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通过Rev免疫共沉淀与质谱技术鉴定HIV-1复制过程中的核仁因子

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DOI：

10.3791/59329

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2019年6月26日

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1Molecular and Cellular Biology Department, Beckman Research Institute at the City of Hope, 2Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences, 3Department of Molecular Immunology, Beckman Research Institute and the City of Hope

本文内容

摘要

本文介绍了在HIV-1复制存在的情况下进行Rev蛋白免疫沉淀以用于质谱分析的方法。所述方法可用于鉴定参与HIV-1感染周期的核仁因子，并适用于其他疾病模型中对尚未充分研究的通路进行表征。

摘要

HIV-1 感染周期需要病毒蛋白与宿主因子相互作用，以促进病毒复制、组装和释放。该感染周期还需要形成病毒/宿主蛋白与 HIV-1 RNA 的复合物，以调控剪接并实现核质运输。HIV-1 Rev 蛋白通过与内含子中的顺式作用靶点——Rev 反应元件（RRE）——发生多聚化，介导 HIV-1 mRNA 的核输出。在 Rev 富含精氨酸基序（ARM）的 COOH 末端存在一个核仁定位信号（NoLS），可促使 Rev/RRE 复合物在核仁中聚集。据推测，核仁因子除了介导不依赖 mRNA 的核输出和剪接外，还通过其他多种功能支持 HIV-1 感染周期。本文描述了一种在 HIV-1 复制条件下，通过质谱分析对野生型（WT）Rev 与 Rev 核仁突变体（包括缺失突变和单点 Rev-NoLS 突变）进行免疫共沉淀的方法。结果显示，在 Rev-NoLS 突变存在的情况下，参与核质运输的核仁因子（如核磷蛋白 B23 和核仁素 C23）以及细胞剪接因子均丧失了与 Rev 的相互作用。其他多种核仁因子（如 snoRNA C/D box 58）也被发现与 Rev 突变体失去相互作用，但其在 HIV-1 复制周期中的功能尚不清楚。本文结果展示了该方法在鉴定维持 HIV-1 感染周期的病毒/宿主核仁因子方面的应用价值。该策略所采用的概念同样适用于其他需要表征尚未充分研究通路的病毒和疾病模型。 顺式-作用靶点——Rev反应元件（RRE）。在Rev富含精氨酸基序（ARM）的COOH末端存在一个核仁定位信号（NoLS），可介导Rev/RRE复合物在核仁中的积累。除介导不依赖mRNA的核输出和剪接外，核仁因子还可能通过其他多种功能支持HIV-1感染周期。本文描述了一种免疫共沉淀方法，用于在HIV-1复制存在条件下，对野生型（WT）Rev与Rev核仁突变体（包括缺失突变和单点Rev-NoLS突变）进行比较，并结合质谱分析。在Rev-NoLS突变存在时，参与核质运输的核仁因子（如核磷蛋白B23和核仁素C23）以及细胞剪接因子均丧失与Rev的相互作用。其他多种核仁因子（如snoRNA C/D box 58）也被发现与Rev突变体的相互作用减弱，但其在HIV-1复制周期中的功能仍不明确。本文结果展示了该方法在鉴定维持HIV-1感染周期的病毒/宿主核仁因子方面的应用价值。该方法所采用的概念同样适用于其他需要表征尚未充分研究通路的病毒及疾病模型。

引言

核仁被认为是多种细胞宿主因子与病毒因子相互作用的场所，这些因子对病毒复制至关重要。核仁是一种复杂的结构，可分为三个不同的区室：纤维区、致密纤维组分区和颗粒区。HIV-1 Rev蛋白特异性定位于颗粒区，但这种定位模式的原因尚不清楚。当NoLS序列中存在单点突变（Rev突变4、5和6）时，Rev仍保持核仁定位模式，并且先前研究已表明其可恢复HIV-1HXB2的复制能力，但效率低于野生型Rev1。所有单点突变均无法维持HIV-1NL4-3 的感染周期。当NoLS序列中存在多个单点突变（Rev-NoLS突变2和9）时，Rev被观察到在细胞核和细胞质中弥散分布，且无法恢复HIV-1HXB2的复制1。本项蛋白质组学研究的目标是解析参与Rev介导的HIV-1感染通路的核仁及非核仁细胞因子。通过Rev与核仁磷酸蛋白B23的相互作用来优化Rev免疫沉淀条件，此前研究表明，在存在核仁突变的情况下，B23与Rev的相互作用会丧失。

Rev 的细胞因子在以往已被广泛研究；然而，这些研究均未在病毒致病背景下进行。本研究在 HIV-1 复制过程中通过 Rev 相互作用所表征的一个特定蛋白是核仁磷酸蛋白 B23——在两栖动物中也称为核仁素（nucleophosmin, NPM）、numatrin 或 NO382....

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方案

1. 细胞培养

  1. 在添加了10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺和1 mM丙酮酸钠的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HLfB细胞，使用经组织培养处理的100 mm培养皿。将细胞培养物置于37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中。当细胞融合时，传代至细胞密度为1 x 106 个细胞/mL。
  2. 弃去细胞培养基。用10 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗细胞。移除并弃去1× PBS，注意不要破坏细胞层。
  3. 向细胞中加入2 mL 1×胰蛋白酶-EDTA溶液。轻轻晃动培养皿使溶液覆盖单层细胞，并在37 °C湿化环境中孵育5分钟。
  4. 用手掌用力轻拍培养皿侧面以使细胞脱落。将脱落的细胞重悬于8 mL新鲜培养基中。在400 × g 条件下离心5分钟。
  5. 弃去培养基，注意不要破坏细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于10 mL新鲜培养基中。取1 mL浓缩细胞与9 mL新鲜培养基混合，接种至经组织培养处理的100 mm培养皿中进行传代培养。
    注意：针对每种Rev-NoLS突变，3个100 mm的HLfB或HeLa细胞培养皿可提供足量蛋白裂解液用于蛋白质印迹分析和质谱检测。额外增加培养皿用于设置野生型Rev阳性对照和阴性对照。若使用不同类型的细胞，传代时的细胞体积需进行优化。

2. HIV-1 复制过程中 ....

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结果

Rev-NoLS 的单点和多点精氨酸突变（对应多种亚细胞定位模式）被用于检测其与细胞宿主因子相互作用的能力，并与野生型（WT）Rev 进行比较。在 HLfB 培养物中表达 WT Rev-3'flag 和 pcDNA-flag 载体。从全细胞裂解液中提取蛋白复合物，并用银染试剂染色。图1显示，在含有不同浓度 NaCl（137 mM、200 mM 和 300 mM）的三种不同裂解缓冲液条件下，均可检测到 Rev-NoLS-3'flag（约 18 kDa）。核仁磷酸蛋白 B23（37 kDa）在低盐浓度（137 mM，第 2–4 泳道）的裂解缓冲液中可被检测到，在含 200 mM NaCl 的缓冲液中几乎不可见，在高盐浓度（300 mM NaCl）的缓冲液中则无法检测。在图2中，于 HLfB 培养物中表达了 WT Rev-3'flag、Rev-NoLS M1-3'flag 和 pcDNA-flag 载体。蛋白复合物来源于两种裂解缓冲液条件（137 mM 和 200 mM NaCl）制备的全.......

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讨论

通过质谱分析比较在 HIV-1 存在条件下 Rev-NoLS 突变体与野生型（WT）Rev，以了解参与病毒复制周期的核仁因子。该方法可鉴定病毒传染性所必需的核仁组分。核仁蛋白 B23 对 Rev-NoLS 具有高亲和力，并参与 Rev 的核仁定位3以及 Rev 结合的 HIV mRNA 的核质运输22。通过在病毒产生过程中对 Rev-3'flag 进行免疫沉淀，评估了 B23 与包含单个或多个精氨酸替换的 Rev-NoLS 突变体之间的亲和力（图 2；WT 及突变体 M2、M6 和 M9）。此前已在 HIV-1 复制背景下研究过 B23 与单点 Rev-NoLS 突变体 M4、M5 和 M6 的亲和力。在先前的研究中，M4、M5 和 M6 的免疫沉淀洗脱物经抗 α-flag 抗体进行 Western 免疫印迹分析，以检测 Rev 和 B23 的亲和性1。在 Rev 单点突变背景下，B23 的结合亲和力显著降低。而在 HIV 复制过程中，.......

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢美国国立卫生研究院（NIH）艾滋病研究与参考试剂项目、美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）艾滋病司提供的HLfB贴壁培养物，该培养物由Barbara K. Felber博士和George N. Pavlakis博士提供。作者同时感谢NIH资助项目AI042552和AI029329提供的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酸Fisher ChemicalA38S-212
乙腈Fisher ChemicalA955-500
丙烯酰胺:双丙烯酰胺BioRad1610158
碳酸氢铵Fisher ChemicalA643-500
过硫酸铵Sigma-Aldrich7727-54-0
ANTI-Flag M2 亲和凝胶Sigma-AldrichA2220
抗 Flag M2 小鼠单克隆 IgGSigma-AldrichF3165
BioMax MS 胶片Carestream8294985
Bio-Rad 蛋白检测试剂浓缩液，450 mLBio-Rad5000006
B23 小鼠单克隆 IgGSanta Cruz Biotechnologiessc-47725
溴酚蓝Sigma-AldrichB0126
雀巢脱脂奶粉NestleN/A
细胞刮刀ThermoFisher Scientific179693PK
C18IonKey nanoTile 色谱柱Waters186003763
Corning 100 mm 经组织培养处理的培养皿Fisher Scientific08-772-22
二硫苏糖醇Thermo ScientificJ1539714
1 × DPBSCorning21-030-CVRS
ECL 化学发光 Western 印迹底物Pierce32106
乙醇，200 证明Fisher ChemicalA409-4
FBSGibco16000044
甲酸Fisher ChemicalA117-50
GelCode 蓝色染色试剂ThermoFisher24590
甘油Fisher Chemical56-81-5
山羊抗小鼠 IgG-HRPSanta Cruz Biotechnologiessc-2005
碘乙酰胺ACROS Organics122270050
KimWipe 精细擦拭纸Kimberly Clark Professional34120
L-谷氨酰胺Gibco25030081
甲醇Fisher Chemical67-56-1
NanoAcuity UPLCWatersN/A
Pierce 银染试剂盒Thermo Scientific24600df
15 mL 聚丙烯圆锥形离心管Falcon352097
预染蛋白质标准品，10 至 180 kDaThermo Scientific26616
蛋白酶抑制剂混合物Roche4693132001
纯化 BSANew England BiolabsB9001
PVDF  Western 印迹膜Roche3010040001
丙酮酸钠Gibco11360070
10 × TBSFisher BioreagentsBP2471500
TEMEDBioRad1610880edu
Triton X-100 去垢剂溶液BioRad1610407
Trizaic 源WatersN/A
胰蛋白酶-EDTACorning25-051-CIS
Tween 20BioRad1706531
Synapt G2 质谱仪WatersN/A
Whatman 滤纸Tisch Scientific10427813

参考文献

  1. Arizala, J. A. C., et al. Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2018).
  2. Li, Y. P.

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HIV 1 Rev Rev NoLS B23 C23 snoRNA C D 58

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