本文介绍了一种评估红光照射对Candida albicans生物膜生长影响的实验方案。在整个Candida albicans生物膜生长过程中，使用波长为635 nm、能量密度为87.6 J·cm-2的非相干红光照射48小时。
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摘要
摘要
本文介绍了一种评估每日两次红光照射对Candida albicans生物膜生长影响的实验方案。为促进C. albicans SN425的浮游生长，将接种物培养于酵母氮源基础培养基中。在生物膜形成过程中，采用富含氨基酸的RPMI 1640培养基以促进生物膜生长。对培养48小时的生物膜，使用非相干光源设备（红光；波长 = 635 nm；能量密度 = 87.6 J·cm-2）每天处理两次，每次1分钟。以0.12%氯己定（CHX）作为阳性对照（PC），0.89% NaCl作为阴性对照（NC）分别作用于生物膜。处理后，定量检测菌落形成单位（CFU）、干重、可溶性及不溶性胞外多糖含量。简而言之，本方案操作简便、可重复性强，能够有效评估红光处理后生物膜的存活率、干重及胞外多糖含量。
引言
近年来，糖尿病发病率上升、免疫抑制疗法的应用、HIV感染、艾滋病流行、侵入性临床操作以及广谱抗生素的使用，导致了与Candida albicans相关的疾病发病率增加1,2。C. albicans感染通常与生物膜的形成有关，可能引起临床表现如念珠菌病，或系统性表现如念珠菌血症1,2。生物膜生长中最值得注意的毒力因子之一是胞外多糖基质的形成。生物膜的形成有助于增强对现有抗真菌药物、环境压力以及宿主免疫机制的抵抗能力3。
C. albicans 的生物膜生长始于浮游细胞对基质的初始黏附，随后酵母细胞在基质表面增殖并形成菌丝。生物膜生长的最后阶段为成熟阶段，此阶段中酵母样发育受到抑制，菌丝发育进一步扩展，且胞外基质包裹整个生物膜4。基质中的 C. albicans 胞外多糖（EPS）相互作用形成甘露聚糖-葡聚糖复合物5,6。胞外多糖之间的相互作用对于生物膜抵御药物具有关键作用7。因此，减少 C. albicans 胞外基质中的 EPS 可能有助于开发新的抗生物膜策略，以控制口腔念珠菌病。
光调控多种生物的生长、发育和行为8，并已被应用于光动力抗菌化学疗法（PACT）中作为抗菌手段。PACT利用特定波长的可见光和可吸收光的光敏剂9。然而，光敏剂难以穿透生物膜，导致其抗菌效果降低10。治疗药物无法充分渗入生物膜，是生物膜对传统抗菌治疗产生抵抗的原因之一3,5。为了灭活被包裹的微生物细胞，抗菌剂必须穿透胞外基质；然而，胞外多糖（EPS）会通过促进抗菌分子在生物膜内的滞留水平或影响抗菌剂与基质本身的相互作用，形成扩散障碍，阻碍这些分子的渗透11。
鉴于PACT的缺点，单独使用光疗法成为一种有价值的改进。初步数据显示，每天两次的蓝光处理显著抑制了Streptococcus mutans生物膜中不溶性胞外多糖（EPS-insoluble）的产生。通过减少不溶性胞外多糖，蓝光抑制了生物膜的生长。然而，红光光疗对C. albicans生物膜作用的研究结果尚少。因此，本研究的目的是评估红光光疗对C. albicans生物膜生长和结构的影响方式。对于每日两次的处理，我们调整了实验室先前的方案9,12，以建立一种简便且可重复的生物膜模型，可在红光处理后提供关于生物膜活性、干重及胞外多糖含量的可靠结果。该相同方案也可用于测试其他治疗方法。
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方案
1. 培养基的制备
- 制备沙氏葡萄糖琼脂（SDA）。将65 g SDA加入1,000 mL蒸馏水中，并添加氯霉素（50 mg/L）。加热煮沸以完全溶解培养基。在15 psi（121°C）条件下高压灭菌30分钟。冷却至45–50 °C。充分混匀后，将20 mL SDA倒入无菌培养皿（规格：100 mm × 15 mm）中。
- 通过将6.7 g酵母氮源基础（YNB）和18 g葡萄糖溶于1,000 mL超纯水中，配制含100 mM葡萄糖的YNB培养基。使用搅拌器混匀，并采用0.22 µm真空过滤系统对培养基进行灭菌。
- 将10.4 g RPMI 1640和34.32 g 3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）溶于1,000 mL超纯水中，配制RPMI培养基。使用搅拌器在不加热条件下混匀，并通过加入1 N NaOH调节pH至7（将2 g NaOH溶于50 mL超纯水中）。使用0.22 µm真空过滤系统对培养基进行灭菌。
2. 预接种物与接种物
- 去除微生物 C. albicans 从−80 °C冰箱中取出SN425，置于室温下解冻。取10 µL菌种接种于含氯霉素（50 mg/L）的SDA平板上。将平板在37 °C有氧条件下培养48 h。
- 孵育48小时后，加入10个菌落 C. albicans 加入100 mM葡萄糖的10 mL酵母氮源基础（YNB）培养基中，37 °C有氧条件下培养16小时，用于制备预接种液。
- 孵育16小时后，将起始培养物按1:10比例（1 mL起始培养物加入9 mL YNB培养基）稀释至含100 mM葡萄糖的新鲜YNB培养基中，制备接种液。在540 nm处测定初始光密度（OD）。
- 在37 °C下有氧培养接种物8小时，直至菌株达到对数生长中期，于540 nm处测定最终OD值。用最终OD值减去初始OD值，以确认接种物是否处于对数生长中期（8小时，依据生长曲线确定）。 图1).
- 以获得含有10的接种物7 细胞 mL-1，将接种物在5,500 x g下离心5分钟 g弃去上清液，并将接种物浓缩至试管体积的一半。
3. 生物膜形成与光疗
- 向24孔聚苯乙烯板的孔中加入1 mL接种物。在37 °C下有氧培养90分钟，使细胞贴附于孔底。
- 使用非相干红光（见材料表）作为光源，波长为635 ± 10 nm，固定输出功率为1,460 mW cm−2。
- 使用功率计测量光的功率密度。所施加的辐射剂量为87.6 J cm-2，相当于约1分钟的照射时间。使用公式：能量密度（J/cm2）= 功率密度（W/cm2）× 照射时间（s）。光源与生物膜之间保持5 mm的距离，以避免样品受热。
- 用0.12%氯己定处理阳性对照生物膜1分钟，用0.89% NaCl处理阴性对照生物膜1分钟。
- 处理后，用0.89% NaCl溶液将所有生物膜清洗两次。
- 向生物膜中加入1 mL用3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）缓冲的RPMI 1640培养基（pH 7），并将培养板在37 °C下过夜培养。
- 次日早晨，重复步骤3.2至3.6的操作，用0.89% NaCl清洗生物膜两次，向各孔中加入新的MOPS缓冲RPMI培养基（1 mL，pH 7），并在37 °C下有氧培养。
- 同一天，在6小时后，将生物膜暴露于红光。用0.12%氯己定处理阳性对照生物膜1分钟，用0.89% NaCl处理阴性对照生物膜1分钟。处理后 ，用0.89% NaCl溶液将生物膜清洗两次。
- 重复步骤3.2至3.8，直至完成48小时的生物膜培养。
注：基本上，每天进行两次处理，一次在早晨，一次在下午，间隔6小时。
4. 处理
- 用移液器枪头刮取生物膜，向孔中加入 1 mL 无菌 0.89% NaCl 以去除生物膜。将去除的生物膜加入无菌离心管中。
- 向孔中再加入 1 mL 无菌 0.89% NaCl，再次刮取，并将悬液加入同一离心管中，总体积为 2 mL。
- 菌落形成单位（CFU）
- 剧烈涡旋生物膜悬液 1 分钟。从生物膜悬液中取 0.1 mL 用于系列稀释。
- 用 0.89% NaCl 溶液将生物膜悬液从 10-1 稀释至 10-4。
- 将每种稀释液各 50 μL 接种至 SDA 平板，于 37 °C 培养 48 小时。
- 计数菌落，并应用公式 CFU/mL = 菌落数 × 10n / q（n = 稀释倍数；q = 接种体积）。
- 干重
- 称重并标记微量离心管。
- 从生物膜悬液中取 0.1 mL 用于干重（生物量）测定。
- 向 0.1 mL 生物膜样品中加入 1 mL 无水乙醇，于 -20 °C 保存 18 小时。18 小时后，在 10,000 × g 条件下离心 10 分钟。
- 弃去上清液，将离心管置于干燥器中干燥样品一周 ，再次称量微量离心管。
- 水溶性多糖（WSPs）和碱溶性多糖（ASPs）
- 将剩余体积（1.8 mL）的生物膜悬液剧烈涡旋 1 分钟，于 4 °C 条件下以 5,500 × g 离心 10 分钟。将上清液储存于新离心管中，并用无菌超纯水洗涤沉淀物两次（含细胞，包含胞外基质的不溶性组分），每次洗涤条件为 5,500 × g、4 °C 离心 10 分钟。
- 将不溶性组分重新悬浮于 1.8 mL 无菌超纯水中。
- 水溶性多糖（WSPs）
注：本实验应在通风橱中进行。- 从储存的上清液中保留 1 mL 用于水溶性多糖（WSPs）的定量分析。
- 将储存的上清液均质化 1 分钟，然后转移至无菌离心管中，并加入 2.5 倍体积的 95% 乙醇。将离心管于 -20 °C 保存 18 小时，以沉淀 WSPs。
- 18 小时后，在 4 °C 条件下以 9,500 × g 离心 20 分钟。离心后弃去上清液。
- 用 75% 乙醇洗涤样品三次，风干沉淀物。将沉淀物重新悬浮于 1 mL 无菌超纯水中，并采用苯酚-硫酸法测定 WSP 含量。
- 使用 0.1% 葡萄糖（将 0.01 g 葡萄糖溶于 10 mL 超纯水中）制作标准曲线（每管分别加入 0、2.5、5、10、15、20 和 25 µL 葡萄糖）。
- 向含有 200 µL 样品或标准曲线点（每个样品设三个重复）的玻璃试管中加入 200 µL 5% 苯酚（将 2.7 mL 90% 苯酚与 47.3 mL 超纯水混合），小心混匀。
- 向试管中加入 1 mL 硫酸并混匀。反应 20 分钟后，使用分光光度计在 490 nm 波长下测定样品吸光度。
- 碱溶性多糖（ASPs）
注：本实验应在通风橱中进行。- 从重新悬浮的不溶性组分中取 1 mL 用于 ASPs 的测定。将各生物膜悬液的等分试样在 4 °C 条件下以 13,000 × g 离心 10 分钟。
- 小心移除每管的上清液，然后将样品置于真空浓缩仪中干燥沉淀物。
- 称量沉淀物，并按每 1 mg 干重加入 300 µL 1 N NaOH（将 2 g NaOH 溶于 50 mL 超纯水中）。于 37 °C 孵育 2 小时，然后以 13,000 × g 离心 10 分钟。
- 用移液器小心收集上清液，并转移至微量离心管中，保留沉淀物。
- 再次向含有沉淀物的离心管中加入等体积的 1 N NaOH，并重复上述步骤进行 ASP 提取。
- 孵育 2 小时后，将样品以 13,000 × g 离心 10 分钟，小心收集上清液，并与先前收集的上清液合并。
- 进行第三次提取时，重复上述相同步骤，但此次在离心前不再孵育 2 小时。
- 之后，向每个样品中加入三倍体积的 95% 乙醇，然后于 −20 °C 保存 18 小时，以沉淀 ASP。
- 将离心管在 4 °C 条件下以 9,500 × g 离心 20 分钟，并弃去上清液。
- 用 75% 乙醇洗涤每个沉淀物三次，并风干（操作步骤同 WSP 测定）。将沉淀物重新悬浮于与第一次提取相等的总体积的 1 N NaOH 中。
- 使用苯酚-硫酸法测定样品吸光度以定量 ASP（方法同 WSP 分析）。
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结果
图2 展示Log的结果10 CFU/mL C. albicans 经红光每日治疗1分钟后，红光显著降低了Log10 CFU/mL，与NC相比（p = 0.004）。 图3 呈现生物量（mg）的结果 C. albicans 每日处理后的生物膜。所有处理组的生物量均较阴性对照组（NC）显著减少（p = 0.000），而红光处理组的生物量减少程度与阳性对照组（PC）相当。 图4 和 图5 显示较低的量 C. albicans PC中可溶性EPS和不可溶性EPS与NC相比（p = 0.000）。尽管无统计学显著性，每日应用红光照射1分钟 C. albicans 生物膜在数量上减少了可溶性EPS和不溶性EPS的含量。
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讨论
成功培养 C. albicans 生物膜最关键的步骤包括：1）使用添加了 100 mM 葡萄糖的 YNB 培养基进行预接种和正式接种；2）静置 90 分钟以完成黏附阶段，随后用 0.89% NaCl 轻柔洗涤孔板两次，以去除未黏附的细胞；3）向已黏附的细胞中加入 RPMI 培养基以启动生物膜形成，因为 RPMI 可促进菌丝生长。 在培养 C. albicans 时可能发生非整倍体现象。因此，应避免使用超过七天的菌落，避免将平板储存在 4°C 环境中，且不应从已有平板上重新划线接种。同样，菌株应在过夜培养不超过 18 小时时使用13。
研究的局限性在于其为体外实验。尽管体外研究极大地增进了对生物膜生物学的理解，但其并不能精确模拟体内环境条件14然而，体外实验不仅成本低廉、方法简便，还能提供高通量筛选14 以回答有关新型抗生物膜疗法的问题。为生物膜发育的每个阶段选择合适的培养基是该方法成功...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Paula da Silveira 博士、Cecília Atem Gonçalves de Araújo Costa 博士、Shawn M. Maule、Shane M. Maule、Malvin N. Janal 博士和 Iriana Zanin 博士为本研究的开展所做出的贡献。我们还感谢 Alexander D. Johnson 博士（加州大学旧金山分校）捐赠了本研究中分析的菌株。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 20% 氯己定 | Sigma-Aldrich | C9394 | |
| 无水葡萄糖（D-葡萄糖） | Fisher Chemical | D16-500 | |
| 200 证明乙醇 | Decon Laboratories | DSP-MD.43 | |
| LumaCare LC-122 A | LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA | ||
| NaCl | Fisher Chemical | S641-500 | |
| NaOH | Fisher Bioreagents | BP 359-500 | |
| 5% 苯酚 | Milipore Sigma | 843984 | |
| 用 3-(N-吗啉代)缓冲的 RPMI 1640 | Sigma | R7755 | |
| 添加氯霉素的沙氏葡萄糖琼脂 | Acumedia | 7306A | |
| 硫酸 | Fisher Chemical | SA200-1 | |
| 酵母氮碱 | Difco | DF0392-15-9 | |
| 3-(N-吗啉代)丙磺酸 MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| 24 孔聚苯乙烯板 | Falcon | 353935 |
参考文献
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