实时流式细胞术具有单细胞灵敏度，特别适用于定量活体培养物中多模态受体的功能。利用成年神经前体细胞，通过钙离子指示染料检测钙离子内流、溴化乙锭摄取检测跨膜孔道形成，以及使用荧光乳胶微球检测吞噬作用，对P2X7受体功能进行了评估。
方法文章
实时活细胞流式细胞术研究成年神经前体细胞中P2X7受体介导的钙离子内流、孔道形成及吞噬作用
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
活细胞流式细胞术正被越来越多的细胞生物学家用于定量分析活细胞培养中的生物学过程。本实验方案描述了一种扩展的活细胞流式细胞术方法，可用于实时分析P2X7受体激活的多种功能。通过在流式细胞仪上安装时间模块，可对活细胞功能进行评估，并在设定的时间段内绘制出钙离子内流、跨膜孔道形成以及吞噬作用的动力学变化。该方法的优势在于，仅需使用一台仪器即可同时检测P2X7受体的三种经典功能，且所获得的时间序列数据反映的是整个活细胞群体的动态变化，而非像技术难度较高的膜片钳方法那样仅获得单个细胞的记录。钙离子内流实验采用钙离子荧光指示剂染料，而P2X7受体孔道形成检测则依赖于溴化乙锭在高浓度激动剂作用下通过形成的跨膜孔道进入细胞。黄色-绿色（YG）乳胶微球用于吞噬作用的测定。通过施加特异性激动剂和拮抗剂，可进一步探究P2X7受体活性的影响。这些方法可单独调整，用于定量研究多种钙离子通道以及嘌呤能受体和清道夫受体的功能。综合而言，这些方法突显了实时活细胞流式细胞术作为一种快速、经济、可重复且可定量的研究P2X7受体功能的强大手段。
引言
嘌呤能信号传导的研究领域广泛且具有多面性，涉及细胞生理学、生物化学和药理学。嘌呤能信号参与了无限多样的细胞与分子过程，从癌症和细胞周期调控到细胞间通讯以及干细胞生物学；因此，调控嘌呤能信号通路以获得治疗益处具有巨大潜力。在众多嘌呤能受体中，P2X7受体近年来受到广泛关注，因其在多种炎症性疾病中具有作为治疗靶点的潜力1。为促进相关研究，针对该受体的研究方法多年来不断演进并得到优化2,3,4,5。本文中，我们描述了一种活细胞流式细胞术方法，用于研究源自侧脑室下区（SVZ）和海马齿状回的成年神经前体细胞中P2X7受体的多种功能。
P2X7受体最初被称为P2Z受体，或“细胞死亡”受体，因为当其被高浓度三磷酸腺苷（ATP）激活时，会形成一种跨膜大孔道，允许分子量高达900 Da的分子通过6。这会导致细胞骨架重排、跨膜孔道形成，并可能引发细胞凋亡和/或坏死7。传统上，P2X7的这一功能通过检测大分子量染料（如YO-PRO-1或溴化乙锭）的摄取来量化，这些染料在插入DNA后会产生荧光3,8。基于酶标仪的方法虽然快速且易于扩大规模，但通常无法观察动力学过程。本文所述方法基于溴化乙锭摄取，可随时间监测荧光强度的增加，从而更深入地了解孔道形成的速率。此后研究发现，P2X7受体还参与多种非免疫功能，其反应特征取决于激动剂作用时间和浓度9,10。较低浓度ATP的短暂激活可引起阳离子内流，介导神经递质释放和信号转导11。利用流式细胞术检测钙离子内流，可克服传统方法（特别是膜片钳技术）操作繁琐且技术难度高的问题；膜片钳虽能精确测量内向电流，提供细胞膜电位变化的重要信息，但无法进行群体分析2。P2X7受体的第三种功能发生在无ATP存在的情况下，已有研究表明，P2X7受体可在免疫系统和神经系统中促进吞噬作用9,12,13。显微成像技术的进步使得在吞噬过程中观察细胞骨架重排成为可能，但定量分析和群体分析仍具挑战性。
本文详细介绍的活细胞流式细胞术方法可实时研究P2X7受体的全部三种主要功能。在流式细胞仪上加装时间模块装置，可实现对悬浮细胞的温度控制和持续搅拌。激动剂和拮抗剂刺激可在一秒内施加，从而近乎连续地测量细胞反应。该方法快速简便，可重复地定量功能，同时避免使用多种检测系统。需要注意的是，本方案可轻松适用于任何细胞类型，并可根据所用特异性激动剂或抑制剂的性质，用于研究其他受体亚型。
方案
动物的处理遵循《澳大利亚科学研究用途动物护理与使用规范》，并经格里菲斯大学动物伦理委员会批准使用。
1. 成年小鼠侧脑室下区和海马神经前体细胞的神经球培养
注意：此处介绍的解剖方案基于 Walker 和 Kempermann 的研究工作，有关从成年小鼠分离神经前体细胞的详细方案可参见其他文献14。培养条件参考了 Babu 及其同事的方法并进行了修改15。实验使用 8–12 周龄的成年雌性 C57BL/6 小鼠。
- 在生物安全柜中，准备培养基（神经基础培养基），添加神经干细胞增殖添加剂、2 mM 谷氨酰胺、20 ng/mL 表皮生长因子（EGF）、10 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）以及 2 µg/mL 肝素。
- 通过吸入 CO2 处死两只小鼠。或者，根据机构指南对小鼠进行麻醉，并立即通过颈椎脱位法处死。用 70% 乙醇喷洒其头部并去头。将每只头部转移至含有含 1× 青霉素/链霉素溶液（P/S）的 Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）的无菌管中。
- 在层流罩内的解剖显微镜下进行解剖操作。
- 使用镊子和解剖剪去除组织和骨骼以暴露大脑，并将其转移至含有 HBSS 与 P/S 的无菌培养皿中。
- 将大脑腹面朝上放置，使用手术刀片在视交叉处进行一次完整的冠状切口。用镊子固定大脑，快速、干净地向下切割一次。避免来回锯动，以减少细胞死亡并有助于维持组织结构。
注意：若大脑未牢固固定，切割时可能向前倾斜，从而影响从侧脑室下区（SVZ）获取的前体细胞数量。 - 从大脑前半部分分离 SVZ。
- 找到由隔膜分隔的两个脑室，胼胝体在其上方形成白色桥状结构。
- 用镊子去除分隔两个脑室的隔膜，并分离前外侧脑室的侧壁。使用精细解剖剪在上方、下方、两侧及前方进行切割，最终仅保留一个小杯状结构。
- 准备一个洁净的培养皿盖，在中央滴加数滴 HBSS，将 SVZ 组织转移至液体中。避免组织干燥或接触干燥表面。在解剖海马体时，应侧身操作。
- 从大脑后半部分分离海马体。
- 在半球之间沿中线切开以切断胼胝体。以侧脑室为指引，轻柔展开皮层以暴露海马体。当皮层完全展开后，海马体呈现为致密、白色、弯曲的结构。
- 使用精细解剖剪或镊子将海马体从周围组织中分离。
- 用镊子去除覆盖海马体的多余白质、血管及任何膜状组织。
- 准备一个洁净的培养皿盖，加入数滴 HBSS，将海马体转移至液体中。对另一侧半球重复此步骤。
- 当两只小鼠的海马体和 SVZ 均已分离并转移至各自的培养皿盖后，使用手术刀片进行机械切碎。在一个培养皿盖中切碎组织约 1 分钟，每 10 秒旋转一次，直至组织表面光滑且仅剩细小碎片。更换洁净的手术刀片，对另一个培养皿中的组织重复切碎 1 分钟。
- 使用 1 mL 移液器，将每个培养皿盖中的全部组织转移至分别含有 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）的离心管中。SVZ 和海马体各使用一个独立的离心管。
- 首先将约一半体积的胰蛋白酶-EDTA 液体移入培养皿中的组织，以减少气泡产生，并防止组织在转移过程中接触干燥的移液器尖端。用剩余的胰蛋白酶-EDTA 冲洗培养皿和手术刀片，尽可能收集所有组织并加入离心管中。
- 将组织与胰蛋白酶在 37 °C 水浴中孵育 30 分钟，每隔 10 分钟轻轻震荡离心管，以充分解离组织。
- 使用火焰抛光的玻璃巴斯德移液管吹打组织，制成单细胞悬液。注意避免过度吹打，以免造成大量细胞裂解。这是实现最佳组织解离的关键步骤。
- 在吹打过程中观察管内物质，一旦发现大部分组织团块已消失即停止操作。当细胞形成单细胞悬液时，胰蛋白酶溶液会略微变浑浊，尽管可能仍有少量团块存在。
注意：通常上下吹打 10–15 次即可达到理想效果。 - 加入培养基至 5 mL 以中和胰蛋白酶，然后在 300 × g 条件下离心 3 分钟。再用 HBSS 洗涤 2 次，并将细胞悬液通过 70 µm 细胞滤网，以去除残留的组织团块。
- 将所有细胞转移至含 15 mL 培养基的 T75 细胞培养瓶中。
注意：SVZ 的第零代（P0）培养通常在 7–10 天后形成细胞球，而海马体培养则需 15–20 天。在此期间避免换液或喂养，以最大化培养中神经前体细胞的数量。若需获得更多前体细胞或缩短 P0 培养时间，可增加牺牲小鼠的数量。 - 将培养物维持在 37 °C、5% CO2 条件下，完成初始 P0 培养阶段后，根据需要每 7–10 天传代一次，操作时使用生物安全柜并遵循标准组织培养规范。
注意：P0 海马体培养应能产生足够数量的细胞球以传代至 T25 培养瓶；SVZ 培养产生的细胞球更多，可传代至 T75 培养瓶。若 P0 海马体细胞球已贴壁，可用 200 µL 移液器轻轻抬起细胞球。 - 当细胞球直径达到 150 至 200 µm 时进行传代。收集细胞球及培养基至 15 mL 离心管中，静置约 5 分钟使细胞球自然沉降。也可选择以低速（100 × g）离心 2 分钟。
- 吸除上清液，根据细胞球大小加入解离试剂孵育 7–10 分钟以解离细胞。
注意：所用解离试剂对培养结果有显著影响，请参见材料表中的具体说明。 - 加入 5 mL HBSS 洗涤细胞，300 × g 离心 3 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于培养基中，以约 150,000 个细胞接种于含 5 mL 培养基的 T25 细胞培养瓶或等效容器中。将培养物维持在 37 °C 和 5% CO2 条件下。
- 在进行任何下游实验前，通过检测 Sox2 和 ASCL1 等干细胞标志物的表达来确认神经前体细胞状态9。
注意：可通过研究者偏好的方法完成鉴定（例如显微镜下免疫化学染色、流式细胞术或 Western blot，或定量聚合酶链式反应（qPCR））。
2. 流式细胞术分析用单细胞悬液的制备
- 准备所需的培养基。包括以下内容。
- 制备含145 mM NaCl、5 mM KOH、10 mM HEPES、5 mM D-葡萄糖、0.1% 牛血清白蛋白（BSA）和0.1 mM CaCl2的Na+培养基。该培养基也可配制成无钙形式，即省略0.1 mM CaCl2。
- 制备含145 mM KCl、5 mM KOH、10 mM HEPES、5 mM D-葡萄糖和0.1% BSA的K+培养基。
注意：这些培养基经过广泛优化，详见先前发表的文献4,5。 - 通过称取足够配制约20 mL 100 mM储备液的ATP粉末来制备ATP储备液。将粉末溶解于17 mL KCl缓冲液（145 mM KCl、5 mM KOH和10 mM HEPES，pH 7.5）中，并在搅拌下缓慢加入2 mL 18%（w/v）四甲基氢氧化铵（TMA），使溶液pH值达到6.8–7.0。
- 将最终体积调至20 mL。注意pH值不得超过7.0。将储备液储存于-80 °C；需注意ATP分装样品在-80 °C下至少可稳定保存6个月。
注意：无水ATP的游离分子量为551.14 g/mol，此数值不包括水分子和二钠分子的分子量，而后者可能因批次不同而有所变化，在计算时应予以考虑。TMA具有毒性，操作时需格外小心。请阅读安全数据表，并在通风橱中配制储备液。 - 通过将BzATP溶解于超纯H2O中，配制终浓度为10 mM的BzATP储备液。
- 按照步骤1.16和1.17所述方法制备单细胞悬液。使用血细胞计数板或自动细胞计数器对细胞进行计数。将细胞重悬于实验所需培养基中（例如Na+培养基、培养基等，具体如下所述），并在实验前将细胞置于冰上保存。
- 每次实验应确保有足够的样本量，以包含前向散射和侧向散射的对照，以及电压和补偿设置校准所需的对照。作为参考，通常在T75培养瓶中培养的细胞每瓶可收获约8 × 106个细胞。
- 使用对照样本设定流式细胞仪参数。
- 利用前向散射和侧向散射选择性地圈选活细胞。
注意：前向散射基于光的衍射反映细胞大小，而侧向散射反映细胞内部复杂性或颗粒度。前向散射和侧向散射信号均较小的流式事件可视为死细胞。 - 根据仪器制造商的说明调整流式细胞仪的电压和增益。运行测试样本以确保在最大荧光强度范围内采集数据。单通道检测无需进行补偿调节。
- 利用前向散射和侧向散射选择性地圈选活细胞。
3. 通过活细胞流式细胞术测量钙离子内流
- 制备单细胞悬液后，将细胞重悬于 1 mL 无钙 Na+ 培养基中，并按照制造商说明书（参见材料表）加入 10 µL 5% 普流罗尼克酸（pluronic acid），负载 2 ng/mL 钙离子指示剂染料。在 37 °C 下孵育 30 分钟。
- 加入 3–5 mL 无钙 Na+ 培养基洗涤细胞，轻柔离心（200 × g，4 分钟）。弃去上清液，将细胞重悬于无钙 Na+ 培养基中，再洗涤一次。
- 将细胞重悬于 1 mL 无钙 Na+ 培养基中，置于冰上，静置 30 分钟以完成去酯化。
- 再用 3–5 mL K+ 培养基洗涤一次，离心（200 × g，4 分钟）；随后将细胞重悬于 K+ 培养基中，并按每管 500 µL 含 1 × 106 个细胞的浓度分装至荧光辅助细胞分选（FACS）管中。
注意：每份样本所需的 FACS 管数量取决于所包含的处理组数和重复次数。 - 将 FACS 管置于冰上，待细胞准备分析时使用。切勿将细胞长时间置于冰上，应尽快开始检测。
- 对于某些样本，在分析前于 37 °C 下用 P2X7 受体特异性抑制剂 AZ10606120（1 µM，孵育 10–15 分钟）或 A438079（10 µM，孵育 30 分钟）预孵育细胞。
- 在运行第一个样本前几分钟，向 FACS 管中加入 CaCl2（终浓度为 1 mM），并将管子放入 37 °C 水浴中恢复温度。
- 将一个洁净的小型磁力搅拌子放入 FACS 管中，并将管子置于连接循环 37 °C 水浴的时间模块内，以控制样品温度。选择较低的搅拌速度，确保样品均匀移动但不产生涡流。将水套管适配器安装到样品平台上，并合上 FACS 仪器的杠杆臂。
- 启动样品采集，以每秒约 1,000 个事件的速度运行 3 分钟。
- 在第 40 秒时，迅速取出管子，加入 P2X7 激动剂（1 mM ATP 或 300 µM BzATP），然后将管子放回继续采集。
- 在第一个样本记录的同时，准备第二个样本，加入 CaCl2 并置于 37 °C 环境中，确保细胞在分析前有足够时间升温。第一个样本完成后，通过运行水样清洗进样口，然后按照步骤 3.8 和 3.9 开始第二个样本的采集。每次更换样本之间必须清洗进样口。
4. 通过活细胞流式细胞术测量孔形成
- 按照步骤 1.16 和 1.17 所述制备单细胞悬液。保留数毫升旧培养基，用于将细胞重悬至每 100 µL FACS 管含 1 × 106 个细胞的浓度，并置于冰上备用。
- 在开始检测前，向管中加入 900 µL K+ 培养基，使终体积达到 1 mL，将各管放入 37 °C 水浴中孵育 10 分钟，使细胞恢复。
- 如适用，可在检测前用处理剂预孵育细胞，包括 P2X7 特异性抑制剂 AZ10606120（1 µM，孵育 10–15 分钟）或 A438079（10 µM，孵育 30 分钟）。
- 在开始检测前立即向 FACS 管中加入 25 µM 溴化乙锭；然后加入磁力搅拌子，按照步骤 3.7 将管子放入 FACS 仪器中，并开始采集数据。
注意：溴化乙锭具有毒性，操作时需格外小心。使用过的 FACS 管应妥善处理。 - 为诱导细胞膜形成孔道，在采集开始后 40 秒加入 1 mM ATP 或 100 µM BzATP。
- 以每秒约 1,000 个事件的速度运行样品，持续 6 分钟。
- 当第一个样品运行时，将第二个样品从冰上取出并放入 37 °C 水浴中，以确保细胞在分析前有足够时间恢复。第一个样品采集完成后，通过运行水样清洗进样口；随后可将第二个样品放入仪器中，按照步骤 3.8 和 3.9 开始记录。
5. 通过活细胞流式细胞术测量吞噬作用
- 按照步骤 1.16 和 1.17 所述制备单细胞悬液。将细胞重悬于条件培养基中，并以每管至少 1 × 106 个细胞/100 µL 的浓度分装至流式管中。用 Na+ 培养基将细胞稀释至终浓度为 1 × 106 个细胞/mL（例如，加入 900 µL Na+ 培养基），并将细胞置于冰上直至进行分析。
- 使用 1 µm 的 YG 聚苯乙烯微球（微粒）作为实时吞噬实验的吞噬靶标。
注意： 可使用其他颜色的微球替代，但不同尺寸的微球被发现不适合作为吞噬作用的有效靶标4。 - 在运行第一个样品前，将细胞转移至 37 °C 水浴中，孵育约 7–10 分钟，使细胞充分恢复。
- 向各相应试管中加入需要预孵育的处理剂，包括 1 mM ATP 孵育 15 分钟、300 µM 氧化型 ATP（oxATP）孵育 40 分钟、20 µM 细胞松弛素 D 孵育 20 分钟，以及 4% 多聚甲醛（PFA）孵育 20 分钟。
- 5% 人血清无需预孵育。若多种处理剂大致同时加入，可在其他样品继续孵育时按相反顺序运行样品。例如，先运行对照组和血清组，然后是 ATP 处理组，接着是细胞松弛素 D 和 PFA 处理组，最后是 oxATP 处理组。
- 按照步骤 3.8 和 3.9 所述，将样品置于带有磁力搅拌器的流式细胞仪上，然后启动样品采集。
- 在采集开始后 15–20 秒，将样品管从仪器中取出，加入 5 µL 未稀释的 YG 微球，再将样品流式管放回仪器并继续采集。以约 1,000 个事件/秒的速度运行样品 7–8 分钟。
- 当第一个样品运行时，将第二个样品从冰上取出并放入 37 °C 水浴中，使其有足够时间在分析前恢复。第一个样品运行结束后，通过运行水样清洗进样口，然后按照步骤 3.8 和 3.9 开始第二个样品的采集。
6. 数据分析
- 将数据导出至电子表格。数据分析将取决于具体的实验问题。
注意：请注意，不同运行之间的基线强度可能不同，因此在加入任何激动剂之前，必须在实验开始时设定一段固定时间（约 40 秒）进行检测，并通过计算荧光变化量对数据进行归一化处理（即任意时间点的荧光值 [F] 除以零时刻的荧光值 [F0]，表示为 F/F0）。 - 为量化所研究的 P2X7 功能的速率或动力学特征，可计算曲线下面积，或计算曲线下每 10 秒时间段内梯形区域的总和16。
- 为确定处理因素的影响，取记录末段最后 10–20 秒内的荧光强度平均值并进行组间比较。采用 t 检验或方差分析确定统计学显著性。
结果
神经前体细胞培养
采用该方法获得的神经前体细胞球状培养物应呈相位明亮，边缘光滑且呈圆形（图1A、B）。在健康培养物中，边缘可见少量微突起（图1C）。在高代次培养或营养供给不足时，细胞球可能形成中空杯状结构（图1D）或大而长椭圆形结构（图1E，箭头所示）。此类培养物不应用于流式细胞术或其他下游实验，因为这些形态特征可能提示细胞已发生分化。为确认神经前体细胞特性，将细胞接种于经多聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白包被的玻璃盖玻片上，进行免疫细胞化学染色（图1F，较高密度时见图1G）。通过GFAP、nestin、Sox2、vimentin、ASCL1、BLBP、Prox1和DCX染色，可鉴定细胞为2型前体细胞（海马）或C型前体细胞（SVZ）9。细胞应具有清晰的细胞核和延伸的突起。
图 1：典型的海马神经前体细胞培养图示。（A）海马神经前体细胞从成年小鼠中分离，并以神经球形式进行培养，直至直径达到约 100 至 150 µm。（B）神经球应具有光滑的边缘，（C）其表面可能观察到微小的微突起。当培养时间过长时，神经球可能形成（D）杯状或（E）长椭圆形结构。此类培养物不应用于实验。为确认细胞的神经前体细胞特性，可将细胞以单细胞悬液形式接种于多聚-L-鸟氨酸（PLO）和层粘连蛋白包被的玻璃盖玻片上，用于免疫化学染色。细胞应具有较小的胞体和分支状突起，（F）在低密度下生长，（G）并适用于免疫化学染色。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
通过活细胞流式细胞术检测钙离子内流
本方案可用于实时分析P2X7受体作为钙通道的功能。还可评估受体功能的动力学特征以及不同激动剂和拮抗剂的作用效果。当随时间绘制曲线时，海马体和室管膜下区（SVZ）神经前体细胞中的钙内流总体相似（图2A 和 图2B，分别）。在40秒时间点（以红色箭头指示）加入激动剂（ATP或BzATP）。短暂地将样品管从记录位置移开以添加激动剂，会导致出现零值的数据点，这有助于识别激动剂添加的时间。BzATP可快速激活P2X7受体，打开离子通道，引起钙离子内流，钙离子与Fluo-8结合后产生荧光。ATP的施加通常引起更为缓慢的钙内流，其与P2X7受体的亲和力低于BzATP，同时还会激活G蛋白偶联受体——这一较慢的信号通路可促使内质网释放钙离子。加入P2X7拮抗剂A438079和AZ10606120后（数据未显示），激动剂诱导的钙内流减少。
图2：海马体和侧脑室下区（SVZ）来源的神经前体细胞中活细胞钙离子内流。 通过Fluo-8荧光变化，在（A）海马体和（B）SVZ来源的前体细胞中验证了P2X7受体钙通道的功能。施加广谱P2X激动剂ATP以及P2X7特异性激动剂BzATP可导致P2X7离子通道开放，从而引起钙离子内流。该内流可被P2X7特异性抑制剂A438079或AZ10606120所阻断（数据未显示）。F = 荧光强度；F0 = 零时间点的荧光强度。请点击此处查看此图的放大版本。
通过活细胞流式细胞术检测孔形成
跨膜孔道的形成为P2X7受体的典型特征，可导致大分子交换，并可能引起细胞死亡。溴化乙锭+是一种大分子物质（314 Da），无法进入健康细胞；其进入细胞后可插入DNA并产生荧光信号，因此可用于评估P2X7受体形成跨膜孔道的能力。在40 s时（箭头所示）加入激动剂ATP（1 mM ATP）和BzATP（100 μM）后，时间分辨流式细胞术可实时检测溴化乙锭进入细胞的过程（图3A）。该效应可被P2X7特异性抑制剂AZ10606120所减弱。溴化乙锭摄取实验表明P2X7受体C末端具有功能活性17，是全长P2X7受体表达的有力证据。ATP浓度-反应实验通过检测随时间变化的溴化乙锭荧光强度变化，展示了激动剂浓度对P2X7孔道形成的影响（图3B）。激动剂剂量-反应曲线结合受体特异性抑制剂实验，为受体激活提供了有力证据。
图3：通过溴化乙锭摄取检测P2X7跨膜孔道的形成。 在开始采集前即刻加入溴化乙锭，用于检测P2X7跨膜孔道的形成。高浓度的ATP和BzATP可诱导（A）P2X7受体孔道的形成，使溴化乙锭进入细胞。P2X7抑制剂AZ10606120可减弱该现象，从而证明功能性P2X7受体的存在。（B）ATP浓度-反应实验显示，在500 μM和1 mM浓度下可显著形成孔道，而在较低浓度下则无此效应。请点击此处查看该图的放大版本。
通过活细胞流式细胞术检测吞噬作用
本课题组先前已证明，细胞外ATP通过使P2X7受体C末端与细胞骨架（特别是非肌性肌球蛋白IIA）解离，从而抑制P2X7介导的吞噬作用18,19。本方法进一步拓展了这些发现，实时展示了P2X7受体在海马区和侧脑室下区（SVZ）神经前体细胞吞噬过程中的作用（图4，为海马区吞噬作用的一个示例）。以1 µm黄色-绿色（YG）乳胶微球的未抑制吞噬水平作为阳性对照。ATP对YG微球吞噬的抑制程度与非特异性抑制剂（即PFA固定和肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素D）相当，而5%血清则完全消除了固有吞噬活性20。
图 4：通过 P2X7 受体展示神经前体细胞对 YG 微球的吞噬能力。可通过活细胞流式细胞术实时观察神经前体细胞对 YG 微球的摄取。实验首先建立吞噬作用的基础水平，并在实验结束时（若细胞数量允许）再次确认该水平。P2X7 受体参与吞噬过程的证据来自 ATP 存在下吞噬作用受到抑制的现象，因为 ATP 会导致 C 末端从膜细胞骨架上解离，从而阻止 P2X7 介导的细胞骨架重排。ATP 对吞噬作用的抑制程度与非特异性吞噬抑制剂（包括多聚甲醛（PFA）和细胞松弛素 D（CytD））的作用相当。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本文介绍了一种详细方案，用于分析源自成年神经发生微环境的神经前体细胞培养物中P2X7受体功能。成年神经前体细胞具有广泛的应用前景，从基础研究到治疗用途均有涉及，因此其培养方法必须稳健且可重复。本方案中有多个关键环节可能影响终末培养物的质量。一旦脑组织从颅骨中取出，应避免其干燥，并应尽快完成解剖操作。特别是对于海马组织，若能格外小心地去除所有血管或膜状组织，将获得更高质量的前体细胞产量。组织解离和吹打过程会显著影响培养中获得的细胞球数量；在胰蛋白酶-EDTA孵育期间对组织进行震荡，可得到更均匀的悬液。强烈建议使用火焰抛光的玻璃移液管，而非P1000塑料枪头，以减少细胞死亡并提高培养效果。避免过度吹打。尽管采取了上述预防措施，P0代培养物中仍可能产生大量碎片，为避免前体细胞丢失，在细胞球形成之前应避免洗涤或换液。
在P0代时，海马体培养物与SVZ培养物之间存在若干明显差异。海马体培养物产生的球体较少，且这些球体通常会贴壁。初次传代时，应使用移液器枪头轻轻将球体刮下。在后续传代中未观察到球体贴壁现象。不同品牌的组织培养瓶可能导致球体（尤其是海马体球体）贴壁，并在培养皿底部以集落形式生长。虽然这并未影响本实验方案的后续结果，但仍应予以监测，并尽可能保持操作的一致性。
以往用于检测P2X7受体功能的方法，例如通过膜片钳技术记录钙离子内流，耗时且繁琐，且可能仅提供单个细胞的信息。本方案介绍了一种快速、可重复的方法，利用一台仪器即可分析P2X7受体的全部三种主要功能。时间分辨的活细胞流式细胞术可实现对整个细胞群体的分析，使研究人员能够获取有关钙离子内流、孔道形成和/或吞噬功能动力学的信息。此外，流式细胞术还可便捷地用于评估标志物表达模式以及基于细胞大小或蛋白表达水平的群体分析。
进行这些实验时，重复实验之间可能会观察到最大钙离子内流、溴化乙锭摄取或吞噬速率的差异。为尽量减少此类差异，必须保持球体大小、培养条件和喂养方案的一致性，因为细胞的健康状况将显著影响实验结果。冰上操作时间也可能影响数据，因此应提前做好所有准备，使冰上操作时间尽可能缩短。确保钙离子指示染料的负载时间保持一致。导致最大钙信号记录出现较大不一致性的另一个因素是ATP不同批次之间的差异。ATP储备液的制备至关重要，应避免在同一实验中使用不同批次的ATP。建议对新旧批次进行比较，以确保ATP的一致性。P2X7受体拮抗剂的效果也可能依赖于细胞系和试剂批次，因此可能需要优化孵育时间和浓度。
值得注意的是，钙离子内流/外流是最基本且最复杂的细胞功能之一，可由多种受体介导。ATP诱导的钙离子内流作为P2X7通道/孔道功能的经典检测指标，可能无法准确反映P2X7受体的真实功能，因为ATP还可能激活P2Y受体，从而释放细胞内钙离子。在此情况下，钡离子可能是比钙离子更优的阳离子选择，因其内流具有单向性。16. 为了区分P2Y受体在钙离子内流中的作用，可设置含有1 mM EDTA或乙二醇双(β-氨基乙基醚- N,N,N′，N′四乙酸（EGTA）被添加至K+ 用培养基代替 CaCl₂2 可在本实验中使用。
该方案也可轻松适用于其他细胞类型，可用于研究其他离子通道受体或参与吞噬作用的受体功能。此方法亦可适配无时间模块的流式细胞仪。例如，可在常规流式细胞术分析前7–8分钟加入黄色-绿色（YG）乳胶微球进行吞噬作用检测。保持细胞处于37 °C环境中并持续轻轻摇动。虽然该方法无法提供实时信息，但最终平均荧光强度的差异仍可反映P2X7受体的功能状态。
P2X7 受体作为药物靶点21,22，甚至作为药物递送途径23,24，其研究兴趣正在迅速增长，因此必须持续改进和优化研究这一神秘受体的方法，以促进相关研究的开展。本方案概述了可用于研究成年神经前体细胞中 P2X7 受体功能的方法，希望通过对神经发生微环境中 P2X7 受体的深入理解，推动中风及其他缺血性损伤治疗手段的进步。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢 Maria Kasherman 和 Xin Huang 对本研究的贡献。本工作获得了澳大利亚 Rebecca L. Cooper 医学研究基金会向 M.W.、T.C.L. 和 M.L. 提供的资助，以及澳大利亚国家卫生与医学研究理事会（NHMRC）（项目编号：571100 和 1048082）和 Baxter 慈善基金会（澳大利亚悉尼）向 T.C.L. 提供的资助。B.G. 获得了澳大利亚研究理事会（ARC）未来研究员项目（FT120100581）、NHMRC 项目资助（1048082、1061419 和 1120095）以及维多利亚州政府向弗洛里研究所提供的运营基础设施支持拨款的资助。M.L. 获得了国际视网膜研究基金会（美国）颁发的 Charles D. Kelman 博士后奖（2010 年）的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| A438079 | Tocris | 2972/10 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| AZ10606120 | Tocris | 3323/10 | |
| bzATP | Sigma-Aldrich | B6396 | |
| 细胞松弛素 D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
| FACSCalibur | Becton Dickinson | ||
| Fluo-8AM | AAT-Bioquest | 21080 | Fluo-4AM 和 Fura-Red AM 也已成功使用 |
| Fluoresbrite YG 微球 | Polysciences Inc | 17154-10 | 1.00 µm，黄绿色 |
| 谷氨酰胺 | ThermoFisher Scientific | 25030081 | 200 mM |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170112 | |
| 肝素 | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| NeuroCult 基础培养基 | Stemcell Technologies | 5700 | 小鼠和大鼠 |
| NeuroCult 增殖添加剂 | Stemcell Technologies | 5701 | 小鼠和大鼠 |
| 氧化型 ATP | Sigma-Aldrich | A6779 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | 聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物 |
| 重组小鼠 EGF | Peprotech | 315-09 | |
| 重组小鼠碱性 FGF | Peprotech | 450-33 | |
| 四甲基氢氧化铵 | Sigma-Aldrich | T7505 | |
| Time Zero 模块 | Cytek Biosciences | ||
| 细胞培养瓶 | BD Falcon (Corning) | 353108 (T25), 353136 (T75) | 蓝色透气螺旋盖 |
| TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | 含酚红 |
| UltraPure 溴化乙锭 | ThermoFisher Scientific | 15585011 | 10 mg/mL |
参考文献
- Sperlagh, B., Illes, P. P2X7 receptor: an emerging target in central nervous system diseases. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (10), 537-547 (2014).
- Liang, X., et al. Quantifying Ca2+ current and permeability in ATP-gated P2X7 receptors. Journal of Biological Chemistry. 290 (12), 7930-7942 (2015).
- Rat, P., Olivier, E., Tanter, C., Wakx, A., Dutot, M. A fast and reproducible cell- and 96-well plate-based method for the evaluation of P2X7 receptor activation using YO-PRO-1 fluorescent dye. Journal of Biological Methods. 4 (1), 64(2017).
- Gu, B. J., et al. A quantitative method for measuring innate phagocytosis by human monocytes using real-time flow cytometry. Journal of Quantitative Cell Science: Cytometry Part A. 85 (4), 313-321 (2014).
- Jursik, C., et al. A quantitative method for routine measurement of cell surface P2X7 receptor function in leucocyte subsets by two-colour time-resolved flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 67-77 (2007).
- Surprenant, A., Rassendren, F., Kawashima, E., North, R. A., Buell, G. The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X7). Science. 272 (5262), 735-738 (1996).
- Delarasse, C., et al. Neural progenitor cell death is induced by extracellular ATP via ligation of P2X7 receptor. Journal of Neurochemistry. 109 (3), 846-857 (2009).
- North, R. A. Molecular physiology of P2X receptors. Physiological Reviews. 82 (4), 1013-1067 (2002).
- Leeson, H. C., et al. P2X7 Receptors Regulate Phagocytosis and Proliferation in Adult Hippocampal and SVZ Neural Progenitor Cells: Implications for Inflammation in Neurogenesis. Stem Cells. , (2018).
- Glaser, T., et al. Modulation of mouse embryonic stem cell proliferation and neural differentiation by the P2X7 receptor. PLoS One. 9 (5), e96281(2014).
- Papp, L., Vizi, E. S., Sperlagh, B. Lack of ATP-evoked GABA and glutamate release in the hippocampus of P2X7 receptor-/- mice. Neuroreport. 15 (15), 2387-2391 (2004).
- Wiley, J. S., Gu, B. J. A new role for the P2X7 receptor: a scavenger receptor for bacteria and apoptotic cells in the absence of serum and extracellular ATP. Purinergic Signalling. 8 (3), 579-586 (2012).
- Lovelace, M. D., et al. P2X7 receptors mediate innate phagocytosis by human neural precursor cells and neuroblasts. Stem Cells. 33 (2), 526-541 (2015).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. Journal of Visualized Experiments. (84), e51225(2014).
- Babu, H., et al. A protocol for isolation and enriched monolayer cultivation of neural precursor cells from mouse dentate gyrus. Frontiers in Neuroscience. 5, 89(2011).
- Gu, B. J., Wiley, J. S. Broad applications of mulit-colour time-resolved flow cytometry. Flow Cytometry - Recent Perspectives. , (2012).
- Cheewatrakoolpong, B., Gilchrest, H., Anthes, J. C., Greenfeder, S. Identification and characterization of splice variants of the human P2X7 ATP channel. Biochemical and Biophysical Research Communications. 332 (1), 17-27 (2005).
- Gu, B. J., Saunders, B. M., Jursik, C., Wiley, J. S. The P2X7-nonmuscle myosin membrane complex regulates phagocytosis of nonopsonized particles and bacteria by a pathway attenuated by extracellular ATP. Blood. 115 (8), 1621-1631 (2010).
- Gu, B. J., Rathsam, C., Stokes, L., McGeachie, A. B., Wiley, J. S. Extracellular ATP dissociates nonmuscle myosin from P2X(7) complex: this dissociation regulates P2X(7) pore formation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 297 (2), C430-C439 (2009).
- Gu, B. J., et al. P2X7 receptor-mediated scavenger activity of mononuclear phagocytes toward non-opsonized particles and apoptotic cells is inhibited by serum glycoproteins but remains active in cerebrospinal fluid. Journal of Biological Chemistry. 287 (21), 17318-17330 (2012).
- Bhattacharya, A. Recent Advances in CNS P2X7 Physiology and Pharmacology: Focus on Neuropsychiatric Disorders. Frontiers in Pharmacology. 9 (30), (2018).
- Burnstock, G., Knight, G. E. The potential of P2X7 receptors as a therapeutic target, including inflammation and tumour progression. Purinergic Signalling. 14 (1), 1-18 (2018).
- Alves, L. A., et al. Pore forming channels as a drug delivery system for photodynamic therapy in cancer associated with nanoscintillators. Oncotarget. 9 (38), 25342-25354 (2018).
- Pacheco, P. A., et al. P2X7 receptor as a novel drug delivery system to increase the entrance of hydrophilic drugs into cells during photodynamic therapy. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 48 (4), 397-411 (2016).
重印与许可
