茶树（Camellia sinensis L.）叶片新建立的悬浮细胞培养体系中六种系统性杀虫剂代谢的研究

摘要

本研究提出了一种从茶（Camellia sinensis L.）叶片建立细胞悬浮培养体系的实验方案，可用于研究整株植物可吸收的外源化合物（如杀虫剂）的代谢过程。

摘要

开发了一种利用茶树体外组织研究杀虫剂代谢的平台。将无菌茶苗的叶片接种于添加植物激素2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D，1.0 mg L^-1）和激动素（KT，0.1 mg L^-1）的MS基本培养基上，诱导其形成疏松愈伤组织。经过3至4轮、每轮28天的继代培养后，获得愈伤组织。将约3 g疏松愈伤组织接种至含相同植物激素的B5液体培养基中，在黑暗条件下于25 ± 1 °C的摇床（120 rpm）中进行培养。经过3−4次继代培养后，建立了来源于茶树叶片的细胞悬浮系，继代比例为1:1至1:2（悬浮母液：新鲜培养基）。利用该平台，向茶树叶片来源的细胞悬浮培养物中添加六种杀虫剂（每种浓度均为5 µg mL^-1），分别为噻虫嗪、吡虫啉、啶虫脒、氯噻啉、敌敌畏和氧乐果。采用液相色谱和气相色谱技术追踪这些杀虫剂的代谢过程。为验证茶树细胞悬浮培养体系的有效性，通过质谱法比较了经处理的细胞培养物与完整植株中噻虫嗪和敌敌畏的代谢产物。在处理后的茶树细胞培养物中检测到七种噻虫嗪代谢物和两种敌敌畏代谢物，而在处理后的完整植株中仅检测到两种噻虫嗪代谢物和一种敌敌畏代谢物。与使用完整茶树植株相比，细胞悬浮培养体系简化了代谢分析过程，尤其适用于茶叶这类复杂基质的研究。

引言

茶是全球消费最广泛的非酒精饮料之一^1,2。茶由木本多年生植物Camellia sinensis L.的叶片和芽叶加工而成。茶树通常在大规模种植园中栽培，易受多种害虫侵袭^3,4。有机磷类和新烟碱类杀虫剂常作为内吸性杀虫剂⁵用于防治粉虱、叶蝉及某些鳞翅目昆虫等茶树害虫^6,7。施用后，这些杀虫剂可被植物吸收或在体内转运。在植物体内，内吸性杀虫剂可能通过植物酶催化的水解、氧化或还原反应发生转化。这些转化产物通常比母体化合物极性更强、毒性更低。然而，某些有机磷类化合物的代谢产物生物活性反而更高。例如，乙酰甲胺磷可代谢为毒性更强的甲胺磷^8,9，乐果可转化为氧乐果^10,11。因此，植物代谢研究对于明确农药在植物体内的归趋具有重要意义¹²。

植物组织培养已被证明是研究农药代谢的有效平台，所鉴定的代谢产物与在完整植株中发现的相似^13,14,15。利用组织培养，特别是细胞悬浮培养，具有多个优势。首先，实验可在无微生物条件下进行，从而避免了微生物对农药转化或降解的干扰。其次，组织培养可随时提供一致的实验材料。第三，与完整植株相比，从组织培养中提取代谢产物更为容易，且组织培养中干扰性化合物更少，化合物组成更简单。最后，利用组织培养可在单次实验中更方便地比较一系列农药的代谢情况¹⁶。

本研究成功建立了来源于无菌培养茶苗叶片的细胞悬浮体系。利用该茶细胞悬浮培养体系，比较了六种内吸性杀虫剂的消解行为。

本详细实验方案旨在提供一些指导，以便研究人员建立可用于研究外源物质在茶树中代谢去向的植物组织培养平台。

方案

1. 茶叶愈伤组织培养

注意：无菌叶片来源于本研究团队先前建立的体外培养植株系¹⁷。除在培养箱中培养的时间外，第5节之前的所有操作均在无菌超净工作台中进行。

1. 在高压灭菌（121 °C，20 分钟）前，将两种培养基（Murashige 和 Skoog [MS] 基本培养基与 Gamborg's B5 液体培养基）的 pH 值调节至 5.8。
2. 用剪刀沿无菌叶片的中脉剪开，然后在培养皿中将每一半进一步分割成约 0.3 cm × 0.3 cm 的小片。
3. 将无菌外植体（即小叶片段）放置于含有植物激素 2,4-D（1.0 mg L^-1）和 KT（0.1 mg L^-1）的 MS 基本培养基上。每个装有 100 mL MS 基本培养基的 300 mL 三角瓶中可放置六个外植体。
4.  将上述叶外植体在黑暗条件下于 25 °C 恒温培养。28 天后，选取第一代诱导出的愈伤组织并转移至新的三角瓶中（继代培养）。经过 3−4 次继代培养后，获得疏松易碎的愈伤组织。

2. 茶细胞悬浮培养

1. 在无菌条件下，使用无菌手术刀将固体培养基上生长旺盛、疏松易碎的愈伤组织切成小块（大小范围为 0.5−2 mm）。
2. 称取约 3 g 愈伤组织小块，放入含有 20 mL 添加了 2,4-D（1.0 mg L^-1）和 KT（0.1 mg L^-1）的 B5 液体培养基的 150 mL 三角瓶中。
3. 将液体细胞悬浮液置于摇床培养箱中，在恒定温度（25 ± 1 °C）、120 rpm 条件下避光振荡培养。
4. 培养 7 至 10 天后，取出培养瓶，静置数分钟。
5. 将全部上清液作为接种材料转接到新鲜培养基中进行继代培养（悬浮母液与新鲜培养基的传代比例为 1:1 至 1:2），去除沉淀的大块愈伤组织。
6. 经过每轮 28 天、共 3−4 轮继代培养后，获得最终生长良好的细胞悬浮培养物。

3. 细胞活力的氯化三苯基四氮唑检测法

1. 在进行活力染色前，将一部分活细胞样品在100 °C下加热10分钟，以杀死细胞作为对照。
2. 将所有细胞悬浮液在6000 × g 条件下离心8分钟。弃去上清液，加入2.5 mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.3）重悬细胞，并手动振荡1分钟。
3. 加入2.5 mL 0.4%氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液，再次手动振荡混匀。
4. 将混合液置于静置培养箱中（30 °C）孵育1小时。

4. 杀虫剂处理及茶树细胞悬浮培养物的取样

1. 分别向细胞悬浮培养物中加入400 µL过滤除菌的母液（浓度为500 µg mL^-1）的四种新烟碱类杀虫剂（噻虫嗪、啶虫脒、吡虫啉和噻虫啉）或两种有机磷杀虫剂（乐果和氧乐果）。
   注意：若目的是比较不同外源物质的行为，应使用同一批次的细胞悬浮培养物来测试不同化合物。
2. 将添加杀虫剂的细胞悬浮培养物样品置于恒温（25 ± 1 °C）摇床中，以120 rpm的转速培养。在第0、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70和75天取样（见步骤4.3或4.4）。
3. 检测含有新烟碱类杀虫剂的样品时，取1 mL均匀的细胞培养液，转移至1.5 mL塑料离心管中，在4000 × g 条件下离心2分钟。
   1. 将上清液通过0.22 µm孔径的滤膜过滤，随后采用高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）和超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF）进行分析（材料表）。
4. 检测含有有机磷杀虫剂的样品时，取500 µL细胞培养液，转移至35 mL离心管或1.5 mL塑料离心管中（后者处理方式与新烟碱类杀虫剂样品相同）。
   1. 向35 mL离心管中的500 µL样品中加入0.1 g氯化钠和5 mL丙酮/乙酸乙酯（3:7, v/v）。
   2. 涡旋混合1分钟，静置10分钟。
   3. 取2.5 mL上清液转移至10 mL玻璃试管中，在40 °C条件下用氮吹仪浓缩至近干。
   4. 用1 mL丙酮溶解残留物，涡旋1分钟，经0.22 µm滤膜过滤后，采用气相色谱-火焰光度检测器（GC-FPD）进行分析。

5. 带杀虫剂的完整茶树样品制备

注意：完整的茶树植株试验是在水培系统中进行的，使用茶苗在50 mL营养液（30 NH₄+, 10 NO₃-, 3.1 PO₄-, 40 K⁺, 20 Ca²⁺, 25 Mg²⁺, 0.35 Fe²⁺, 0.1 B³⁺, 1.0 Mn²⁺, 0.1 Zn²⁺, 0.025 Cu²⁺, 0.05 Mo⁺, 和 10 Al³⁺，单位为 mg L^-1）中培养¹⁸。实验温室位于安徽农业大学，设置光照-黑暗循环（12小时光照和12小时黑暗），温度为20 °C。

1. 将五株植物放入4 L的塑料盆中培养15天。
2. 分别向塑料盆中加入0 ppm（对照）或100 ppm的噻虫嗪或敌敌畏。
3. 按照先前的方法制备完整植株样品，但无需预浸泡¹⁹，然后进行质谱分析以获得精确的质谱图。

6. 仪器分析

1. 新烟碱类杀虫剂代谢行为的高效液相色谱分析
   1. 使用高效液相色谱-紫外检测器（材料表）检测第 4.3 节样品中噻虫嗪和啶虫脒在 254 nm 波长下的含量及代谢产物，以及吡虫啉和噻虫啉在 270 nm 波长下的含量及代谢产物。
      注：高效液相色谱-紫外检测条件与先前研究¹⁹相同。
2. 有机磷类杀虫剂代谢行为的气相色谱分析
   1. 使用配备手性色谱柱的气相色谱-火焰光度检测器（材料表），检测第 4.4 节样品中敌敌畏和甲基对氧磷的含量。
   2. 以氮气作为载气，流速设定为 1.0 mL min^-1。
   3. 初始温度设为 120 °C，保持 5 分钟；以 30 °C min^-1 的速率升温至 150 °C，保持 3 分钟；再以 10 °C min^-1 的速率升温至 170 °C，保持 7 分钟；最后以 30 °C min^-1 的速率升温至 210 °C，保持 5 分钟。
   4. 进样口温度设为 200 °C，采用不分流模式；检测器温度设为 250 °C。
   5. 进样体积设为 1 µL。
3. 细胞培养中杀虫剂代谢物的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱分析
   1. 使用配备 C18 色谱柱的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪（材料表），检测细胞培养样品（第 4.3 节样品）中的杀虫剂代谢物。
   2. 流速设为 0.2 mL min^-1，进样体积设为 10 µL。
   3. 对于新烟碱类杀虫剂处理的样品，初始流动相为 85% A（5 mM 甲酸铵水溶液）和 15% B（乙腈）；在 10 分钟内将流动相 B 升至 38%，然后在 1 分钟内恢复至 15%，保持 9 分钟。
   4. 对于有机磷类杀虫剂处理的样品，初始流动相为 55% A（0.1% 甲酸水溶液）和 45% B（乙腈）；在 5 分钟内将流动相 B 升至 70%，然后在 0.5 分钟内恢复至 45%，保持 2.5 分钟。
   5. 设定四极杆飞行时间质谱仪的操作参数如下：气化温度 325 °C；干燥气（氮气）流速 10 L min^-1；鞘气温度 350 °C；鞘气流速 11 L min^-1；毛细管电压 4000 V；喷嘴电压 1000 V；碎裂电压：新烟碱类杀虫剂为 100 V，有机磷类杀虫剂为 110 V；锥孔电压 65 V；正离子模式下运行。
   6. 将仪器设为全扫描模式和目标 MS/MS 模式。
   7. 使用精确质量分析工具处理数据；结合 MS/MS 注释及文献^{12,15,20,21,22} 推断无标准品的代谢物结构。
4. 完整植物提取物中杀虫剂代谢物的超高效液相色谱-轨道阱质谱分析
   1. 使用超高效液相色谱-轨道阱质谱法（材料表）检测完整植物提取物中的杀虫剂代谢物。
   2. 设定质谱仪（材料表）操作参数如下：鞘气压力 35 arb；气化温度 300 °C；喷嘴电压 3.5 KV；毛细管温度 350 °C。
   3. 洗脱程序参照上述步骤（6.3.3 和 6.3.4）中用于细胞培养样品的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱分析条件。

结果

通过在MS培养基上培养28天后测定污染率、褐化率及愈伤组织诱导率，比较了从大田种植的茶树上采集的叶片与在无菌环境中体外培养的茶苗叶片诱导愈伤组织的情况（图1A）。在培养第20、37、62和90天时记录愈伤组织的生长情况（图1B）。在整个90天的培养期间，来源于体外培养叶片的愈伤组织生长比来源于大田种植叶片的愈伤组织更为旺盛。无菌叶片产生的愈伤组织呈鲜黄色，而大田来源叶片的愈伤组织则呈褐色（图1B）。

在浓度为 1.0 mg L^-1 2,4-D²³，对KT的浓度进行了优化。在0.05 mg L^-1 KT中，愈伤组织生长速率较慢，质地略为紧密，颜色呈白色（

讨论

本文介绍了建立茶树组织中农药代谢模型的详细过程，包括外植体的选择、细胞活力的测定，以及具有高代谢活性的茶树细胞悬浮培养体系的建立。在无菌环境中，植物组织的任何部分均可用于诱导愈伤组织²⁵。本研究选用茶叶作为愈伤组织诱导材料，不仅因为叶片相较于地下部分更不易受污染，还因为叶片是该作物的可食用部分，也是农药施用的主要靶标部位。

本研究比较了从田间植株采集的叶片与从体外培养的无菌苗上切取的叶片诱导愈伤组织的诱导率及生长状况。与田间生长的叶片相比，无菌叶片的褐化率和污染率显著较低，且诱导率更高。这可能是因为田间植株的叶片不仅需要使用乙醇和汞进行表面消毒，还经历了生长环境的改变，而无菌苗叶片在无菌环境中培养，可直接使用，无需额外消毒处理。此外，在90天的培养期间，来源于体外培养无菌苗的愈伤组织表现出比田间叶片更强的生长活力。无菌苗叶片更适用于茶树愈伤组织的诱导，不仅因其具有较高的愈伤组织诱导率和较低的污染率，还因其预处理时间更短，且不受季节因素影响。

为了培养疏松易碎的愈伤组织，必须优化关...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
啶虫脒（99.8%）	Dr. Ehrenstorfer	46717	CAS 号：135410-20-7
乙腈（CAN，99.9%）	Tedia	AS1122-801	CAS 号：75-05-8
琼脂	Solarbio Science & Technology	A8190	CAS 号：9002-18-0
噻虫胺（99.8%）	Dr. Ehrenstorfer	525	CAS 号：210880-92-5
敌百虫（98.5%）	Dr. Ehrenstorfer	109217	CAS 号：60-51-5
吡虫啉（99.8%）	Dr. Ehrenstorfer	91029	CAS 号：138261-41-3
噻虫啉（99.5%）	Toronto Research Chemical	I275000	CAS 号：105843-36-5
激动素（KT，>98.0%）	Solarbio Science & Technology	K8010	CAS 号：525-79-1
氧乐果（98.5%）	Dr. Ehrenstorfer	105491	CAS 号：1113-02-6
聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）	Solarbio Science & Technology	P8070	CAS 号：25249-54-1
蔗糖	Tocris Bioscience	5511	CAS 号：57-50-1
噻虫嗪（99.8%）	Dr. Ehrenstorfer	20625	CAS 号：153719-23-4
氯化三苯基四氮唑（TTC，98.0%）	Solarbio Science & Technology	T8170	CAS 号：298-96-4
2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D，>98.0%）	广州赛国生物科技	D8100	CAS 号：94-75-7
手性色谱柱	Agilent CYCLOSIL-B	112-6632	色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）
气相色谱法（GC）	Shimadzu	2010-Plus	配备火焰光度检测器（FPD）
高效液相色谱法（HPLC）	Agilent	1260	配备紫外检测器（UV）
HSS T3 C18 色谱柱	Waters	186003539	色谱柱（100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm）
超高效液相色谱法（UPLC）	Agilent	1290-6545	串联四极杆飞行时间质谱仪（QTOF）
超高效液相色谱法（UPLC）	Thermo Scientific	Ultimate 3000-Q Exactive Focus	连接轨道阱质谱仪