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方法文章

用于荧光显微镜分析膜受体扩散与簇大小的图像处理方案

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DOI：

10.3791/59314

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2019年4月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 2Campus Urb. Montepríncipe s/n, Univ. San Pablo CEU, 3Department of Immunology and Oncology, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 4Department of Cell Signaling, Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CSIC), 5Meyer Cancer Center, 6Department of Anatomy and Cell Biology, McGill Univ.

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于单粒子追踪图像分析的实验方案，可对荧光显微镜检测到的单个粒子的扩散系数、运动类型和簇大小进行定量评估。

摘要

如今，在许多生物学研究中，对视频序列中的颗粒进行追踪并对其轨迹进行后续分析已成为一项常见操作。本文以细胞膜受体簇的分析为模型，详细介绍使用Fiji（ImageJ）和Matlab程序完成该图像分析任务的实验方案：1）定义感兴趣区域，并针对这些区域设计相应的掩膜；2）在荧光显微镜视频中追踪颗粒；3）分析选定轨迹的扩散特性和荧光强度特征。通过对荧光显微镜结合图像处理所获得的扩散系数、运动类型和簇大小等参数进行定量分析，可为客观评估颗粒动力学行为以及环境条件改变所造成的影响提供有力工具。本文提供了针对这些特征分析的详细操作流程。该方法不仅能够实现单分子追踪检测，还可自动化估算细胞膜上的侧向扩散参数，对轨迹类型进行分类，并实现全面分析，从而克服了在细胞膜上对颗粒在整个运动轨迹中大小变化进行定量测量的技术难题。

引言

由于热扩散作用，嵌入脂双层中的膜蛋白处于持续运动状态。膜蛋白的动态特性对于调控细胞反应至关重要，因为分子间相互作用可形成从单体到寡聚体等不同大小的复合物，并影响信号传导复合物的稳定性。因此，阐明调控蛋白质动态行为的机制已成为细胞生物学领域的新挑战，这对于理解信号转导通路以及发现未知的细胞功能具有重要意义。

一些光学方法已被开发用于在活细胞中研究这些相互作用1。其中，全内反射荧光（TIRF）显微镜技术于20世纪80年代初期发展起来，可用于研究细胞膜上或非常接近细胞膜的分子相互作用2。为了研究从活细胞TIRF数据中获得的膜蛋白运动轨迹的动态参数，需要采用单粒子追踪方法（SPT）。尽管已有多种算法可用于此目的，但我们目前使用的是Jaqaman等人3发表的方法，该方法通过在连续帧之间连接粒子，将生成的轨迹片段整合为完整的轨迹（包括粒子暂时消失的情况），从而解决了高密度粒子场中粒子运动异质性的问题。该软件能够捕捉由聚集和解离事件引起的粒子合并与分裂过程3。该软件的输出数据之一是通过定义每个帧中粒子的X和Y位置，来检测整个轨迹上的粒子。

一旦检测到粒子，我们将应用不同的算法来确定短时间滞后扩散系数（D1-4）4,5。通过应用矩量标度谱（Moment Scaling Spectrum, MSS）6,7,8 分析，或通过调整均方位移（Mean Square Displacement, MSD）曲线拟合“alpha”值9，我们还可根据轨迹类型对粒子进行分类。

荧光图像中斑点强度的分析是该领域科学家共同关注的目标10,11。最常用的算法是所谓的“数目与亮度”（Number and Brightness）法。然而，该方法无法对可移动组分中的颗粒实现逐帧的准确强度检测。因此，我们开发了一种新算法，用于逐帧评估这些颗粒的强度，并确定其聚集状态。在使用U-Track2软件3检测到每个颗粒的坐标后，我们对其在整个轨迹过程中的每一帧定义其强度，同时考虑每帧中的细胞背景信号。该软件提供了多种选项用于确定斑点强度和细胞背景，并通过已知的单体和二聚体蛋白作为参考，计算所检测颗粒中蛋白质的大致数量（即簇大小）。

本文中，我们详细描述了执行以下三个步骤的方法：1）利用 U-track 对荧光显微镜视频中的单个粒子进行检测与追踪；2）通过 MSS 分析这些粒子的瞬时扩散系数（D1-4），并对具有较长轨迹的粒子判断其运动类型（受限运动、自由运动或定向运动）；3）测量每个荧光斑点在视频序列中的斑点强度，并根据估计的背景荧光进行校正。该方法可实现对聚集体大小的估算，并识别光漂白步进过程。

使用本实验方案无需特殊技能，任何具备细胞培养、流式细胞术和显微镜设备的实验室均可开展。该方案使用 ImageJ 或 Fiji（ImageJ 的一个发行版本12）、U-track3 以及一些临时编写的程序（http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip）。U-track 和临时编写的程序在 Matlab 环境下运行，Matlab 可安装于任何兼容的计算机上。

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方案

1. 生物样本的制备

  1. 在添加了10%胎牛血清（FCS）、丙酮酸钠（NaPyr）和L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基（完全RPMI）中培养Jurkat细胞。将Jurkat细胞（20 × 106 个细胞/400 µL含10% FCS的RPMI 1640）与单体GFP标记的趋化因子受体质粒（CXCR4-AcGFP，20 μg）进行电穿孔转染，以便通过荧光显微镜检测其表达情况。
    注意：也可使用其他单体荧光蛋白，如mCherry、mScarlet等。
  2. 转染后24小时，使用流式细胞仪分析细胞，以确定细胞活力和CXCR4-AcGFP的表达水平。
  3. 通过流式分选GFP低阳性细胞，选择CXCR4-AcGFP低表达的细胞（图1），因为在全内反射荧光显微镜（TIRFM）实验中需要受体的低表达水平，以确保能够对单个颗粒进行追踪并绘制单独的运动轨迹9。
  4. 定量测定细胞表面受体的数量。
    注意：举例而言13，每个细胞约有8,500 - 22,000个AcGFP标记的受体，相当于每平方微米约2 - 4.5个颗粒/μm2。
  5. 将分选后的细胞重悬于完全RPMI培养基中，在37 °C、5% CO2条件下孵育至少2小时。离心细胞（300 x g，5分钟），然后将其重悬于TIRF缓冲液（HBSS，25 mM HEPES，2% FCS，pH 7.3）中。
    1. 将细胞接种至经纤连蛋白包被（20 μg/mL，1小时，37 °C）的35 mm玻璃底共聚焦培养皿中（每皿2-3 × 105个细胞），在有或无相应配体（例如CXCL12，100 nM，1小时，37 °C）存在下进行处理。在图像采集前，将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育20分钟。
  6. 使用配备EM-CCD相机、100倍油浸物镜（HCX PL APO 100x/1.46 NA）和488 nm半导体激光器的全内反射荧光显微镜（TIRF）进行实验。该显微镜具备温度控制和CO2孵育功能。使用明场模式并通过粗调和微调焦旋钮定位和聚焦细胞，以尽量减少光漂白效应。在TIRF模式下进行精细聚焦时，应使用较低的激光强度，该强度不足以检测单个颗粒或引起光漂白效应（5%激光功率，28 μW）。
  7. 采集约50秒的视频图像序列（图像序列），并尽量缩短帧间时间间隔。渐逝场的穿透深度应为70-90 nm。将每种实验条件下采集的视频保存为".lif"格式（video.lif）。
    注意：在所述示例中，视频以49%激光功率（2 mW）、90 ms曝光时间、98 ms帧间隔采集，持续49秒（共500帧）。所选渐逝波的穿透深度为90 nm。

2. 图像选择与掩膜创建

  1. 对于每个实验条件（video.lif），创建一个新文件夹（VideoName），该文件夹必须包含每个系列对应的不同子文件夹。每个子文件夹将包含一个 "视频序列" 用于存储视频图像的文件夹和一个 "结果" 用于存放分析结果的文件夹。此时，文件结构应如下所示：
    视频名称/视频.lif
    视频名称/系列1/视频序列
    视频名称/系列1/结果
    注意： 从显微镜获得不同的.lif文件，每个处理条件下包含多个视频（例如 FN、FN+SDF）。 "视频生命科学" 对应于在显微镜下获取的所有TIRF电影图像（序列）的input.lif视频文件。 "视频序列" 文件夹将包含我们正在分析的视频的500帧。 "结果" 文件夹将包含分析过程中生成的所有文件。不同文件夹的准确命名与定位对于算法的正确运行至关重要。上述列表中加粗的名称是固定的（即必须使用这些名称，因为脚本会查找这些名称）。未加粗的名称可根据具体实验内容进行修改。
  2. 将 TIRFM 视频（.lif 文件）拖放到 Fiji 菜单栏中，用 Fiji 或 ImageJ 打开，然后点击 好的 使用 BioFormats 导入 lif 文件补充图1).
  3. 选择要处理的系列并点击 好的 (补充图 2A）。为了分析该视频而设计掩膜，还需导入包含不同发色团的多通道图像（在示例中，序列1为多通道图像，序列2为对应的视频）。该视频（以及多通道图像）应以ImageJ堆栈形式打开。在示例中（补充图 2B），图像在左侧，视频在右侧。
    注意： 如果无需为视频创建遮罩，请转至步骤 2.5。
  4. 创建一个掩膜。创建一个包含对设计掩膜有用的通道的单一图像。在此情况下，感兴趣的通道为红色、绿色和灰色通道。
    1. 将多通道图像中的各通道分离补充图 3A）：选择 图像 在菜单栏中点击 颜色 | 拆分通道不同的通道将显示为单独的图像（补充图3B).
    2. 将三个通道再次合并为单张图像（补充图 4A）：选择 图像 在菜单栏中选择 颜色 | 合并通道选择适当的通道并按下 好的 (补充图4B将生成一幅新的非堆叠图像（补充图4C).
    3. 使用以下方法同步两个窗口 同步 Windows 工具（补充图 5A）：选择 分析 在菜单栏中 | 工具 | 同步窗口将显示一个包含同步图像选项的新窗口（补充图 5B).
    4. 当两个窗口同步后（若无多通道图像关联，则仅同步视频），可对两个窗口中的相同区域进行裁剪。使用 ImageJ 浮动菜单中的矩形选区工具绘制感兴趣区域。选择 图像 在菜单栏中选择 作物 (补充图 6A）。这两个裁剪后的图像将分别显示（补充图6B).
    5. 取消同步两个窗口补充图 6B) 通过按压 取消同步所有 按钮在 同步 Windows 经理
  5. 如果尚未按照步骤2.4创建掩膜，请使用ImageJ浮动菜单中的矩形选择工具绘制感兴趣区域。
  6. 将视频保存为 图像序列 在目录中 视频序列 在相应的视频目录下补充图 7A）：选择 文件 在菜单栏中点击 另存为 | 图像序列… 将视频序列的标签重命名为 video0000.tif、video0001.tif、…、video0499.tif（补充图 7B）：在 名称 盒，重命名为 视频 并点击 好的序列必须单独存放在其目录中，才能被 U-track 成功使用。
    注意： 若不为视频设计遮罩，请转至步骤 2.8。
  7. 设计掩膜。选择多通道图像并打开分割编辑器插件（补充图8A）：在菜单栏中选择“插件”，然后选择“分割 | 分割编辑器”。根据需要，在分割编辑器的标签上右键单击，添加并重命名分割标签（补充图8B，C）。
    1. 在 ImageJ 浮动菜单中选择合适的选区工具（此处使用自由手绘工具），选中一个标签（Green），首先设计最外层的掩膜（补充图 9A）。设计完成后，按下 + 选择选项中的按钮 复合材料 窗口，选定的掩膜将显示在查看器中（补充图 9A）。用下一个标签（内部，红色）重复此步骤（补充图 9B).
      注意： 设计完绿色和内部标签的掩膜后，外部掩膜将占据图像的其余部分。
    2. 掩膜在图像中根据 RGB 标签窗口中标签的顺序被编码为区域 0、1、2、…。当所有不同标签的掩膜设计完成后，将掩膜保存为与视频相同的文件名，并使用相同的名称 mask.tif (补充图 9C）：选择 文件 在菜单栏中选择 另存为 | Tiff….
      注意： 所选的掩膜将用于扩散系数的计算和轨迹分类（见步骤4.2）。
  8. 检查此时的文件结构是否如下所示：
    视频名称/视频.lif
    视频名称/系列1/ mask.tif
    视频名称/系列1/ videoSeq/ video0000.tif
    视频名称/系列1/ videoSeq/ video0001.tif
    ...
    视频名称/系列1/ videoSeq/ video0499.tif
    视频名称/系列1/ 结果
    注意： mask.tif 是按照步骤 2.4 和 2.7 设计生成的掩膜图像。video*.tiff 是在步骤 2.6 中保存的视频文件。如上所述，上述列表中加粗的名称是固定的，即必须使用这些名称，因为脚本会查找这些特定名称。未加粗的名称可根据具体实验内容进行更改。

3. 颗粒追踪

  1. 使用 U-track 跟踪所选视频中可见的所有粒子。
  2. 打开 Matlab，通过菜单中的 Set Path | Add with Subfolders 选项将 U-track 目录添加到路径中。保存路径设置，以便今后运行 Matlab 时 U-track 始终位于路径中。此路径设置仅需执行一次。
  3. 将工作目录更改为包含待分析序列的目录。在控制台中输入（补充图 10）movieSelectorGUI 并按回车键启动 U-track。此时将打开 Movie selection 窗口（补充图 11A）。
  4. 点击 New movie 按钮，Movie edition 窗口将出现（补充图 11B）。
  5. 点击 Add channel 以选择包含视频的目录（VideoName/Series1/video），并填写视频信息参数。将 U-track 的结果输出目录设置为 Results（videoName/Series1/results）。
    注意： 视频信息参数可从显微镜及采集条件中获得。
  6. 点击 Advanced channel settings 并填写与采集相关的参数。参考示例中的参数值（补充图 11C）。
  7. 在 Advanced channel settings 窗口中点击 Save，然后在 Movie edition 窗口中点击 Save。程序将提示确认是否在 results 目录下写入名为 movieData.mat 的文件。请确认。
  8. 创建视频后，在视频选择窗口中点击 Continue。U-track 将询问待分析对象的类型。选择 Single-particles（补充图 12）。控制面板窗口将出现（补充图 13A）。
    1. 选择第一步 Step 1: Detection 并点击 Setting。Setting Gaussian Mixture-Model Fitting 窗口将出现（补充图 13B）。在示例中，"Alpha value for comparison with local background" 设置为 0.001，"Rolling-Window time averaging" 设置为 3（补充图 13B）。
    2. 在 Settings Gaussian Mixture-Model Fitting 窗口中点击 Apply，然后在 Control panel 中点击 Run。根据 补充图 13 中的配置，仅运行 Detection 步骤。此步骤耗时数分钟（2–5 分钟）。通过点击步骤 1 的 Result 按钮（Detection，补充图 14）检查结果。
      注意： 如上所示，视频中应在检测到的粒子位置显示红色圆圈。若未显示红色圆圈，则说明此步骤未正确运行。
  9. 执行轨迹识别，即将前一步骤中检测到的粒子合并为跨越多个帧的轨迹。这是 U-track 的 Step 2: Tracking，其设置应如 补充图 15A–C 所示。示例中 frame-to-frame linking 和 Gap closing, merging and splitting 的步骤 2 成本函数设置分别如 补充图 15B 和 C 所示。
  10. 设置完步骤 2 的参数后，在 Control panel 中点击 Run，仅运行步骤 2（补充图 16）。
  11. 执行轨迹分析，即步骤 3。设置参数如 补充图 17（右侧面板）所示。然后，在 Setting-Motion Analysis 面板中点击 Apply，在 Control Panel-U-Track 中点击 Run。此步骤耗时数秒。
  12. 通过步骤 3 的 Result 按钮验证所有轨迹是否已被正确识别。为此，请点击 Movie options 窗口中的 Show track number，逐帧检查每条轨迹是否被正确识别（补充图 18）。手动标注那些并非真实粒子的颗粒。
    注意： 若未进行此手动选择，可在后续计算扩散系数时（见步骤 4）执行较弱的自动选择。

4. 扩散系数的计算与轨迹分类

  1. 确保所有脚本均从待分析视频所在的目录调用（在本例中为 VideoName/Serie1）。
  2. 在 MATLAB 控制台中输入命令：trajectories=readTrajectories(0.1)，以读取所有轨迹并计算扩散系数，其中 0.1 表示连续两帧之间的时间间隔（单位为秒，参见 Movie Information 面板，补充图 11B）。
  3. 排除对应于错误识别的斑点/轨迹的轨迹。提供需要排除的斑点列表。例如，若要排除斑点 4、5 和 28，则输入：trajectories=readTrajectories(0.1, [4, 5, 28])。
  4. 计算该细胞每条轨迹的瞬时扩散系数。在此情况下，计算时间滞后为 4 时的扩散系数，记为 D1-4。在 MATLAB 控制台中运行命令：D=calculateDiffusion(trajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'alpha')，其中 trajectories 为第 3 步获得的轨迹，113.88e-3 为所获取图像的像素尺寸（单位为微米），0.0015 为测得的静止粒子扩散系数的上限（单位为 µm2/s），'alpha' 为如下所述的拟合模型。
    注意： 当使用更快的相机且需要更多帧来计算扩散参数时，可将该值提高至例如 20，命令为 D=calculateDiffusion(trajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'alpha', '', 20)。上述示例中位于 20 前的字符串参数 '' 是添加到输出文件的后缀，可用于区分不同的分析结果。
  5. 通过再次调用 calculateDiffusion 函数并选择不同的拟合模式（'confined'、'free' 或 'directed'）对均方位移（MSD）进行不同函数的拟合。在本例中选择 'confined' 模式：D=calculateDiffusion(trajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'confined')。
  6. 获取定向模型的拟合结果，如 补充图 20 所示。
  7. 将轨迹分解为短轨迹和长轨迹。使用命令：[shortTrajectories, longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50)，其中 50 表示被视为长轨迹的最小长度（以帧数计，如示例所示）。
  8. 对短轨迹使用第 4.3 步所述的相同拟合方法进行分析：D=calculateDiffusion(shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'directed', 'Short')。使用命令：D=calculateDiffusion(shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'alpha', 'Short') 分析短且异常的轨迹。
  9. 分析长轨迹，通过其矩量标度谱（Moment Scaling Spectrum, MSS）7 对运动类型进行分类。命令：trajectoriesClassification=classifyLongTrajectories(longTrajectories,113.88e-3,0.0015,'Long') 将在屏幕上显示分析结果，并在 results\TrackingPackage\tracks 目录下生成一个名为 trajectoryClassification<Suffix>.txt 的文件。

5. 通过粒子密度计算簇大小

注意：请确保所有脚本均从正在分析的视频所在目录调用（如示例所示，即 VideoName/Serie1 目录）。

  1. 分析每个粒子在其轨迹上的强度。为此，在 Matlab 控制台中输入以下命令来调用脚本：analyzeSpotIntensities，该脚本以第一部分中 U-track 计算出的轨迹作为输入。在最基本的形式下，只需在待分析视频所在的目录（如示例中的 VideoName/Series1）中不带任何参数地调用脚本：analyzeSpotIntensities()。通过向脚本提供参数，可以以多种方式配置此基本行为，例如：analyzeSpotIntensities(`Arg1´, Value1, `Arg2´, Value2, …)。以下是有效参数及其对应变量值（`ArgN´, ValueN）的列表。
    1. ('spotRadius´, 1)
      使用默认为 1 像素的 spotRadius 来分析荧光强度，这对应于以粒子为中心、大小为 3x3 的区域（(2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)）。
      注意：若要使用以粒子为中心的 5x5 区域，请选择 spotRadius 为 2，依此类推。
    2. ('onlyInitialTrajectories´, 1)
      若提供此参数（true，值为 1），则仅分析从视频第一帧开始的轨迹。这对于分析对照图像非常有用（默认值为 0，false）。
    3. ('trackTrajectory´, 0)
      若将此参数设为 0（false），则在所有帧中保持粒子在其第一帧中的坐标（这对静止粒子非常有用）。若将参数设为 1（默认值为 1，true），则粒子将根据 U-track 计算出的坐标在视频中被追踪。
    4. ('excludeTrajectories´, [4,5,28])
      包含在第 4.3 步中被排除的轨迹编号（在示例中为 4、5、28）。
    5. ('extendTrajectory ´, 1)
      若将此参数设为 1（true），则在该区域中分析至视频结束时的强度（即使轨迹更早终止）。粒子的坐标为轨迹中的最后一个坐标（若 trackTrajectory 为 true）或轨迹中的第一个坐标（若 trackTrajectory 为 false）。此参数默认为 false（0）。
    6. ('subtractBackground´, 1)
      若设置此参数，则通过该粒子背景荧光的估计值校正每个粒子处测得的原始荧光强度（见下文）。此参数默认为 true（1）。
    7. ('meanLength´, frame number)
      若设置此参数，则在指定长度处测量平均强度。设置 `meanLength', 20 可在前 20 帧中测量平均粒子强度。若未设置此参数，则在整条轨迹上计算粒子强度（默认为全长）。
    8. ('showIntensityProfiles´, 1)
      将此参数设为 1（默认为 0，false），以绘制不同帧中的强度曲线及其背景。
      注意：这些图对于识别光漂白现象非常有用，如补充图 21所示。对于每条轨迹，程序会自动分析是否可能发生光漂白。这是通过比较路径中前 N 帧和后 N 帧的强度值并使用学生 t 检验实现的。默认情况下，N 为 10，但可通过参数 `Nbleach´ 修改此值。
    9. ('backgroundMethod´, value)
      设置此参数以确定每个粒子的背景。可通过多种方式实现，通过更改"value"来选择使用哪种方式：
      1. ('backgroundMethod´, 0)
        使用此值可手动识别整个视频的背景。允许在视频的第一帧中选择 8 个点。在整个视频中分析这些点周围的区域，并将所有这些强度值的 95% 分位数选作所有粒子的背景强度。
      2. ('backgroundMethod´, 1)
        使用此值可手动识别每一帧的背景。为每个粒子和每一帧选择 8 个点。这是一项耗时的任务，但为用户提供了高度控制。这些区域中强度值的 95% 分位数被选作该帧中该粒子的背景强度。
      3. ('backgroundMethod´, 2)
        使用此值通过位于粒子周围半径为 `backgroundRadius´ 的圆上的 8 个点来估算每个粒子的背景（默认为 4*spotRadius）。
      4. ('backgroundMethod´, 3)
        使用此值通过首先在视频中定位细胞，然后分析每帧中细胞的强度来计算每帧的背景（补充图 22）。
        ​注意：背景被选为该分布中某一给定分位数的灰度值（默认为 0.5（=50%）），尽管此参数可通过 `backgroundPercentile´ 参数进行调整；若希望将细胞的大部分视为背景，可将此值设得更高，例如 0.9（=90%）。为帮助识别细胞，使用 `maxBackground´ 参数指定期望在各帧中出现的最大背景值（例如，在所有分析的视频中，背景值通常从不超过 6000）13。默认情况下，此选项设为 0，表示默认不使用此辅助功能。通过将参数 `showImages´ 设为 1 可查看细胞检测结果及用于背景估计的选定区域（随时按 CTRL-C 可停止执行）。
  2. 分别收集第 4 步和第 5.1 步计算出的所有轨迹的扩散和强度信息，使用 gatherDiffusion.AndIntensity ()。仅收集短轨迹的扩散和强度信息。为此，请使用第 4.7 步中使用的后缀，并输入：gatherDiffusionAndIntensity (`Short´)，其中 `Short´ 是第 4.7 步中使用的后缀。
  3. 通过输入以下命令收集矩谱标度和强度信息：gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long')，其中 `Long' 是第 4.7 步中使用的后缀。使用本方案生成的所有文件的汇总如图 2所示。

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结果

本方案可用于对荧光显微镜视频中检测到的颗粒进行自动追踪，并分析其动态特征。首先，将待追踪的荧光标记蛋白转染至细胞中。通过细胞分选获得细胞表面适量的受体表达水平，以满足单颗粒追踪（SPT）的要求（图1）。随后，对筛选出的细胞进行全内反射荧光（TIRF）显微镜分析，获得可用于本方案所述工具分析的视频数据（补充视频1）。

生成的视频无法直接进行分析，需要提取每个视频的独立帧。使用 ImageJ 可生成能够通过 Matlab 软件读取的文件，例如 .tiff 格式的视频帧或掩膜。U-track 对所选视频中观察到的粒子进行追踪，并将信息保存为 Matlab (.mat) 文件movieData.mat, 通道1检测结果.mat，通道1.mat，通道1追踪结果.mat），参见 图2

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讨论

所述方法易于操作，即使没有任何使用Matlab的先前经验也能完成。然而，Matlab程序对各种命令的命名规范以及程序所使用文件夹的路径定位要求极为精确。在追踪分析程序（步骤3）中，可修改多个参数。“设置高斯混合模型拟合”窗口（步骤3.8）控制U-track如何在视频中检测单个粒子，该过程通过拟合高斯混合模型实现，具体方法如文献3所述。该拟合过程中的一个关键参数定义了用于识别局部极大值的滤波器。此操作的成功与否取决于图像对比度以及图像中存在的噪声水平。第一个参数（与局部背景比较的Alpha值）控制将一个极大值判定为真实光斑的置信度，而第二个参数有助于在光斑识别过程中降低噪声。在“追踪”步骤（3.9）中，重要参数包括用于填补间隙的帧数（即一条轨迹可以跨越粒子未实际出现的帧，但该粒子在这些帧之前和之后均可见；在本示例中为0），以及一条轨迹必须跨越的最少帧数才能被视为有效轨迹（在本示例中为20；该参数与相机采集速度相关，且轨迹中的帧数需足够以支持扩散系数的计算）。此外，还需决定是否合并和拆分轨迹片段（在本示例中选择了这两种选项）。随后，必须设置代价函数中步骤1（帧间连接）的参数。该函数控制粒子在各...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Carlo Manzo 和 Maria García Parajo 在扩散系数分析方面提供的帮助及源代码。本工作部分得到了西班牙科学、创新与大学部（SAF 2017-82940-R）以及卡洛斯三世健康研究所 RETICS 计划（RD12/0009/009 和 RD16/0012/0006；RIER）资助项目的支持。LMM 和 JV 得到了西班牙国家研究委员会通用基金会 COMFUTURO 计划的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
人 Jurkat 细胞ATCCCRL-10915人类 T 细胞系。任何其他细胞类型均可使用该软件进行分析
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFPClontech632469可使用本实验流程追踪和分析不同的荧光蛋白
Gene Pulse X Cell 电穿孔仪 BioRad 我们对 Jurkat 细胞使用 280 V、975 mF 的参数。  请采用在您实验条件下最有效的转染方法。 
Cytomics FC 500 流式细胞仪 Beckman Coulter
MoFlo Astrios 细胞分选仪 Beckman Coulter根据转染效率的不同，可能无需进行细胞分选。  您也可使用稳定表达适量目标受体的细胞。
Dako QifikitDakoCytomationK0078用于定量细胞表面受体的数量
玻璃底微孔培养皿MatTek 公司P35G-1.5-10-C
人血浆来源纤连蛋白Sigma-AldrichF0895
重组人 CXCL12PeproTech300928A
Leica AM TIRF 倒置显微镜Leica
EM-CCD 相机Andor DU 885-CSO-#10-VP
MATLABThe MathWorks, Natick, MA
U-Track2 软件Danuser 实验室
ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
FiJiFiJIhttps://imagej.net/Fiji)
u-Track2 软件Matlab 工具。  安装时，请从网页（http://lccb.hms.harvard.edu/software.html）下载 .zip 文件，并解压至您选择的目录中
GraphPad PrismGraphPad 软件

参考文献

  1. Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
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