本文介绍了一种用于单粒子追踪图像分析的实验方案，可对荧光显微镜检测到的单个粒子的扩散系数、运动类型和簇大小进行定量评估。
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方法文章
用于荧光显微镜分析膜受体扩散与簇大小的图像处理方案
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
如今，在许多生物学研究中，对视频序列中的颗粒进行追踪并对其轨迹进行后续分析已成为一项常见操作。本文以细胞膜受体簇的分析为模型，详细介绍使用Fiji（ImageJ）和Matlab程序完成该图像分析任务的实验方案：1）定义感兴趣区域，并针对这些区域设计相应的掩膜；2）在荧光显微镜视频中追踪颗粒；3）分析选定轨迹的扩散特性和荧光强度特征。通过对荧光显微镜结合图像处理所获得的扩散系数、运动类型和簇大小等参数进行定量分析，可为客观评估颗粒动力学行为以及环境条件改变所造成的影响提供有力工具。本文提供了针对这些特征分析的详细操作流程。该方法不仅能够实现单分子追踪检测，还可自动化估算细胞膜上的侧向扩散参数，对轨迹类型进行分类，并实现全面分析，从而克服了在细胞膜上对颗粒在整个运动轨迹中大小变化进行定量测量的技术难题。
引言
由于热扩散作用，嵌入脂双层中的膜蛋白处于持续运动状态。膜蛋白的动态特性对于调控细胞反应至关重要，因为分子间相互作用可形成从单体到寡聚体等不同大小的复合物，并影响信号传导复合物的稳定性。因此，阐明调控蛋白质动态行为的机制已成为细胞生物学领域的新挑战，这对于理解信号转导通路以及发现未知的细胞功能具有重要意义。
一些光学方法已被开发用于在活细胞中研究这些相互作用1。其中，全内反射荧光（TIRF）显微镜技术于20世纪80年代初期发展起来，可用于研究细胞膜上或非常接近细胞膜的分子相互作用2。为了研究从活细胞TIRF数据中获得的膜蛋白运动轨迹的动态参数，需要采用单粒子追踪方法（SPT）。尽管已有多种算法可用于此目的，但我们目前使用的是Jaqaman等人3发表的方法，该方法通过在连续帧之间连接粒子，将生成的轨迹片段整合为完整的轨迹（包括粒子暂时消失的情况），从而解决了高密度粒子场中粒子运动异质性的问题。该软件能够捕捉由聚集和解离事件引起的粒子合并与分裂过程3。该软件的输出数据之一是通过定义每个帧中粒子的X和Y位置，来检测整个轨迹上的粒子。
一旦检测到粒子，我们将应用不同的算法来确定短时间滞后扩散系数（D1-4）
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方案
1. 生物样本的制备
- 在添加了10%胎牛血清（FCS）、丙酮酸钠（NaPyr）和L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基（完全RPMI）中培养Jurkat细胞。将Jurkat细胞（20 × 106 个细胞/400 µL含10% FCS的RPMI 1640）与单体GFP标记的趋化因子受体质粒（CXCR4-AcGFP，20 μg）进行电穿孔转染，以便通过荧光显微镜检测其表达情况。
注意：也可使用其他单体荧光蛋白，如mCherry、mScarlet等。 - 转染后24小时，使用流式细胞仪分析细胞，以确定细胞活力和CXCR4-AcGFP的表达水平。
- 通过流式分选GFP低阳性细胞，选择CXCR4-AcGFP低表达的细胞（图1），因为在全内反射荧光显微镜（TIRFM）实验中需要受体的低表达水平，以确保能够对单个颗粒进行追踪并绘制单独的运动轨迹9。
- 定量测定细胞表面受体的数量。
注意：举例而言13，每个细胞约有8,500 - 22,000个AcGFP标记的受体，相当于每平方微米约2 - 4.5个颗粒/μm2。 - 将分选后的....
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结果
本方案可用于对荧光显微镜视频中检测到的颗粒进行自动追踪，并分析其动态特征。首先，将待追踪的荧光标记蛋白转染至细胞中。通过细胞分选获得细胞表面适量的受体表达水平，以满足单颗粒追踪（SPT）的要求（图1）。随后，对筛选出的细胞进行全内反射荧光（TIRF）显微镜分析，获得可用于本方案所述工具分析的视频数据（补充视频1）。
生成的视频无法直接进行分析，需要提取每个视频的独立帧。使用 ImageJ 可生成能够通过 Matlab 软件读取的文件，例如 .tiff 格式的视频帧或掩膜。U-track 对所选视频中观察到的粒子进行追踪，并将信息保存为 Matlab (.mat) 文件movieData.mat, 通道1检测结果.mat，通道1.mat，通道1追踪结果.mat），参见 图2
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讨论
所述方法易于操作，即使没有任何使用Matlab的先前经验也能完成。然而，Matlab程序对各种命令的命名规范以及程序所使用文件夹的路径定位要求极为精确。在追踪分析程序（步骤3）中，可修改多个参数。“设置高斯混合模型拟合”窗口（步骤3.8）控制U-track如何在视频中检测单个粒子，该过程通过拟合高斯混合模型实现，具体方法如文献3所述。该拟合过程中的一个关键参数定义了用于识别局部极大值的滤波器。此操作的成功与否取决于图像对比度以及图像中存在的噪声水平。第一个参数（与局部背景比较的Alpha值）控制将一个极大值判定为真实光斑的置信度，而第二个参数有助于在光斑识别过程中降低噪声。在“追踪”步骤（3.9）中，重要参数包括用于填补间隙的帧数（即一条轨迹可以跨越粒子未实际出现的帧，但该粒子在这些帧之前和之后均可见；在本示例中为0），以及一条轨迹必须跨越的最少帧数才能被视为有效轨迹（在本示例中为20；该参数与相机采集速度相关，且轨迹中的帧数需足够以支持扩散系数的计算）。此外，还需决定是否合并和拆分轨迹片段（在本示例中选择了这两种选项）。随后，必须设置代价函数中步骤1（帧间连接）的参数。该函数控制粒子在各.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Carlo Manzo 和 Maria García Parajo 在扩散系数分析方面提供的帮助及源代码。本工作部分得到了西班牙科学、创新与大学部（SAF 2017-82940-R）以及卡洛斯三世健康研究所 RETICS 计划（RD12/0009/009 和 RD16/0012/0006；RIER）资助项目的支持。LMM 和 JV 得到了西班牙国家研究委员会通用基金会 COMFUTURO 计划的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 人 Jurkat 细胞 | ATCC | CRL-10915 | 人类 T 细胞系。任何其他细胞类型均可使用该软件进行分析 |
| pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP | Clontech | 632469 | 可使用本实验流程追踪和分析不同的荧光蛋白 |
| Gene Pulse X Cell 电穿孔仪 | BioRad | 我们对 Jurkat 细胞使用 280 V、975 mF 的参数。 请采用在您实验条件下最有效的转染方法。 | |
| Cytomics FC 500 流式细胞仪 | Beckman Coulter | ||
| MoFlo Astrios 细胞分选仪 | Beckman Coulter | 根据转染效率的不同，可能无需进行细胞分选。 您也可使用稳定表达适量目标受体的细胞。 | |
| Dako Qifikit | DakoCytomation | K0078 | 用于定量细胞表面受体的数量 |
| 玻璃底微孔培养皿 | MatTek 公司 | P35G-1.5-10-C | |
| 人血浆来源纤连蛋白 | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| 重组人 CXCL12 | PeproTech | 300928A | |
| Leica AM TIRF 倒置显微镜 | Leica | ||
| EM-CCD 相机 | Andor | DU 885-CSO-#10-VP | |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | ||
| U-Track2 软件 | Danuser 实验室 | ||
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| FiJi | FiJI | https://imagej.net/Fiji) | |
| u-Track2 软件 | Matlab 工具。 安装时，请从网页（http://lccb.hms.harvard.edu/software.html）下载 .zip 文件，并解压至您选择的目录中 | ||
| GraphPad Prism | GraphPad 软件 |
参考文献
- Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Ce....
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重印与许可
