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一种利用多光谱成像流式细胞术进行体外微核试验的自动化方法

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DOI：

10.3791/59324

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2019年5月13日

1Biology Department, Luminex Corporation

本文内容

摘要

体外微核试验是一种评估遗传毒性和细胞毒性的成熟方法，但使用手动显微镜计数该试验费时费力，且存在主观性及不同评分者之间的变异性。本文描述了一种利用多光谱成像流式细胞术实现该试验完全自动化的操作方案。

摘要

体外微核（MN）试验常用于评估细胞毒性和遗传毒性，但通过人工显微镜计数该试验费时费力，且由于不同评分者之间的差异，结果存在不确定性。为解决这一问题，已引入自动载玻片扫描显微镜和常规流式细胞术方法，以消除评分者偏差并提高通量。然而，这些方法本身也存在固有局限性，例如无法观察细胞的细胞质，以及流式细胞术缺乏对微核的可视化验证或图像数据存储功能。多光谱成像流式细胞术（MIFC）有望克服这些局限性。MIFC结合了显微镜的高分辨率荧光成像能力与常规流式细胞术的统计稳健性和高速度。此外，所有采集的图像均可存储在剂量特异性的文件中。本文描述了在MIFC上执行完全自动化MN试验所开发的实验方案。采用低渗溶液（75 mM KCl）处理人淋巴母细胞样TK6细胞使其膨胀，再用4%甲醛固定，并用Hoechst 33342染色细胞核内容物。所有样品均以悬浮状态在MIFC上运行，从而能够获取试验所需全部关键事件的高分辨率图像（例如含有或不含微核的双核细胞，以及单核和多核细胞）。图像在MIFC数据分析软件中被自动识别、分类和计数，实现对细胞毒性和遗传毒性的自动化评分。结果表明，在TK6细胞暴露于丝裂霉素C和秋水仙碱后，与溶剂对照组相比，使用MIFC进行体外微核试验可在多个不同细胞毒性水平下检测到微核频率的统计学显著升高；而在暴露于甘露醇后，则未观察到微核频率的显著升高。

引言

体外微核（MN）试验是一种常用的检测方法，广泛用于评估细胞毒性和遗传毒性，在化学物质和药物研发以及暴露于各种环境、职业或生活方式因素人群的人体生物监测等多个研究领域中作为筛选工具1,2,3。MN 由细胞分裂过程中产生的染色体片段或完整染色体组成，这些物质未能整合到两个主要子代细胞核中的任何一个。在分裂后期（telophase）之后，这些染色体物质在细胞质内形成一个独立的、圆形结构，与任一主核分离2。因此，MN 可代表DNA损伤，并已被用作遗传毒性检测中多年来的终点指标4。测量MN最适宜的方法是细胞质分裂阻断微核（CBMN）试验。通过CBMN试验，可在样本中加入细胞松弛素B（Cytochalasin B, Cyt-B），从而对双核细胞（BNCs）中的MN发生频率进行计数。Cyt-B允许核分裂但阻止细胞质分裂，因此可将MN的计数限定于仅完成一次分裂的双核细胞5。

已开发并验证了结合显微镜和流式细胞术的实验方案，并常规用于体外微核试验6,7,8,9,10,11,12,13,14显微镜技术的优势在于能够直观地确认微核（MN） 是有效的，但耗时且不同评分者之间容易产生差异15为了解决这一问题，开发了自动显微成像技术用于扫描载玻片并捕获细胞核和微核的图像16,17,18,19，但无法观察到细胞质，因此难以确定微核是否真正与特定细胞相关联。此外，这些方法在识别多核细胞（POLY细胞，包括三核和四核细胞）方面存在困难，而使用Cyt-B进行细胞毒性计算时必须识别此类细胞9采用流式细胞术进行微核（MN）检测的方法利用荧光信号以及前向散射和侧向散射光强度，来识别细胞裂解后释放出的细胞核和微核群体。20,21,22这使得在几分钟内即可从数千个细胞中获取数据，并可进行自动化分析23然而，由于无法直接观察细胞，难以确认所计数的事件是否真实存在。此外，裂解细胞膜会抑制细胞松弛素B（Cyt-B）的使用，同时产生含有其他碎片（如染色体聚集体或凋亡小体）的悬液，且无法将这些碎片与微核（MN）区分开来。24.

鉴于这些局限性，多光谱成像流式细胞术（MIFC）是进行微核试验的理想系统，因为它结合了显微镜的高分辨率荧光成像能力以及传统流式细胞术的统计稳健性和高速度。在MIFC中，所有细胞被引入流体系统，随后通过流体动力聚焦集中于流动池比色皿的中心。所有细胞的正交照明通过明场（BF）发光二极管（LED）、侧向散射激光以及至少一个荧光激光实现。荧光光子由三个高数值孔径物镜（20x、40x或60x）之一捕获，随后通过光谱分解元件。光子最终聚焦到电荷耦合器件（CCD）相机上，从而获得流经流动池的所有细胞的高分辨率图像。为避免图像模糊或拖尾，CCD工作在时间延迟积分（TDI）模式，该模式通过在CCD上逐行转移像素信息，使其与流动中细胞的速度同步，从而追踪目标。像素信息最终从最后一行像素中采集。TDI成像结合光谱分解技术，可同时获取流经流动池的所有细胞的最多12幅图像（2幅明场图像，10幅荧光图像）。所有采集的图像均存储在特定样本的数据文件中，允许随时使用MIFC数据分析软件进行分析。最后，数据文件保留了细胞图像与所有双变量图上数据点之间的关联。这意味着，传统双变量图上的任意一个数据点均可被高亮显示，其对应的明场和荧光图像也将随之呈现25。

近年来，基于MIFC的方法已被开发用于开展辐射生物剂量快速分类的微核（MN）检测以及遗传毒理学检测26,27,28,29,30,31 32,33 。研究表明，与其它方法相比，MIFC能够以更高的通量对主核、微核（MN）及细胞质进行成像26。在MIFC数据分析软件中，可自动识别分析所需的所有细胞类型，包括单核细胞（MONO细胞）、双核细胞（BNCs，含或不含MN）以及多核细胞（POLY细胞），并通过多种数学算法实现Fenech等人提出的评分标准6,34。生物剂量学研究结果显示，在量化每BNC中MN发生率时，所获得的剂量-反应校准曲线的幅度与文献中其他自动化方法得到的结果相似29。此外，近期毒理学研究证明，利用MIFC可自动捕获、识别、分类并计数MONO细胞、BNCs（含或不含MN）和POLY细胞的图像。该实验方案及数据分析方法使得在TK6细胞暴露于多种致断裂剂和致非整倍体剂后，能够计算其细胞毒性和基因毒性32。

本文所述方案介绍了一种利用成像流式细胞术（MIFC）进行体外微核（MN）检测的方法。本研究所采用的样品处理技术处理单个样本所需时间少于2小时，与其他方法相比操作相对简便。MIFC分析软件中的数据分析过程较为复杂，但按照本文所述步骤，可在数小时内完成分析模板的创建。此外，一旦模板建立完成，即可自动应用于所有采集的数据，无需进一步人工干预。该方案详细阐述了将TK6细胞暴露于致断裂剂和致非整倍体剂的全部步骤，描述了细胞培养、处理和染色的方法，并演示了如何利用MIFC获取高分辨率图像。此外，本文还展示了当前在MIFC软件中分析数据的最佳实践，以自动识别并计数单核细胞（MONO）、双核细胞（BNC）和多核细胞（POLY），用于评估细胞毒性和遗传毒性。

方案

1. 培养基的制备与TK6细胞的培养

注意：本实验方案中使用的某些化学品具有毒性。细胞松弛素B（Cytochalasin B）若被吸入、吞咽或与皮肤接触，可能致命。操作时应穿戴适当的个人防护装备，包括实验服和两副腈类手套。操作后须彻底清洗双手。甲醛/福尔马林（formalin/formaldehyde）若被吸入或吞咽具有毒性，对眼睛、呼吸系统和皮肤具有刺激性，可能通过吸入或皮肤接触引起致敏反应。存在对眼睛造成严重损伤的风险。该物质为潜在致癌物。

  1. 准备 565 mL 的 1× RPMI 培养基。向一个 500 mL 的 1× RPMI 1640 培养基瓶中加入 5 mL MEM 非必需氨基酸（100×）、5 mL 丙酮酸钠（100 mM）、5 mL 青霉素-链霉素-谷氨酰胺混合液（100×）以及 50 mL 胎牛血清（FBS）。在生物安全柜中配制培养基，并于 2–8 °C 保存。在加入 TK6 细胞前，将培养基预热至 37 °C（参见材料表）。
  2. 在 10 mL 培养基中解冻 1 mL TK6 细胞（以 DMSO 保存于 -80 °C）。以 200 × g 离心 8 分钟，吸除上清液。将细胞重悬于 50 mL 培养基中，于 37 °C、5% CO2 条件下培养。TK6 细胞的倍增时间约为 12–18 小时，需经过数次（3 或 4 次）传代培养，细胞才能达到最大增殖速率（参见材料表）。
  3. 将 100 mL 细胞培养至浓度约为 7–8 × 105 个细胞/mL。

2. 断裂剂和/或非整倍体诱导剂及细胞松弛素B的制备

  1. 配制所需断裂剂和非整倍体诱导剂的适当储备浓度。例如，对于丝裂霉素C，将一整瓶2 mg溶解于10 mL无菌水中，以获得200 µg/mL的最终储备浓度。丝裂霉素C可在4 °C下保存三个月（参见材料表）。
  2. 在实验当天，若使用无菌水或DMSO进行稀释，则分别将所需化学物质配制成比目标暴露浓度高10倍或100倍的稀释液。
  3. 对于丝裂霉素C，用无菌水配制0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 µg/mL的3 mL稀释液；对于秋水仙碱，用无菌水配制0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 µg/mL的3 mL稀释液；最后，对于甘露醇，用无菌水配制5、10、20、30、40和50 mg/mL的3 mL稀释液。
  4. 通过将5 mg瓶装物溶解于25 mL DMSO中，配制200 µg/mL的细胞松弛素B储备液。细胞松弛素B可在-20 °C下保存数月。

3. 细胞暴露于断裂剂和/或非整倍体剂

  1. 在 T25 培养瓶中，将 1 mL 所需化学物质（例如丝裂霉素 C）加入约 7–8×105 个细胞/mL 的 9 mL 细胞悬液中。对照样品中加入 1 mL 无菌水。将培养瓶置于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 3 小时。
    注意：若化学物质用 DMSO 稀释，则每瓶仅加入 100 µL 化学物质，并在对照组中加入 100 µL DMSO。每瓶应含有 9.900 mL 细胞悬液。
  2. 孵育 3 小时后，从培养箱中取出培养瓶，将细胞转移至 15 mL 聚丙烯离心管中。在 200 × g 条件下离心 8 分钟，吸除上清液，将细胞重悬于含 10 mL 新鲜培养基的新 T25 培养瓶中。向每瓶中加入 150 µL 细胞松弛素 B 原液（200 µg/mL），使其终浓度为 3 µg/mL。
  3. 将培养瓶放回 37 °C、5% CO2 培养箱中，恢复培养时间应等于 OECD 指南建议的 1.5–2.0 倍倍增时间9。本研究中所用 TK6 细胞的恢复时间为 24 小时。
    注意：本实验所用 TK6 细胞的倍增时间为 15 小时，采用 24 小时恢复时间（1.6 倍倍增时间）。恢复时间少于 1.5 倍倍增时间会降低高剂量处理组样品的增殖能力，从而影响双核细胞（BNC）数量；反之，恢复时间超过 2.0 倍倍增时间则会导致对照组中多核细胞比例异常升高，进而影响细胞毒性计算的准确性。

4. 固定和DNA含量标记用缓冲液的制备（参见材料表）

  1. 通过将 2.79 g 氯化钾（KCl）加入 500 mL 超纯水中，配制 75 mM 的氯化钾（KCl）溶液。使用磁力搅拌器搅拌溶液 5 分钟，并通过 200 µm 滤膜进行无菌过滤。该 75 mM KCl 溶液可在 4 °C 下保存数月。
  2. 为实验准备足量的 4% 甲醛溶液，预计每个样品需加入 2.1 mL。例如，配制 10 mL 的 4% 甲醛溶液时，将 4 mL 的 10% 甲醛储备液加入 6 mL 的不含 Ca2+ 或 Mg2+ 的 1× Dulbecco 磷酸盐缓冲液（PBS）中。此 4% 甲醛溶液可在室温下保存数周。
  3. 通过将 10 mL 胎牛血清（FBS）加入 500 mL 的 1× PBS 瓶中，配制 510 mL 清洗缓冲液（含 2% FBS 的 1× PBS）。
  4. 通过将 100 µL 储备液（1 mg/mL）Hoechst 33342 加入 9,900 µL 的 1× PBS 中，配制 10 mL 浓度为 100 µg/mL 的 Hoechst 33342 溶液。Hoechst 33342 溶液可在 4 °C 下保存数月。

5. 样本处理：低渗膨胀、固定、细胞计数和DNA含量标记

  1. 恢复期结束时，从培养箱中取出所有培养瓶，将所有样品转移至15 mL聚丙烯离心管中，在200 × g 条件下离心8分钟。
  2. 吸除上清液，重悬细胞并加入5 mL 75 mM KCl。轻轻颠倒混匀三次，于4 °C孵育7分钟。
  3. 向每个样品中加入2 mL 4%甲醛，轻轻颠倒混匀三次，于4 °C孵育10分钟。此步骤起到“软固定”作用。
  4. 将所有样品在200 × g 条件下离心8分钟，吸除上清液后用100 µL 4%甲醛重悬，孵育20分钟。此步骤起到“硬固定”作用。
  5. 向每个样品中加入5 mL洗涤缓冲液，在200 × g 条件下离心8分钟。吸除上清液后用100 µL洗涤缓冲液重悬细胞。
  6. 将所有样品转移至1.5 mL微量离心管中。
  7. 对每个样品进行细胞计数，以确定每份样品的细胞数量。样品浓度通常很高，因此可能需要在1×PBS中进行1:100稀释（10 µL样品加入990 µL PBS）以获得准确计数。
    注意：此时最好使用血细胞计数板进行细胞计数。由于KCl使细胞质呈现半透明状，自动细胞计数仪难以识别细胞；此外，多核细胞体积较大，自动计数仪在计数时也存在困难。
  8. 若不立即在MIFC上运行样品，可将样品在4 °C保存数天。准备上机前，向每个样品中加入5 µL 100 µg/mL的试剂（每1×106 细胞/mL），并加入10 µL 500 µg/mL RNase（每100 µL样品），使终浓度为50 µg/mL。将样品在37 °C、5% CO2 条件下孵育30分钟。
  9. 将所有样品在200 × g 条件下微量离心8分钟，用移液器吸除上清液，保留约30 μL。上机前用移液器充分重悬所有样品，确保管内无气泡。切勿涡旋震荡。

6. 启动并校准 MIFC

  1. 确保鞘液、系统校准试剂、除泡器、清洗液和消毒液容器已装满，废液罐为空。启动系统，双击 MIFC 软件图标。点击启动按钮，并确认选中 启动所有校准和测试 复选框。系统将自动冲洗管路、加载鞘液和系统校准试剂，并完成系统校准（参见 材料表）。

7. 在 MIFC 上运行样本

注意：本节假定使用双摄像头MIFC。若使用单摄像头MIFC，请参见补充文件1——完整方案，第7节，了解采集过程中绘图的创建方法

  1. 启动 MIFC 数据采集软件（参见材料表）。图 1 显示了仪器设置。打开 405 nm 激光器，并将激光功率设为 10 mW（A）。关闭所有其他激光器（包括 SSC），并将明场（BF）设为通道 1 和 9（B）。确认放大倍数滑块已设置为 60x（C），已选择高灵敏度模式（D），且图像库中仅显示通道 1、7 和 9。
  2. 单击散点图图标。选择全部群体，并在 X 轴上选择面积 M01，在 Y 轴上选择宽高比 M01。单击方形区域图标，并在单个细胞周围绘制一个区域。将此区域命名为单细胞。在图上单击右键，选择区域。高亮显示单细胞区域，并将 X 坐标更改为 100 和 900，Y 坐标更改为 0.75 和 1（图 1I）。
  3. 单击散点图图标。选择单细胞作为父代群体，在 X 轴上选择梯度均方根 M01，在 Y 轴上选择梯度均方根 M07。单击方形区域图标，并在大多数细胞周围绘制一个区域。将此区域命名为聚焦细胞。在图上单击右键，选择区域。高亮显示聚焦细胞区域，并将 X 坐标更改为 55 和 75，Y 坐标更改为 9.5 和 20（图 1J）。
  4. 单击直方图图标。选择聚焦细胞群体，并选择强度 M07作为特征。单击线性区域图标，并在直方图主峰上绘制一个区域。将此区域命名为DNA 阳性。在图上单击右键，选择区域。高亮显示DNA 阳性区域，并将坐标更改为 2 × 105 和 2 × 106。该范围可能需要根据直方图上的强度峰进行调整（图 1K）。
  5. 设置采集参数（图 1E）。指定文件名和目标文件夹，将事件数更改为 20,000，并选择DNA 阳性群体。
  6. 单击加载（图 1F），并将对照样品放入 MIFC 中。单击采集按钮以收集数据（图 1G）。采集完成后，单击返回按钮以退回样品（图 1H）。从仪器中取出样品管。对实验中所有剩余样品重复此过程。

8. 在 IDEAS 中打开数据文件

  1. 启动MIFC分析软件包（参见材料表）。点击“开始分析”以启动打开文件向导。通过浏览选择所需的原始图像文件（.rif）。点击打开按钮，然后点击下一步。
  2. 由于本实验为单色检测，无需进行补偿，因此点击下一步跳过补偿步骤。此阶段尚无可用的分析模板，因此再次点击下一步。若已从补充材料中下载分析模板，则此时应选择该模板。这些模板仅适用于配备两个摄像头的MIFC系统，且在图像采集时需将明场（BF）设置在通道1和通道9，核成像设置在通道7。
  3. 默认情况下，.cif和.daf文件的名称将自动设置为与.rif文件一致。不建议更改.cif和.daf文件的名称。点击下一步。通过选择01和07设置图像显示属性。点击下一步。本应用无专用向导，因此点击完成。在第9–14节操作过程中，务必频繁保存数据分析文件（.daf）和分析模板（.ast），以避免进度丢失。

9. 创建掩模和特征以识别 BNCs

  1. 点击 图像库属性 图标（蓝白图标）。在 显示属性 选项卡中，点击 将范围设为像素数据，然后将颜色更改为黄色。点击 确定。此时Hoechst图像在黑色背景上更易于观察。
  2. 创建非凋亡细胞图。
    1. 点击 分析 选项卡，然后点击 掩模。点击 新建，然后点击 函数。在 函数 下选择 阈值，在 掩模 下选择 M07，并将 强度百分比 设置为50。点击 确定，然后再次点击 确定。点击 关闭。
    2. 点击 分析 选项卡，点击 特征，然后点击 新建。在 特征类型 中选择 面积。在 掩模 中选择 阈值(M07,Ch07,50)。点击 设置默认名称，然后点击 确定。点击 关闭 以开始计算特征值。
    3. 点击 点图 图标。选择 全部 群体。在 X轴特征 中选择 Contrast_M01_Ch01 特征，在 Y轴特征 中选择 Area_Threshold(M07,Ch07,50)。点击 确定。
    4. 点击 矩形区域 按钮，并在大多数细胞周围绘制一个区域。将该区域命名为 非凋亡。右键点击图表，然后点击 区域。高亮选中 非凋亡 区域。将 x坐标 设置为0和15，将 y坐标 设置为50和300。点击 关闭。
  3. 创建BNC掩模（步骤9.3.1–9.3.5），用于识别仅包含两个细胞核的细胞。
    1. 在图像库中浏览并点击一个BNC。此操作用于在Hoechst通道中可视化掩模的创建过程。
    2. 点击 分析 选项卡，然后点击 掩模。点击 新建，然后点击 函数。在 函数 下选择 LevelSet，在 掩模 下选择 M07，选择 中间层掩模 单选按钮，并将 轮廓细节尺度 设置为3.00。点击 确定，然后再次点击 确定。
    3. 点击 新建，然后点击 函数。在 函数 下选择 膨胀，在 掩模 下选择 LevelSet(M07,Ch07,Middle,3)。将 显示图像 设置为 Ch07，并将 像素数量 设置为2。点击 确定，然后再次点击 确定。
    4. 点击 新建，然后点击 函数。在 函数 下选择 分水岭，在 掩模 下选择 Dilate(LevelSet(M07,Ch07,Middle,3)2)。将 显示图像 设置为 Ch07，并将 线条粗细 设置为1。点击 确定，然后再次点击 确定。
    5. 点击 新建，然后点击 函数。在 函数 下选择 范围，在 掩模 下选择 Watershed(Dilate(LevelSet(M07,Ch07,Middle,3)2))。将 显示图像 设置为 Ch07。将最小和最大面积值分别设置为115和5000。将最小和最大长宽比值分别设置为0.4和1。点击 确定。在 名称 字段中将文本更改为 BNC，然后点击 确定。
  4. 创建特征和图表，以获得最终的BNC群体
    1. BNC斑点计数特征：点击 分析 选项卡，然后点击 特征，再点击 新建。在 特征类型 中选择 斑点计数。在 掩模 中选择步骤9.3.5中创建的最终BNC掩模。将 连通性 设置为 四邻域，并将名称更改为 斑点计数 BNC。点击 确定，然后点击 关闭 以计算特征值。
    2. BNC斑点计数直方图：点击 直方图 图标。选择 非凋亡 作为父群体。在 X轴特征 中选择 斑点计数 BNC 特征。点击 确定。点击线性区域图标。在第 2 个区间上绘制一个区域。将该区域命名为 2N。
      注：请参考补充材料1中的第9节——完整方案，以创建其余的掩模、特征和图表，从而识别最终的BNC群体。

10. 在 BNC 群体中创建掩膜和特征以鉴定运动神经元

  1. 创建MN掩膜。在图像库中浏览并选择包含MN的BNC，点击该图像。此操作旨在可视化Hoechst通道中MN掩膜的生成。点击 分析 然后点击标签 口罩.
    1. 创建斑点识别掩膜 1：
      1. 点击 新 然后点击 功能. 在……之下 功能 选择 斑点 并确保 明亮 单选按钮被选中。在 口罩 选择 M07，设置 斑点与细胞背景比值 至 2.00. 设置 最小半径 至 2 以及 最大半径 到 6. 点击 好的 然后 好的 再次。
      2. 点击 新 然后点击 功能. 在……之下 功能 选择 范围，以及在……之下 口罩 选择 LevelSet(M07,Ch07,Middle,3). 设置 图像显示 至 Ch07. 设置 最小与最大面积 分别为 80 和 5000。设置 最低限度 和 最大宽高比 分别为 0 和 1。单击 好的 然后 好的 再次。
      3. 点击 新 然后点击 功能. 在……之下 功能 选择 稀释，在……之下 口罩 选择 范围(水平集(M07,Ch07,中间,3),80-5000,0-1). 设置 图像显示 到 Ch07. 设置 像素数量 至 2. 点击 好的 然后 好的 再次。
      4. 点击 新. 双击 点状结构（M07，Ch07，明场，2，6，2） 遮罩以将其添加到遮罩定义中。单击 以及 操作员，然后是 否 操作员。双击 Dilate(Range(LevelSet(M07, Ch07, Middle, 3), 80-5000, 0-1), 2) 遮罩以将其添加到遮罩定义中。点击 好的.
      5. 点击 新，然后 功能. 在……之下 功能 选择 范围 并在蒙版下选择在 10.1.1.4 中创建的蒙版：
        1. 选择 点状结构（M07，Ch07，明场，2，6，2） 和非 Dilate(Range(LevelSet(M07, Ch07, Middle, 3), 80-5000, 0-1), 2).
        2. 设置 图像显示 到 Ch07. 设置 最小与最大面积 分别为10和80。设置 最小与最大宽高比 分别为 0.4 和 1。点击 好的 然后 好的 再次。斑点识别掩模1已完成。
          注：参见补充材料1——完整方案第10节，以生成用于识别最终MN群体的掩膜、特征及图示

11. 创建掩膜、特征及图表以鉴定单核与多核细胞群体

  1. 创建 POLY 掩模。点击 分析，然后 口罩，然后 新方法 然后 功能. 在……之下 功能 选择 范围， 在……之下 口罩 选择 Watershed(膨胀(LevelSet(M07, Ch07, 中间, 3), 2)). 设置 图像显示 至 Ch07. 设置 最低限度 和 最大面积 将数值分别设置为 135 和 5000。设置 最低限度 和 最大纵横比 值分别设置为 0.4 和 1。点击 好的。在 名称 领域，将文本更改为阅读 POLY 然后点击 好的 然后 关闭多核细胞掩膜已生成完毕。
  2. 创建 POLY 组件掩膜。
    1. POLY 组分掩膜 1：单击 分析 然后按 Tab 键 口罩，然后 新，然后进行功能检测。在 功能 选择 组分，以及在 口罩 选择 POLY 口罩。对于 排序功能 选择 面积，以及用于 排序顺序 点击 下降 单选按钮。设置 排名 到 1. 点击 好的 然后 好的 再次。
    2. POLY组分掩模2、3和4：重复11.2.1中的所有步骤，但需设置 排名 至 2, 3 和 4 用于创建各个组件的掩模。
  3. 使用多边形掩膜进行斑点计数
    1. 点击 分析 然后按 Tab 键 特点，然后 新。对于 特征类型，选择 斑点计数。对于 口罩 选择 POLY 口罩并设置连接性为 4点击 设置默认名称 并点击 好的 然后 关闭 用于计算特征值。
    2. 单击直方图图标。选择 非凋亡的 群体。对于 X轴特征 选择 斑点计数_POLY_4 特征
    3. 单核细胞斑点计数区域。单击线性区域图标。在分区上绘制一个区域 1 在 11.3.2 中创建的直方图上标记该区域 1N.
    4. TRI 斑点计数区域。单击线性区域图标。在 bin 上绘制一个区域 3 在 11.3.2 中创建的直方图上标记该区域 3N.
    5. QUAD MONO 斑点计数区域。单击线性区域图标。在 bin 上绘制一个区域 4 在 11.3.2 中创建的直方图上标记该区域 4N.
  4. 鉴定单核细胞（MONO）群体。
    1. 创建 MONO 纵横比功能。单击 分析 然后按 Tab 键 特点，然后 新. 在 特征类型，选择 长宽比 特征与下方 口罩 选择 组分(1, 区域, POLY, 降序). 点击 设置默认名称 然后点击 好的.
    2. 创建 MONO 循环性特征。在特征管理器窗口仍打开的情况下，单击 新. 在……之下 特征类型，选择 圆形度 特征与下方 口罩 选择 组件(1, 区域, POLY, 降序). 点击 设置默认名称 然后点击 好的 然后点击 关闭 用于计算特征值。
    3. 对于圆形 MONO 细胞点图，单击 点图 图标。选择 1N 作为亲本群体。对于 X轴特征 选择 圆形度分量(1, 面积, POLY, 降序) 以及对于 Y轴特征 选择 长径比_组件(1, 面积, POLY, 降序). 点击 好的. 点击 方形区域 按钮，并在图的右上部分围绕细胞群绘制一个区域。将此区域命名为 环状_1N。右键单击图表，然后单击 区域. 强调 环状_1N 区域。更换 X 坐标 至20和55并更改 Y 坐标 至 0.85 和 1.0。点击 关闭.
    4. 创建区域 POLY/Area_M07 要素。单击 分析 然后按 Tab 键 特点，然后 新. 在……之下 特征类型，选择 面积 特征与下方 口罩 选择 组分(1, 面积, POLY, 降序). 点击 设置默认名称 然后点击 好的.
    5. 在功能管理器窗口仍处于打开状态时，单击 新 然后在“特征类型”下点击 联合的 单选按钮。从功能列表中，选中该 面积_组件(1, 面积, 多边形, 降序) 并单击向下箭头将其添加到特征定义中。单击除号（/）。选择 Area_M07 特征，然后单击向下箭头将其添加到特征定义中。单击 设置默认名称 并点击 好的. 点击 关闭 开始计算特征值。
    6. 对于最终的单核细胞群点图，单击 点图 图标。选择 环状1N 作为亲本群体。对于 X轴特征 选择 长宽比_M07 以及用于 Y轴特征 选择 面积_组成部分(1, 面积, POLY, 降序) / 面积_M07点击 好的. 单击 方形区域 按钮，并在大多数细胞周围绘制一个区域。将此区域命名 单核. 右键单击图表，然后单击 区域. 突出显示 单核细胞 区域。改变 X 坐标 至 0.85 和 1.0，并改变 Y 坐标 至 0.55 和 1.0。点击 关闭.
      注意：请参阅补充材料1——完整实验方案中的第11节，以生成用于鉴定最终三核及多核细胞群体的掩膜、特征和图谱。

12. 创建自定义视图以检查 BNC 和 MN 掩模

  1. 单击 图像库属性 按钮，然后单击 视图 选项卡。单击 复合图像 选项卡，然后单击 新建。在 名称 下输入 Ch01/Ch07。单击 添加图像，在 图像 下选择 Ch01，并将 百分比 设置为 100。再次单击 添加图像，在 图像 下选择 Ch07，并将 百分比 设置为 100。
  2. 单击 新建，并在“名称”下输入 BNC 和 MN 掩模
  3. 单击 添加列。在 图像类型 下选择 Ch01，在 掩模 下选择 无
  4. 单击 添加列。在 图像类型 下选择 Ch07，在 掩模 下选择 无
  5. 单击 添加列。在 图像类型 下选择 Ch07，在 掩模 下选择 BNC
  6. 单击 添加列。在 图像类型 下选择 Ch07，在 掩模 下选择 MN 掩模
  7. 单击 添加列。在 图像类型 下单击 复合图像 单选按钮。Ch01/Ch07 复合图像应自动添加到视图中。单击 确定 以关闭图像库属性窗口。

13. 创建自定义视图以检查 POLY 掩模

  1. 请参阅补充材料1——完整方案中的第13节，以创建自定义视图来检查POLY掩膜

14. 创建统计表以列举关键事件

  1. 点击 报告 选项卡，然后点击 定义统计报告。在新窗口中，点击 添加列。
  2. 添加 BNC 计数统计项。在 统计项 下选择 计数，在 选定群体 下选择 BNCs 群体。点击 添加统计项，将该统计项加入列表。
  3. 重复步骤 14.2，分别为 MN BNCs、MONO、TRI 和 POLY 群体创建独立的列。点击 关闭，然后点击 确定。
  4. 数据分析模板已完成（图 2）。保存该模板（文件，另存为模板）。完整掩模列表详见 补充材料 2 - 掩模列表。

15. 使用数据分析模板批量处理实验文件

  1. 在 工具 菜单下，单击 批量数据文件，然后在新窗口中单击 添加批量。
  2. 在新窗口中，单击 添加文件 以选择要添加到批量中的实验文件（.rif）。在 选择模板或数据分析文件（.ast、.daf） 选项下，单击打开文件夹图标，浏览并打开步骤 14.4 中保存的数据分析模板（.ast 文件）。
  3. 单击 预览统计报告 按钮以预览统计表格。此处不会显示任何数值，因为尚未进行计算。但此步骤可用于确认在运行批量处理前已正确选择分析模板。
  4. 单击 确定 关闭当前窗口，然后单击 提交批量 以开始对所有文件进行批量处理。
  5. 批量处理完成后，包含所有 .rif 文件的文件夹中将生成一个 .txt 文件。请使用这些统计数据计算基因毒性和细胞毒性。

16. 计算遗传毒性和细胞毒性参数

  1. 计算遗传毒性：要计算遗传毒性，请使用步骤 15.5 中创建的统计表。将 MN BNCs 群体中的细胞数除以 BNCs 群体中的细胞数，然后乘以 100：
    静态平衡方程：\( \frac{MN \, BNCs}{BNCs} \times 100 \)；公式分析。
  2. 计算细胞毒性：通过将 TRI 和 QUAD 细胞数相加，确定 POLY 细胞的总数。
    1. 使用 MONO、BNCs 和 POLY 中的细胞数，按以下方式计算细胞分裂阻断增殖指数（CBPI）：
      细胞增殖指数公式，CBPI=[(MONO)+(2×BNCs)+(3×POLY)]/(MONO+BNCs+POLY)，方程。
    2. 最后，使用对照培养物（C）和化学暴露培养物（T）的 CBPI 值，按以下方式计算每种培养物的细胞毒性：
      细胞毒性公式，计算细胞活力的方程，化学分析，教学示意图。

结果

本文所述的分析方法可实现对含有或不含微核（MN）的双核细胞（BNCs）进行自动识别与计分，以计算基因毒性。此外，单核细胞（MONO）和多核细胞（POLY）也可被自动识别与计分，用于计算细胞毒性。在对这些事件进行计分时，必须遵循已发表的计分标准6,34，这些标准已集成于MIFC数据分析软件中。本文结果表明，在人源淋巴母细胞样TK6细胞暴露于已知的微核诱导化学物（丝裂霉素C和秋水仙碱）后，随着细胞毒性的增加，微核频率的统计学显著上升可被检测到。其他化学物的类似结果已在另一篇独立发表的文章中得到验证32。此外，甘露醇的使用结果表明，非微核诱导化学物也可通过本文所述的MIFC方法被正确识别。本实验方案中用于生成所有掩模、特征及区域边界的参数，若改用不同细胞类型（例如中国仓鼠细胞）进行实验时，可能需要相应调整。

图3展示了四个选定的图版，用于识别双核细胞（BNCs）（图3A-3D）。此处显示的是一个直方图，可用于选择具有两个细胞核的细胞（图3A），以及双变量图，可用于根据相似的圆形度（图3B）、相似的面积和强度（图3C），以及具有明显分离、无重叠细胞核的BNCs（图3D）来筛选BNCs，符合评分标准6,34。图3E展示了明场（BF）和Hoechst图像，以及BNC和微核（MN）的掩模图像，表明可识别并计数含有单个或多个微核的BNCs。通过计算最终BNC群体中含微核的BNCs比例，可评估遗传毒性。图4展示了使用POLY掩模应用“斑点计数”功能以识别单核（MONO）、三核（TRI）和四核（QUAD）细胞的方法。随后可将TRI和QUAD细胞数量相加，得到最终的POLY细胞总数（表1）。通过使用本方案中提供的公式，可进一步计算细胞毒性。因此，实验中的每个剂量点均可通过遗传毒性和细胞毒性两个参数进行评估。

图5展示了有丝分裂抑制剂秋水仙碱（Colchicine）、断裂剂丝裂霉素C（Mitomycin C）以及阴性对照甘露醇（Mannitol）的遗传毒性和细胞毒性数值。对于秋水仙碱（图5A），0.02 至 0.05 μg/mL 剂量组与溶剂对照组相比，微核（MN）频率出现具有统计学意义的升高，分别达到 1.28% 和 2.44%（表1）。对于丝裂霉素C（图5B），0.4 和 0.5 μg/mL 两个较高剂量组与溶剂对照组相比，微核频率也表现出具有统计学意义的升高，分别为 0.93%（0.4 μg/mL）和 1.02%（0.5 μg/mL）（表2）。最后，对于甘露醇（图5C），所有测试剂量均未引起超过30%的细胞毒性，且与溶剂对照组相比，微核频率未出现显著升高，符合预期结果（表3）。

用于DNA分析的流式细胞仪设置，包括照明、流体系统、明场梯度RMS与Hoechst荧光强度结果图。
图1：MIFC仪器设置。 显示按照方案第7步所述的MIFC设置界面截图。(A) 将405 nm激光功率设为10 mW。(B) 设置明场（BF）通道1和9。(C) 选择60倍物镜。(D) 选择最慢的流速，以获得最高分辨率的图像。(E) 设定采集事件数为20,000个。(F) 点击Load按钮开始加载样品。(G) 点击Acquire按钮开始图像采集。(H) 点击Return按钮将未使用的样品返回。(I) 明场（BF）长宽比（Aspect Ratio）对明场面积（Area）的散点图，用于单细胞筛选。(J) Hoechst梯度RMS对明场梯度RMS的散点图，用于聚焦良好细胞的筛选。(K) Hoechst荧光强度直方图，用于DNA阳性细胞的筛选。 请点击此处查看本图的高清版本。

细胞核图像处理；分割；分析；散点图；显微镜数据；细胞分类。
图 2：分析软件的设门策略。 显示本实验方案第9节中所述设门策略的截图。图中按顺序展示用于识别双核细胞（红框）、微核（黄框）以及单核和多核细胞（蓝框）的区域。 请点击此处查看此图的放大版本。

细胞核分析示意图；长宽比、斑点计数；显微镜、强度比图。
图 3：含有或不含微核（MN）的双核细胞（BNC）的鉴定与评分。（A）选择具有两个明显细胞核的细胞。（B）利用“长宽比强度”（Aspect Ratio Intensity）功能，鉴定具有两个高度圆形细胞核的双核细胞（BNC）。（C）筛选两个细胞核面积和强度相似的双核细胞（BNC）。该过程通过计算两个细胞核的面积比值及其长宽比的比值来实现。（D）利用“形状比”（Shape Ratio）和“长宽比”（Aspect Ratio）特征，识别两个细胞核分离良好的双核细胞（BNC）。（E）使用“斑点计数”（Spot Count）功能，结合微核（MN）掩膜，显示可识别并计数含单个或多个微核的双核细胞（BNC）。请点击此处查看该图的放大版本。

多核细胞成像；荧光显微镜；荧光点计数图；细胞分析方法。
图 4：单核与多核细胞的识别与计分。利用荧光点计数功能识别并计数单核、三核及四核细胞。组分掩模1可用于识别单核细胞（上图）。组分掩模1至3可用于识别三核细胞（中图）。组分掩模1至4可用于识别四核细胞（下图）。该图已根据Rodrigues 201832修改。 请点击此处查看该图的放大版本。

微核细胞与细胞毒性的比较；剂量-反应曲线；秋水仙素、丝裂霉素C、甘露醇处理。
图5：细胞毒性的定量分析。 使用细胞分裂阻断增殖指数（黑色圆圈）定量细胞毒性，使用微核百分率（空白柱状图）定量遗传毒性，处理时间为3小时，恢复时间为24小时，分别针对（A）秋水仙素、（B）丝裂霉素C和（C）甘露醇。与对照组相比，微核频率具有统计学显著性增加的结果以星号表示（卡方检验；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。每个剂量点的数据均为两次重复实验的平均值。本图改编自Rodrigues 201832。请点击此处查看该图的放大版本。

秋水仙碱对细胞培养物的细胞毒性和遗传毒性数据表，显示剂量依赖性效应。
表 1： 计算秋水仙碱细胞毒性（单核、双核和多核细胞数量）和遗传毒性（含微核的双核细胞数量及百分比）所需的参数。所有计算值均为每个剂量点两个重复实验的平均值。

丝裂霉素C细胞毒性、遗传毒性表；对细胞计数和微核的剂量依赖性效应
表2： T计算丝裂霉素C的细胞毒性（单核、双核及多核细胞数量）和遗传毒性（双核微核细胞的数量和百分比）所需的参数。 所有计算量均为每个剂量点两个重复样本的平均值。

甘露醇细胞毒性、遗传毒性表格：剂量反应、细胞计数、统计学显著性（细胞毒性）
表 3： 计算甘露醇细胞毒性（单核、双核及多核细胞数量）和遗传毒性（含微核的双核细胞数量及百分比）所需的参数。 所有计算数值均为每个剂量点两个重复样本的平均值。

补充文件 1：完整方案。 请点击此处下载该文件。

补充资料 2：掩膜列表。 请点击此处下载该文件。

讨论

在最近的一项研究中，Verma 等人强调了开发一种将流式细胞术的高通量优势与图像分析的数据和图像存储优势相结合的系统的重要性35。本文所述的体外 MIFC 微核（MN）检测方法满足了这一要求，有望克服显微镜和流式细胞术方法中存在的诸多前述挑战。此处描述的 方案表明，可利用 MIFC 同时评估细胞毒性和遗传毒性。样品制备、细胞染色和数据采集过程简便，但方案中存在若干关键步骤必须始终严格执行。向细胞中加入氯化钾（KCl）至关重要，其作用是使细胞膨胀，从而在主核之间产生分离。这确保了掩膜算法能够识别双核细胞（BNCs）和多核细胞（POLY cells）中的所有单个细胞核，这是准确计数这些细胞所必需的。此外，KCl 还能实现细胞核与微核（MN）之间的分离，这对于微核的精确掩膜和定量至关重要。另外，在加入 KCl 后使用甲醛可防止细胞在离心过程中发生裂解。加入细胞松弛素 B 会导致经历了一次以上核分裂的 TK6 细胞体积显著增大。因此，细胞质变得脆弱，若在加入 KCl 后立即进行离心，可能导致细胞裂解。此外，非常重要的一点是，应根据样品中的细胞数量而非终浓度来加入 Hoechst 染料。例如，10 µg/mL 的终浓度可均匀染色 1 × 106 个细胞的样品，但可能无法充分染色含有 5 × 106 个细胞的样品，导致大量细胞核染色过浅，从而增加分析难度。还需注意的是，如果 MIFC 配备了 405 nm 激发激光，Hoechst 可替换为另一种 DNA 染料如 DAPI；若 MIFC 配备了 488 nm 和/或 642 nm 激发激光，则可替换为 DRAQ5。若更换细胞核染料，必须对染料进行滴定，以确定在所需/期望激光功率下的合适浓度。

在MIFC上采集数据时，确定梯度RMS特征的最佳区域边界至关重要。由于不同MIFC仪器之间可能存在细微差异，本方案中提供的边界可能需要进行调整。在数据采集过程中应用该特征对于确保捕获高度聚焦的图像十分关键。如果数据文件中包含大量模糊或失焦图像，分析软件中的掩膜算法很可能会错误地将模糊区域中的染色伪影突出显示，导致大量假阳性伪影被计为微核（MN）。尽管此处描述的图像处理技术可能具有一定难度，但一旦在MIFC软件中建立分析模板，即可通过批量处理自动分析数据文件，无需人工干预，从而避免评分者偏差。此外，若使用TK6细胞以外的其他细胞系进行该检测，则需要调整掩膜和区域边界，因为不同细胞的形态学特性（如大小）与TK6细胞存在差异。

本文展示的结果（图5）表明，在将TK6细胞暴露于不同剂量的丝裂霉素C和秋水仙素时，微核诱导率呈现具有统计学意义的升高。与溶剂对照组相比，这两种化学物质的多个剂量组均观察到微核频率的统计学显著增加。此外，如预期所示，甘露醇的任何剂量均未引起超过30%的细胞毒性，也未导致微核频率相对于溶剂对照组出现统计学显著升高。本文所述利用MIFC进行体外微核试验的方案，对阳性与阴性对照化学物质均获得了预期的结果。开展多项实验，使用溶剂对照和阴性对照化学物质建立微核频率以及细胞分裂阻滞增殖指数（CBPI）的基础值基准，是非常重要的。对于遗传毒性评估，微核频率的统计学显著升高是通过与已知的、针对所用细胞类型的基础微核频率进行比较来确定的。此外，所有细胞毒性计算均基于对照样本的CBPI，因此必须在对照组中准确量化单核细胞、双核细胞和多核细胞的基础比率。

先前的研究已描述了在微核（MN）检测中使用MIFC的一些局限性和优势29,32。主要局限性在于，与显微镜技术相比，MIFC检测到的微核频率较低，这可能源于分析软件中评分标准灵活性不足，以及MIFC景深有限。虽然可以创建轮廓清晰的掩模以准确识别主核，但与主核接触（或非常接近）的微核可能被包含在BNC掩模内而被误判。此外，显微镜下较易识别的非常小的微核，由于MIFC中微核掩模面积参数存在下限设置（以避免将微小伪影误判为微核），很可能被错误地遗漏。除了图像数据分析本身存在的困难外，由于MIFC的设计原理，其获取的是三维细胞结构的二维投影图像。这可能导致部分微核处于与两个主核不同的焦平面，使其成像非常暗淡而无法评分。此外，少量微核可能位于两个主核之一的后方，导致无法被观察和评分。因此，考虑到这些技术困难，在解释低剂量下微核频率显著增加的结果时应保持谨慎。

尽管存在这些不足，本文所述的MIFC方法相较于其他技术仍具有多项优势。Fenech等人提出了在开发用于微核（MN）检测的自动化系统和方法时应考虑的标准和指南36，包括但不限于：能够直接可视化主核和细胞质，确定受试化学物质或试剂在不同剂量下诱导的微核频率，以及能够定量分析细胞形态并确定所有主核和微核的位置，以确保其位于细胞质内。本文表明，所开发的用于体外微核试验的MIFC方法满足（或具备满足）上述标准的潜力。具体而言，可通过荧光激光捕获细胞核和微核的图像，而细胞质图像则可通过明场（BF）LED获得。利用先进的掩模和特征组合，可自动区分具有正常核形态的细胞与具有异常形态的细胞。Colchicine和Mitomycin C的实验结果（图5）显示，与溶剂对照组相比，可在多个剂量下同时评估遗传毒性和细胞毒性，并在预期情况下观察到具有统计学意义的微核频率。此外，OECD试验指南487建议，为评估遗传毒性，每个测试浓度应计数2,000个双核细胞（BNCs）；为评估细胞毒性，每个测试浓度至少应计数500个细胞9；而采用人工显微镜计数通常耗时超过1小时。本文所述方案及结果表明，在约20分钟内，每个测试浓度平均可捕获并分析约6,000个双核细胞、16,000个单核细胞（MONO）和800个多核细胞（POLY）。在如此短时间内实现高速数据采集和大量候选细胞的分析，凸显了采用MIFC进行体外微核试验的另一项重要优势。

尽管本文所展示的结果令人鼓舞，但其仅代表一种早期概念验证方法。后续应开展更系统的研究，采用更大、更多样化的化合物集，涵盖多种遗传毒性和细胞毒性类别及作用机制，例如Kirkland等人37 所建议的化合物集。此类研究耗时较长且劳动强度大，超出了本文的范围，但更大规模的研究将有助于深入评估该方法可靠识别弱遗传毒性物质的能力。本文所提出的方法尚未微型化为微孔板格式，而微型化将有助于在更宽剂量范围内实现更快速、高效的筛选。因此，目前基于MIFC的体外微核试验可能更适用于劳动密集型的后续研究或良好实验室规范的相关研究。然而，该方法将持续优化和验证，并具备进一步提升检测化学物质特异性形态学事件灵活性的潜力，例如检测暴露于非整倍体诱导剂后，仍可计分但核形态非圆形的细胞比例增加的现象38。最后，MIFC方法还为微核试验引入额外的生物标志物（如着丝粒染色）提供了可能，从而更全面地揭示微核诱导的机制。

披露

作者受雇于Luminex Corporation，该公司是本研究所使用的ImageStream多光谱成像流式细胞仪的制造商。

致谢

作者感谢Christine Probst（Luminex Corporation）在开发早期版本数据分析模板过程中所做的工作，同时感谢Haley Pugsley博士（Luminex Corporation）和Phil Morrissey博士（Luminex Corporation）对稿件的审阅与编辑。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 离心管Falcon352096
清洁剂 - Coulter Clenz Beckman Coulter8546931向容器中加入200 mL清洁剂。  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
秋水仙碱MilliporeSigma64-86-8
康宁瓶顶式真空过滤器 MilliporeSigmaCLS4307690.22 微米滤器，500 毫升瓶
细胞松弛素BMilliporeSigma14930-96-25 mg 瓶装
除泡器 - 70% 异丙醇EMD Millipore1.3704向容器中加入200 mL除泡剂。  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-丙醇-70%（V/V）-0.1-µm过滤,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
二甲基亚砜（DMSO）MilliporeSigma67-68-5
杜氏磷酸盐缓冲液 1XEMD MilliporeBSS-1006-BPBS 无钙镁 
胎牛血清HyCloneSH30071.03
甲醛，10%，无甲醇，超纯Polysciences, Inc.04018此溶液用于配制4%和1%的福尔马林。注意：福尔马林/甲醛吸入或吞咽后有毒。  对眼睛、呼吸系统和皮肤有刺激性。  吸入或皮肤接触可能引起过敏反应。对眼睛有严重损伤风险。  潜在致癌风险。  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Hoechst 33342赛默飞世尔科技H357010 mg/mL 溶液
甘露醇MilliporeSigma69-65-8
MEM 非必需氨基酸 100XHyCloneSH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark IIEMD Millipore100220采用配备405 nm、488 nm和642 nm激光器的两相机ImageStreamX Mark II系统。http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006
MIFC 分析软件 - IDEASEMD Millipore100220MIFC（ImageStreamX MKII）的配套软件
MIFC 软件 - INSPIREEMD Millipore100220这是运行MIFC（ImageStreamX MKII）的软件
丝裂霉素CMilliporeSigma50-07-7
NEAA混合液 100XLonza BioWhittaker13-114E
青霉素/链霉素/谷氨酰胺溶液 100XGibco15070063
氯化钾（KCl）MilliporeSigmaP9541
冲洗——超纯水或去离子水NANA可使用任何超纯水或去离子水。  向容器中加入 900 mL 冲洗液。
RNaseMilliporeSigma9001-99-4
RPMI-1640 培养基 1XHyCloneSH30027.01
鞘液 - PBSEMD MilliporeBSS-1006-B这与1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液相同  无 Ca²⁺ 和 Mg²⁺  向容器中加入 900 mL 鞘液。
无菌水HyCloneSH30529.01
灭菌器 - 0.4-0.7% 次氯酸盐VWRJT9416-1这实际上是通过将 Clorox 漂白剂与水混合稀释制成的 10% Clorox 漂白液。  向容器中加入200 mL的Sterilzer。
系统校准试剂 - SpeedBeadEMD Millipore400041每支试管可容纳约 10 mL。  https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav 
T25 培养瓶Falcon353109
T75 培养瓶Falcon353136
TK6细胞MilliporeSigma95111735

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