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方法文章

白背飞虱取食水稻的偏好性评估

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DOI：

10.3791/59323

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2020年5月23日

 ,  , 
1Agricultural Genomics Institute at Shenzhen, Chinese Academy of Agricultural Sciences

本文内容

摘要

本研究提出了一种简单且可行的方法，用于评估白背飞虱在实验室条件下取食水稻时的非偏好性抗性。文中还讨论了当前鉴定白背飞虱和褐飞虱抗性方法的策略优化与改进方案。

摘要

利用抗虫水稻种质资源及其相关基因是培育抗虫品种的首要需求，但水稻抗虫表型鉴定的准确性仍是主要难题。迫切需要开发新方法或改进现有方法，以筛选水稻抗虫性。本文介绍了一种在实验室条件下评估水稻对白背飞虱（Sogatella furcifera）非偏好性抗性的简便可行的方法。通过成对比较法，持续分析成虫白背飞虱在成熟水稻植株上的取食或栖居偏好性，并以白背飞虱在水稻植株上动态分布的变化作为抗性鉴定的指标。该方法操作简便、易于观察，且周期较短。该方法的应用还可拓展至研究其他类似半翅目昆虫（如褐飞虱 Nilaparvata lugens（Stål））的取食与产卵偏好性。

引言

水稻是全球超过三分之一人口的主食，其中90%以上的水稻在亚洲生产并消费1,2。褐飞虱（WBPH）和白背飞虱（BPH）是水稻最具破坏性的害虫，对水稻生产构成严重威胁3。从成本和环境角度考虑，培育和应用抗虫水稻是防控飞虱危害最有效的途径4,5,6。因此，筛选抗性水稻种质资源是培育抗虫水稻的关键前提。准确鉴定水稻抗性表型有助于目标基因的精细定位及后续功能研究。然而，由于抗性机制复杂，表型鉴定已成为主要难点。水稻对害虫的抗性可分为三种类型，即抗生性、耐害性和非偏好性7。每种类型反映了水稻抗虫机制的不同方面。目前，应用最广泛的飞虱抗性筛选方法是标准苗箱筛选技术（SSST），该方法可用于快速鉴定大量水稻植株的抗性表型，并在短时间内获得候选抗性种质系8。

然而，苗期茎鞘刺吸法仅能反映水稻在苗期的抗性，且在评估耐害型抗性机制方面更为有效。水稻对昆虫的抗性还体现在抗生性方面，如若虫存活率、若虫历期和卵孵化率，以及非偏好性方面，如栖境、取食和产卵偏好9。此外，水稻苗期抗性表现往往不够稳定，随着植株的生长，抗性趋于稳定。因此，苗期茎鞘刺吸法无法全面反映水稻的整体抗性水平。同时，水稻在不同生长阶段对害虫的抗性存在差异，苗期与成熟期植株的抗性机制有明显不同。研究表明，成熟期水稻植株可释放挥发性次生代谢物以避免害虫侵袭，表现为害虫对水稻植株在取食或产卵上的非选择性10,11。这也是一种非常关键的抗性机制，在防止害虫危害、保障水稻成熟期产量方面发挥着重要作用。

目前，通过非偏好性来鉴定水稻抗性仍是一个挑战。现有两种主要方法。一方面，将稻飞虱和水稻植株置于方形尼龙网笼中12。尽管该方法被认为在同时对多个水稻品系进行实验时相对高效，但需要较大的实验空间，并且由于尼龙网材料不透明，给观察和计数带来一定困难。另一方面，采用Y型嗅觉仪法，根据水稻释放的挥发性物质差异进行昆虫选择实验。由于使用玻璃容器，该方法便于观察14。该方法的主要局限性之一是仅能判断挥发性气味，且对实验装置的密闭性要求严格，同时耗时较长。

本文介绍了一种改进的评估水稻对褐飞虱非偏好性抗性的方法，该方法操作简便，易于观察。该方法也可用于研究褐飞虱及其他半翅目害虫的栖息、取食和产卵偏好行为。

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方案

1. 准备飞虱、水稻植株和聚氯乙烯笼

  1. 飞虱
    1. 在防虫网室内，将白背飞虱（WBPH）饲养于感病水稻品种台中本地1号（TN1）的分蘖上，使其自然繁殖多代。选择长翅型、新羽化的雌性成虫用于后续实验。
      注：白背飞虱由位于中国深圳的中国农业科学院农业基因组研究所提供。
  2. 水稻植株
    1. 将各水稻品系的种子浸水后，置于人工气候室中，设置环境参数为28 °C、相对湿度75%–80%、光照周期14小时光照/10小时黑暗，持续2天，直至种子萌发。
    2. 将每种测试水稻品系的30粒已萌发种子均匀播种于一个塑料育秧盘（20 cm [长] × 15 cm [宽] × 10 cm [高]）中，盘内填充3–4 cm深的水稻土。
    3. 用一层薄薄的细干土覆盖种子，然后用水润湿表层干土。
    4. 将育秧盘放入一个200目防虫网笼（75 cm [长] × 75 cm [宽] × 75 cm [高]）中，置于人工气候室内，环境条件为28 °C、相对湿度75%–80%、光照周期14小时光照/10小时黑暗。每天浇水以保持土壤湿润，连续培养7天，直至幼苗达到二叶一心至三叶一心期。
    5. 选取20株生长状况相近的秧苗，移栽至直径10 cm、底部带孔的塑料育苗钵中（每钵1株秧苗）。
    6. 将育苗钵放置于200目防虫网笼（75 cm [长] × 75 cm [宽] × 75 cm [高]）中，在人工气候室内维持28 °C、相对湿度75%–80%、光照周期14小时光照/10小时黑暗，并在托盘底部保持适量水分，继续培养约30天，直至植株进入分蘖期，具有一至两个分蘖。
    7. 在实验开始前48小时，将水稻植株修剪至仅保留一个分蘖。
  3. 圆柱形聚氯乙烯网笼
    1. 获取尺寸为120 cm × 90 cm、厚度为0.5 mm的透明聚氯乙烯（PVC）材料。
    2. 将其制成高90 cm、直径35 cm的圆柱形结构。
    3. 使用订书机固定圆柱两端的重叠部分，确保重叠区域长度约为90 cm，宽度约为10 cm。
    4. 用压敏胶带沿圆柱外围将整个重叠区域密封。
      注：确保圆柱形网笼能够垂直放置于地面，且笼体与地面之间无明显缝隙。
    5. 裁剪200目的尼龙网，每片尺寸为50 cm × 50 cm；准备足够数量以供后续步骤使用。
    6. 准备足量橡胶圈，确保其直径约为1.5 mm，收缩状态下周长至少为32 cm。

2. 昆虫与水稻处理

  1. 在温控室中，将一个直径为28 cm、高为10 cm的圆形塑料托盘放置于平坦的水泥地面上，温控室参数设置见步骤1.2.6。
    注意：若温室地面为土壤，请尽量选择平坦的区域，以确保托盘放置平稳。
  2. 选取两个不同水稻品系的盆栽（来自步骤1.2.7），并列放入托盘中，并向塑料托盘内注入足量水。
  3. 用步骤1.3.4中制备的圆柱形笼子罩住这两个测试用的水稻盆栽。
  4. 将一块尼龙网（来自步骤1.3.5）覆盖在笼子顶部。
    注意：笼内的两盆水稻可作为一个组别；每组重复15个重复。水稻盆栽的摆放位置和方向应随机，但应尽量确保两株水稻的叶片互不接触。
  5. 使用自制的吸虫器采集40只新羽化的雌性白背飞虱（WBPH）成虫（参见第1.1节）。
  6. 将WBPH成虫放入一支玻璃管（直径2 cm，高15 cm）中，并用海绵塞封口。
  7. 掀开尼龙网的一角（见步骤2.4）。
  8. 取下玻璃管上的海绵塞，将玻璃管置于笼子中央，释放全部WBPH成虫。
  9. 迅速盖好尼龙网，并用橡皮筋密封，防止WBPH成虫逃逸（图1）。

3. 记录与观察

  1. 在接种后 3、6、24、48、72、96 和 120 小时，观察每株水稻上褐飞虱的分布情况。
  2. 通过透明笼子观察并记录不同水稻植株上各方向的叶鞘和叶片上的褐飞虱数量。
    注意：观察过程中应轻柔操作，避免干扰褐飞虱。

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结果

本研究使用了三个水稻品系。水稻品系 FY01 对褐飞虱（WBPH）敏感，作为对照组。水稻品系 HZ08 和 HZ06 是在 FY01 背景基础上分别导入潜在的抗褐飞虱 X1 基因和 X5 基因的转基因品系。因此，通过比较 HZ08/HZ06 与 FY01 的抗性，可以判断相应插入基因是否具有潜在抗性功能。本研究比较了两种水稻植株在取食或栖居方面的抗性表现，从而揭示这两个基因是否可能参与非偏好型抗性机制。

记录了不同时间点实验水稻植株上褐飞虱（WBPH）的数量。通过将每株水稻上的褐飞虱数量除以笼内两株水稻植株上褐飞虱总数（不包括位于地面或笼壁等其他位置的个体），计算出褐飞虱的比率。使用商业软件进行进一步的统计数据分析。采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey多重比较检验，以评估各比较组之间的显著性差异。百分比数据在进行方差分析前经反正弦平方根转换。结果表明，在HZ08和FY01两个水稻品系的比较实验中，0至6小时初期阶段，两个品系水稻上的褐飞...

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讨论

水稻植株在成熟期会通过叶片鞘表面的一种特殊物理结构释放挥发性次生代谢物，以控制害虫或降低其交配能力（如在褐飞虱中所示），这是关键的抗性机制13。在水稻植株中，非偏好性不仅与取食行为有关，还与栖息环境和交配行为相关。然而，目前的研究主要集中在若虫阶段的非偏好性4,12，尚需建立一种用于鉴定成虫非偏好性的新方法。本研究主要描述了一种用于鉴定成熟水稻植株对成年褐飞虱非偏好型抗性的方法。该方法所需实验材料较少，操作步骤简便。但前期准备工作极为重要，因为实验过程中需要大量褐飞虱。为确保实验结果的准确性和说服力，必须使用处于相似生长阶段的褐飞虱。考虑到水稻生长期较长，需提前周密规划实验，以保证水稻植株成熟时有充足的飞虱来源。此外，每种水稻品系应种植多个重复作为备用。需要注意的是，在执行步骤2.8时，不要将褐飞虱直接释放到水稻植株上，而应尽量确保在实验开始时飞虱在笼内均匀分布。

该方法更适用于飞行害虫的非趋性抗性鉴定，尤其适用于那些...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢杨朗博士在白背飞虱饲养和水稻培养方面提供的帮助。本工作得到了深圳市大鹏新区产业发展专项资金（项目编号：KY20180216 和 KY20180115）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
温湿度可控室Ningbo Jiangnan Instrument FactorySZJYS2013温度、相对湿度、光周期控制
带海绵塞的玻璃管//直径 2 cm，高 15 cm
手工制作的吸虫器///
防虫网笼 //200目，（长 × 宽 × 高，75 × 75 × 75 cm）
尼龙网//200目
水稻土///
塑料育苗盒 // （长 × 宽 × 高，20 × 15 × 10 cm）
塑料育苗盆//直径10 cm
塑料托盘// （直径 × 高，28  × 10 cm）
FY01品系水稻种子//60粒
HZ06品系水稻种子//30粒
HZ08品系水稻种子//30粒
TN1品种水稻种子//若干
橡胶圈//直径1.5 mm，周长32 cm
透明胶带///
SPSS Statistics 19.0IBM Corporation/统计数据分析
订书机///
透明PVC //尺寸为120 cm × 90 cm，厚度0.5 mm

参考文献

  1. Du, B., et al. Identification and characterization of Bph14, a gene conferring resistance to brown planthopper in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. , (2009).
  2. Khush, G. S. Strategies for increasing the yield potential of cereals: case of rice as an example. Plant Breeding. 132 (5), 433-436 (2013).
  3. Heong, K. L., Hardy, B. Breeding for resistance to planthoppers in rice. Planthoppers: New Threats to the Sustainability of Intensive Rice Production Systems in Asia. , International Rice Research Institute, Asian Development Bank, Australian Government, Australian Centre for International Agricultural Research . 401-409 (2009).
  4. Han, Y., Wu, C., Yang, L., Zhang, D., Xiao, Y. Resistance to Nilaparvata lugens in rice lines introgressed with the resistance genes Bph14 and Bph15 and related resistance types. PLoS One. 13 (6), e0198630(2018).
  5. Arora, R., Sandhu, S. Advances in Breeding for Resistance to Hoppers in Rice. Breeding Insect Resistant Crops for Sustainable Agriculture. , Springer. Singapore. 101-130 (2017).
  6. Sarao, P. S., et al. Donors for resistance to brown planthopper Nilaparvata lugens (Stål) from wild rice species. Rice Science. 23 (4), 219-224 (2016).
  7. Horgan, F. Mechanisms of resistance: a major gap in understanding planthopper-rice interactions. Planthoppers: New Threats to the Sustainability of Intensive Rice Production Systems in Asia. Heong, K. L., Hardy, B. , International Rice Research Institute, Asian Development Bank, Australian Government, Australian Centre for International Agricultural Research. 281-302 (2009).
  8. He, J., et al. High-resolution mapping of brown planthopper (BPH) resistance gene Bph27 (t) in rice (Oryza sativa L). Molecular Breeding. 31 (3), 549-557 (2013).
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  12. Liu, Y., et al. A gene cluster encoding lectin receptor kinases confers broad-spectrum and durable insect resistance in rice. Nature Biotechnology. 33 (3), 301(2015).
  13. Lou, Y., et al. Differences in induced volatile emissions among rice varieties result in differential attraction and parasitism of Nilaparvata lugens eggs by the parasitoid Anagrus nilaparvatae in the field. Journal of Chemical Ecology. 32 (11), 2375(2006).
  14. Da Silva, A. G., et al. Non-preference for oviposition and antibiosis in bean cultivars to Bemisia tabaci biotype B (Hemiptera: Aleyrodidae). Revista Colombiana de Entomologia. 40 (1), 7-14 (2014).

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水稻抗虫性成对比较非偏好型抗性抗虫水稻取食行为分析半翅目昆虫偏好实验室筛选方法动态变化监测

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