Method Article

用荧光显微镜分析膜受体扩散和簇簇的图像处理协议

DOI:

10.3791/59314

⸱

April 9th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 2Campus Urb. Montepríncipe s/n, Univ. San Pablo CEU, 3Department of Immunology and Oncology, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 4Department of Cell Signaling, Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CSIC), 5Meyer Cancer Center, 6Department of Anatomy and Cell Biology, McGill Univ.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里, 我们提出了一个单一粒子跟踪图像分析的协议, 允许定量评估扩散系数, 类型的运动和集群大小的单个粒子检测到的荧光显微镜。

Abstract

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视频序列上的粒子跟踪及其轨迹的后验分析是当今许多生物学研究中常见的操作。以细胞膜受体簇分析为模型, 我们提出了一个详细的协议, 这个图像分析任务使用斐济 (ImageJ) 和 Matlab 例程: 1) 定义感兴趣的区域和设计适应这些区域的面具;2) 跟踪荧光显微镜视频中的颗粒;3) 分析所选轨道的扩散和强度特性。通过荧光显微镜和图像处理获得的扩散系数、运动类型和聚类尺寸的定量分析, 为客观地确定粒子动力学和改性的后果提供了宝贵的工具。环境条件。在本文中, 我们提供了用于分析这些功能的详细协议。这里描述的方法不仅允许单分子跟踪检测, 而且还自动估计细胞膜上的横向扩散参数, 对轨迹类型进行分类, 并允许进行完整的分析, 从而克服在细胞膜上的整个轨迹上量化光斑大小的困难。

Introduction

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由于热扩散, 脂质双层中的膜蛋白连续运动。它们的动力学对于调节细胞反应是必不可少的, 因为分子间的相互作用允许从单体到低聚物大小不同的复合物的形成, 并影响信号复合物的稳定性。因此, 阐明控制蛋白质动力学的机制是细胞生物学中的一个新挑战, 是理解信号转导途径和识别意外细胞功能所必需的。

研究这些在活细胞1中的相互作用的光学方法已经发展起来。其中, 在20世纪80年代初发展起来的总内部反射荧光 (TIRF) 显微镜, 可以研究细胞膜2处或非常近的分子相互作用.为了研究从活细胞中 TIRF 数据获得的膜蛋白轨迹的动态参数, 需要一种单一的粒子跟踪方法 (SPT)。虽然有几种算法可用于此, 但我们目前使用 Jaqaman 等人3发布的算法, 通过在连续帧之间连接粒子以连接生成的轨道来解决密集粒子场中粒子运动的异质性问题段转化为完整的轨迹 (暂时的粒子消失)。该软件捕获聚合和离解事件3所产生的粒子合并和分裂。该软件的输出数据之一是通过定义粒子在每个帧中的 X 和 Y 位置来检测整个轨迹上的粒子。

一旦检测到粒子, 我们应用不同的算法来确定短时间格扩散系数 (d-11-4)4

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Protocol

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1. 生物样品的制备

  1. 在 RPMI 1640 培养基中生长 Jurkat 细胞, 辅以10% 的 FCS、Nabir 和 l-谷氨酰胺 (完整 RPMI)。电孢菌素细胞 (20 x10 6 6 细胞/rpmi 1640 与 10% fcs), 具有单体 gfp 标记的趋化因子受体载体 (CXCR4-acgfp, 20μg), 可使用荧光显微镜进行检测。
    请注意:可以使用其他单分子荧光蛋白, 如 mCherry、MCherry 等。
  2. 转染24小时后分析流式细胞仪中的细胞, 以确定细胞活力和 CXCR4-acgfp 表达。
  3. 通过 TRANSFECTED低阳性细胞的细胞分类 (图 1) 选择 cxcr4-acgp 水平较低的细胞 (图 1), 因为 tirfm 实验需要转染受体的低表达, 以确保跟踪个体的单个粒子跟踪轨迹9。
  4. 量化细胞表面受体的数量。
    请注意:例如13、~ 8, 500-22, 000 acgfp 标记的受体细胞, 对应 ~ 2-4.5 五粒细胞.
  5. 在完全 RPMI 中重新移植分类细胞, 在37°c、5% C....

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Results

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使用该协议可以自动跟踪在荧光显微镜电影中检测到的粒子, 并分析其动态特性。最初, 细胞被转染与荧光耦合蛋白被跟踪。适当水平的受体出现在细胞表面, 允许 SPT 通过细胞分类获得 (图 1)。通过 TIRF 显微镜对选定的细胞进行分析, 该显微镜以可使用本协议中描述的工具 (补充视频 1) 进行研究的格式生成视频。

生成的视频无法直接分析, 每个视频都需要独立的帧。ImageJ 的使用会生成可以使用 Matlab 软件 (如. tiff 格式或掩码的视频帧) 进行解释的文件。U 轨跟踪所选视频中看到的粒子, 并将信息保存在 Matlab (. mat) 文件 (电影数据座垫、 Channel_1_detection_result.mat、channel_1.mat、Channel_1_tracking_result.mat)中.......

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Discussion

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即使没有任何以前使用 Matlab 的经验, 所描述的方法也很容易执行。但是, Matlab 例程需要非常精确的不同命令的命名和程序使用的不同文件夹的本地化。在跟踪分析例程 (步骤 3) 中, 可以修改多个参数。"设置高斯混合模型拟合" 窗口 (步骤 3.8) 控制 u 轨如何检测视频上的单个粒子。这是通过拟合高斯混合模型来完成的, 如3所述。此管接头的关键参数之一定义了一个筛选器, 以帮助识别局部最大值。此操作的成功取决于图像对比度和图像中存在的噪声。第一个参数 (用于与本地背景进行比较的 Alpha 值) 控制最大值是真实点的置信度, 而第二个参数有助于减少点识别过程中的噪声。"跟踪" 步骤 (3.9) 中的重要参数是要缩小间隙的帧数 (即跟踪可能跨越实际看不到粒子的帧, 但在这些帧之前和这些帧之后可以看到; 在示例中, 0), 以及轨道必须跨越的帧数才能被视为成功的轨道 (在我们的示例中, 20个; 此参数与摄像机采集速度和轨道中的数字帧必须具有这样的值, 以便能够计算扩散 co效率)。还必须决定是否合并和拆分段 (在示例中选择了这两种可能性)。然后, 必须设置成本函数 (帧到框架链.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢卡洛·曼佐和玛丽亚·加西亚·帕拉霍的帮助和扩散系数分析的源代码。这项工作得到了西班牙科学、创新和大学部 (SAF 2017-82940-r) 和 salud Carlos iii 研究所 (RD12\ 0009/00/PR-侵入 00/AG) 赠款的部分支持;里尔)。LMM 和 JV 得到了 CSIC 基金会 COMFUTURO 方案的支持。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
人 Jurkat 细胞ATCCCRL-10915人 T 细胞系。任何其他细胞类型都可以使用此软件进行分析
pAcGFPm-N1 （PT3719-5 DNA3GFPClontech632469跟踪和分析不同的荧光蛋白
 生物辐射 我们使用 280 V、975 mF 的 Jurkat 电池。使用最适合您手的转染方法。
Cytomics FC 500 流式细胞仪 贝克曼库尔特
MoFlo Astrios 细胞分选仪 贝克曼库尔特根据转染水平，可能不需要细胞分选。您还可以使用具有足够水平的目标受体稳定表达的细胞。
Dako QifikitDakoCytomationK0078用于定量细胞表面的受体数量。
玻璃底微孔培养皿MatTek corporationP35G-1.5-10-C
来自血浆的人纤连蛋白Sigma-AldrichF0895
重组人 CXCL12PeproTech300928A
倒置徕卡 AM TIRF徕卡
EM-CCD 相机Andor DU 885-CSO-#10-VP
MATLABMathWorks，马萨诸塞州
U-Track2 软件Danuser Laboratory
ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
FiJiFiJIhttps://imagej.net/Fiji）
u-Track2 软件Matlab 工具。要安装，请从网页 （http://lccb.hms.harvard.edu/software.html） 下载 .zip 文件，然后在您选择的目录中解压缩文件
GraphPad PrismGraphPad 软件
可以使用此常规 Gene Pulse X Cell 电穿孔仪内蒂克

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Ce....

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