纯化并移植源自成肌祖细胞的外泌体以改善杜氏肌营养不良小鼠的心脏功能

摘要

本文介绍了一种通过移植来源于正常肌源性前体细胞的外泌体， transiently 改善杜氏肌营养不良小鼠心脏功能的实验方案。

摘要

杜氏肌营养不良症（DMD）是一种由功能性抗肌萎缩蛋白缺失引起的X连锁隐性遗传病。该疾病目前无法治愈，随着病情进展，患者会出现扩张型心肌病、心律失常和充血性心力衰竭等症状。DMD^MDX突变小鼠不表达抗肌萎缩蛋白，常被用作DMD的小鼠模型。在我们最近的研究中，观察到心肌内注射野生型（WT）肌源性前体细胞来源的外泌体（MPC-Exo）可短暂恢复DMD^MDX突变小鼠心肌中抗肌萎缩蛋白的表达，并伴随心脏功能的短暂改善，提示WT-MPC-Exo可能为缓解DMD心脏症状提供一种治疗选择。本文描述了MPC-Exo的纯化及其移植至DMD^MDX突变小鼠心脏的技术方法。

引言

杜氏肌营养不良症（DMD）是一种X连锁隐性遗传的进行性神经肌肉疾病，由DMD基因突变及功能性抗肌萎缩蛋白的缺失所致¹。抗肌萎缩蛋白主要在骨骼肌和心肌中表达，在平滑肌、内分泌腺和神经元中的表达水平较低^2,3。DMD是肌营养不良症中最常见的类型，全球每3,500至5,000名新生男婴中即有1例发病^4,5。患者通常表现为进行性肌肉坏死，早年青春期即丧失独立行走能力，并因心力衰竭和呼吸衰竭而在生命第二至第三个十年内死亡⁶。

扩张型心肌病、心律失常和充血性心力衰竭是杜氏肌营养不良症（DMD）常见的心血管表现^7,8。该疾病目前无法治愈，支持性治疗可能改善症状或延缓心力衰竭的进展，但极难改善心脏功能^9,10。

与杜氏肌营养不良症（DMD）患者类似，X连锁肌营养不良（MDX）小鼠缺乏抗肌萎缩蛋白（dystrophin），并表现出心肌病症状¹¹，因此被广泛用于DMD相关心肌病的研究。为了在受损肌肉中恢复抗肌萎缩蛋白的表达，同种异体干细胞治疗已被证明是治疗DMD的有效方法^12,13,14。外泌体是由多种细胞类型分泌的30–150 nm膜性囊泡，可通过转运信使RNA（mRNA）和非编码RNA等遗传物质，在细胞间通讯中发挥关键作用^{15,16,17,18,19,20,21}。

我们之前的研究表明，来源于成肌祖细胞（MPC）（如C2C12细胞系）的外泌体可通过直接心脏注射将抗肌萎缩蛋白（dystrophin）mRNA转移至宿主心肌细胞²²，提示异体来源的MPC衍生外泌体（MPC-Exo）可在MDX小鼠中短暂恢复杜氏肌营养不良症（DMD）基因的表达。本文重点介绍MPC-Exo的纯化与移植技术。

方案

动物的处理遵循奥古斯塔大学佐治亚医学院机构动物照护与使用委员会批准的方案及动物福利法规。

1. MPC 来源外泌体的分离与纯化

1. 在15 cm细胞培养皿中接种5 × 10⁶个C2C12细胞，加入20 mL含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素G和100 μg/mL链霉素的完全杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。于37 °C、5% CO₂条件下培养。
2. 使用摆动转子在4 °C条件下以100,000 × g超速离心FBS 18小时，制备无外泌体培养基。弃去沉淀。
3. 当培养皿中单层细胞达到80%融合度时，将完全DMEM更换为无外泌体培养基。
4. 使用移液管每48小时收集一次细胞培养皿中的上清液，共收集三次。将上清液收集至50 mL离心管中，并在150 × g条件下离心10分钟，以去除残留细胞。
5. 通过0.22 μm滤膜过滤上清液以清除细胞碎片。将过滤后的培养基加入超透明离心管中，使用摆动转子在4 °C条件下以100,000 × g超速离心120分钟，使外泌体沉淀。
6. 将含有外泌体的沉淀重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中，并用PBS充满整个超透明离心管。在4 °C条件下以100,000 × g再次超速离心120分钟，以去除污染蛋白。
7. 弃去上清液，将外泌体沉淀重悬于100 µL PBS中。于-80 °C保存以备后续使用。
8. 进行透射电子显微镜分析时，取3 µL外泌体悬液滴加于200目甲醛膜包被的铜网上，室温静置5分钟。随后按标准醋酸铀染色步骤进行染色²³。用透射电子显微镜观察半干燥状态的载网。

2. 心肌内外泌体递送

注意： 每组使用六只小鼠。

1. 使用腹腔注射（i.p.）100 mg/kg 体重的氯胺酮联合 10 mg/kg 体重的赛拉嗪对 DBA/2J-DMD^MDX 小鼠（雄性；年龄 > 10 个月；体重 (BW) > 18 g）进行麻醉，并通过夹趾反应确认麻醉深度。
2. 用胶带将每只小鼠仰卧固定在手术平台上，固定四肢，并在上齿下方水平放置一根 3-0 缝线，以固定上颌。
3. 将脱毛膏涂抹于小鼠胸部左侧，以去除皮肤上的毛发。
4. 经口腔使用 24 G 导管进行气管插管，并通过啮齿类动物呼吸机（见材料表）以每分钟 195 次呼吸的频率通入室内空气进行通气。
5. 使用 75% 酒精和 10% 聚维酮碘对皮肤进行消毒。
6. 从左侧胸骨边缘至左腋窝做一条 10‒15 mm 的斜切口，用剪刀剪开胸大肌和胸小肌，然后经第四肋间行左侧开胸术。轻柔插入牵开器带，将胸腔撑开至 10 mm 宽度，注意避免损伤左肺。
7. 使用两把直镊子去除心包膜，将其分开并向后置于牵开器尖端后方，以暴露心脏。使用 31 G 胰岛素针头在左心室前壁的一个位点进行心肌内注射 MPC-Exo（50 μg 溶于 30 µL PBS 中）或 30 µL PBS（作为对照）。
8. 依次使用 6-0 尼龙缝线缝合胸腔、胸肌和皮肤。
9. 使小鼠恢复。当出现节律性自主呼吸后，将小鼠从呼吸机上移除并拔管。观察并记录术后小鼠的状态。

3. 超声心动图

注意：由一名对实验分组不知情的单一观察者进行超声心动图检查及数据分析。

1. 在 PBS/外泌体移植后两天，使用 1‒2% 异氟烷对小鼠进行麻醉。
2. 用胶带将小鼠固定于仰卧位，并在左侧胸部区域涂抹预热的超声耦合剂。
3. 按照先前所述方法通过超声心动图评估左心室功能^16,24。
   1. 获取左心室（LV）的胸骨旁长轴二维（B 模式）图像，然后将超声探头旋转 90°，在乳头肌水平获取左心室短轴图像。
   2. 记录 M 型超声心动图图像，并测量左心室舒张末期内径（LVEDD）、左心室收缩末期内径（LVESD）、左心室舒张末期容积（LVEDV）和左心室收缩末期容积（LVESV）。
      注意：缩短分数（FS%）= [(LVEDD − LVESD) / LVEDD] × 100，左心室射血分数（LVEF%）= [(LVEDV − LVESV) / LVEDV] × 100。

4. 免疫组织化学

1. 在PBS/外泌体移植两天后，麻醉小鼠（参见步骤2.1），切开胸骨以暴露胸腔。解剖下腔静脉，并使用连接5 mL注射器的25 G针头蝴蝶导管，从左心室心尖部先灌注3 mL PBS，随后灌注3 mL 4%多聚甲醛，室温下进行。
2. 将固定后的心脏组织包埋于石蜡中，并切成5 μm厚的切片。
3. 在二甲苯中脱蜡，并按以下顺序在乙醇溶液中逐级水化：100%二甲苯（3分钟）、100%二甲苯（3分钟）、100%乙醇（1分钟）、100%乙醇（1分钟）、95%乙醇（1分钟）、80%乙醇（1分钟）、H₂O（1分钟）。
4. 用4%多聚甲醛在室温下固定组织切片8分钟。
5. 将切片浸入柠檬酸钠缓冲液（0.01 M，pH 6.0）中，使用抗原修复仪进行抗原修复。
6. 用含1%聚乙二醇叔辛基苯基醚的PBS溶液在室温下透化处理切片1小时。
7. 用含5%山羊血清的PBS溶液在室温下封闭切片1小时。
8. 将切片与稀释的一抗（抗dystrophin抗体）在PBS中（1:100）于4 °C孵育过夜，随后用PBS洗涤三次，每次5分钟。
9. 将切片与稀释的二抗（Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG）在PBS中（1:400）于室温孵育45分钟。
10. 使用自发荧光淬灭试剂盒（见材料表）消除自发荧光。
11. 使用含DAPI的封片剂（见材料表）封片。
12. 在共聚焦显微镜下观察切片。

结果

从C2C12细胞中分离和纯化外泌体的流程图见图1A。为确认外泌体的存在，我们进行了透射电子显微镜分析。透射电子显微镜图像（图1B）显示了来源于C2C12细胞的外泌体呈明亮且圆形的囊泡形态。Western印迹分析证实了外泌体标志物CD63和TSG101的存在（图1C）。

我们在将PBS/MPC-外泌体注射到MDX小鼠左心室前壁后，观察到半透明的水肿区域（图2），表明已成功将液体注入心肌组织。

为了确定心肌祖细胞外泌体（MPC-Exo）递送是否能够恢复MDX小鼠心脏中抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的表达，我们对抗肌萎缩蛋白进行了免疫荧光染色，并使用共聚焦显微镜成像。我们观察到部分心肌细胞中...

讨论

分离纯化外泌体的方法对于研究外泌体功能至关重要。一种常见的外泌体分离技术是聚乙二醇（PEG）介导的沉淀法^17,18,25。外泌体可在PEG中沉淀，并通过低速离心收集。PEG介导的纯化方法操作简便、成本低廉，且无需任何高级设备，但其外泌体纯度存在担忧，因为其他脂蛋白也可能同时沉淀且难以去除。超滤法是一种基于分子量及排阻尺寸限制的常规外泌体分离方法²⁶。与基于超速离心的分离方法相比，超滤法速度更快，但可能导致大囊泡结构受损。外泌体膜表面存在多种表位，如CD9、CD63和CD81²⁷，这为利用这些表位与磁珠结合的抗体之间的免疫亲和相互作用来分离外泌体提供了替代方法。尽管免疫分离法具有高特异性²⁸，但该技术仅能分离出总外泌体群体中的一个亚群，可能扭曲实验结果。因此，超速离心法似乎更适用于本项外泌体功能研究。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 μm 滤光片	Fisherbrand	09-720-004
15 cm 细胞培养皿	赛默飞世尔科技	157150
24 G 导管	TERUMO	SR-OX2419CA
31 G 胰岛素注射针头	BD	328291
4% 多聚甲醛	Affymetrix	AAJ19943K2
50 mL 离心管	赛默飞世尔科技	339652
6-0 缝合线	NDC Pro Advantage	P420697
Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG	赛默飞世尔科技	A-11008
抗生素-抗真菌溶液	康宁	30-004-CI
抗肌营养不良蛋白抗体	Abcam	ab15277
抗原修复剂	Aptum Biologics	R2100-US	抗原修复
自发荧光淬灭试剂盒	Vector Laboratories	SP-8400
C2C12 细胞系	ATCC	CRL-1772
离心	Unico	C8606
Change-A-Tip 高温电灼器	Bovie Medical Corporation	HIT
共聚焦显微镜	Zeiss	蔡司 780 直立共聚焦显微镜
DBA/2J-mdx 小鼠	杰克逊实验室	013141
DMEM	康宁	10-013-CM
胎牛血清（FBS）	康宁	35-011-CV
山羊血清	MP Biomedicals, LLC	191356
异氟烷	Patterson Veterinary	07-893-1389
氯胺酮	Henry Schein	056344
含DAPI的封片剂	Vector Laboratories	H-1500
小鼠牵开器套装	Kent Scientific	SURGI-5001
聚乙二醇叔辛基苯基醚	Fisher Scientific	BP151-100
啮齿类动物呼吸机	哈佛仪器公司	55-7066
SW-28 Ti 转子	贝克曼	342207
Vevo 2100 成像平台	FUJIFILM VisualSonics	Vevo 2100	超声系统
超速离心机	贝克曼	365672
超清晰管	贝克曼	344058
赛拉嗪（XylaMed）	Bimeda-MTC Animal Health Inc.	1XYL003 8XYL006