所（The Salk Institute）的 Carol Marchetto 博士和 Fred Gage 博士提供了神经前体细胞的 WT 126 细胞系，以及加州大学圣地亚哥分校（UC San Diego）的 Eugene Yeo 博士和 Lawrence Goldstein 博士提供了神经前体细胞的 CVB WT24 细胞系。我们感谢安妮·邦（Anne Bang）博士实验室、桑福德伯纳姆普雷比斯医学发现研究所（Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute）的 Deborah Pre 在讨论中提供的有益建议。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 传代后培养基 | |||
| L-抗坏血酸 | Sigma | A4403 | 将1 mL 200 mM 储液加入1 L N2B27培养基中 |
| 二丁酰-cAMP | Sigma | D0627 | 添加至终浓度1 µM |
| 人源BDNF | Peprotech | 450-02 | 终浓度为10 ng/mL |
| B27 (50倍浓缩液) | Thermofisher Scientific | 17504044 | 向1 L N2B27培养基中加入20 mL |
| 含Glutamax的DMEM/F12 | Thermofisher Scientific | 31331093 | 加入N2后分装至50 mL离心管中；用封口膜密封管盖 |
| 人源GDNF | Peprotech | 450-10 | 终浓度为10 ng/mL |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | 向1 L N2B27培养基中加入10 mL；谷氨酰胺补充剂 |
| 小鼠层粘连蛋白 | Sigma | P3655-10mg | 向50 mL N2B27中加入100 µL |
| MEM非必需氨基酸 | Thermofisher Scientific | 11140035 | 向1 L N2B27培养基中加入5 mL |
| N2 (100倍浓缩液) 补充剂 | Life Technologies | 17502048 | 向500 mL培养基中加入5 mL |
| Neurobasal A 培养基 | Thermofisher Scientific | 10888022 | 与DMEM/F12混合配制N2B27培养基，用于CVB wt细胞；神经基础A培养基 |
| Neurobasal 培养基 | Thermofisher Scientific | 21103049 | 用于WT126细胞；神经基础培养基 |
| SM1 补充剂 | StemCell Technologies | 5711 | 按1:50比例加入培养基 |
| 碳酸氢钠 | Thermofisher Scientific | 25080-094 | 向1 L N2B27培养基中加入10 mL |
| 培养板制备 | |||
| 10 cm 组织培养皿 | Fisher Scientific | 08772-E | 塑料材质，经组织培养处理 |
| 6孔组织培养皿 | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST品牌培养板 |
| 小鼠层粘连蛋白 | Life Technologies | 23017-015 | 以1:400比例包被塑料表面 |
| 多聚鸟氨酸 | Sigma | P3655-10mg | 以1:1,000比例包被塑料表面 |
| 超纯去离子水 | Life Technologies | 10977-015 | 用于稀释多聚-L-鸟氨酸 |
| 传代试剂 | |||
| 100 mM 细胞筛 | Corning | 431752 | 无菌，独立包装 |
| 未包被384孔板 | PerkinElmer | 6007550 | 需用PLO和层粘连蛋白包被 |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | 杜氏磷酸盐缓冲液 |
| 聚-D-赖氨酸预包被384孔板 | PerkinElmer | 6057500 | 包被层粘连蛋白前需清洗 |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | 每10 cm培养皿加1 mL，作用30–45分钟；蛋白水解酶 |
| 固定材料 | |||
| 37% 甲醛 | Fisher Scientific | F79-1 | 溶于PBS中 |
| 蔗糖 | Fisher Scientific | S5-12 | 每10 mL固定液中加入0.8 g |
| 免疫染色材料 | |||
| Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠二抗 | Invitrogen | A-11001 | 二抗 |
| Alexa Fluor 568 山羊抗鸡二抗 | Invitrogen | A-11041 | 二抗 |
| Alexa Fluor 647 山羊抗鸡二抗 | Invitrogen | A-21449 | 二抗 |
| Alexa Fluor 561 山羊抗大鼠二抗 | Invitrogen | A-11077 | 二抗 |
| DAPI | Biotium | 40043 | 用于DNA染色 |
| 小鼠抗β3-微管蛋白抗体 (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | 早期神经元标志物 |
| 大鼠抗CTIP2抗体 | Abcam | ab18465 | 大脑皮层第5/6层神经元标志物 |
| 鸡抗MAP2抗体 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | 早期神经元标志物 |
| 鸡抗NeuN抗体 | Millipore | ABN91 | 晚期神经元标志物 |
| 兔抗MAP2抗体 | Shelley Halpain | N/A | 早期神经元标志物 |
| 小鼠抗PSD-95抗体 | Sigma | P-246 | 突触后标志物 |
| 兔抗Synapsin 1抗体 | Millipore | AB1543 | 突触前标志物 |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 配制成10% PBS溶液用于封闭 |
| 吐温X-100 | Sigma | 9002931 | 用PBS稀释至0.2%用于细胞通透 |
| 细胞活力标记物 | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | 细胞死亡标志物 |
| 钙成像 | |||
| 试剂/设备名称 | 公司 | 货号 | 备注/说明 |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | 基于病毒递送系统的钙离子报告分子 |
| 人诱导多能干细胞来源的神经前体细胞 | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto 等, 2010 |
| CVB WT24 | Yeo 和 Goldstein 实验室 | N/A | 未发表 |
参考文献
- Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research. Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).
- Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
