通过Rev免疫共沉淀与质谱技术鉴定HIV-1复制过程中的核仁因子

摘要

本文介绍了在HIV-1复制存在的情况下进行Rev蛋白免疫沉淀以用于质谱分析的方法。所述方法可用于鉴定参与HIV-1感染周期的核仁因子，并适用于其他疾病模型中对尚未充分研究的通路进行表征。

摘要

HIV-1 感染周期需要病毒蛋白与宿主因子相互作用，以促进病毒复制、组装和释放。该感染周期还需要形成病毒/宿主蛋白与 HIV-1 RNA 的复合物，以调控剪接并实现核质运输。HIV-1 Rev 蛋白通过与内含子中的顺式作用靶点——Rev 反应元件（RRE）——发生多聚化，介导 HIV-1 mRNA 的核输出。在 Rev 富含精氨酸基序（ARM）的 COOH 末端存在一个核仁定位信号（NoLS），可促使 Rev/RRE 复合物在核仁中聚集。据推测，核仁因子除了介导不依赖 mRNA 的核输出和剪接外，还通过其他多种功能支持 HIV-1 感染周期。本文描述了一种在 HIV-1 复制条件下，通过质谱分析对野生型（WT）Rev 与 Rev 核仁突变体（包括缺失突变和单点 Rev-NoLS 突变）进行免疫共沉淀的方法。结果显示，在 Rev-NoLS 突变存在的情况下，参与核质运输的核仁因子（如核磷蛋白 B23 和核仁素 C23）以及细胞剪接因子均丧失了与 Rev 的相互作用。其他多种核仁因子（如 snoRNA C/D box 58）也被发现与 Rev 突变体失去相互作用，但其在 HIV-1 复制周期中的功能尚不清楚。本文结果展示了该方法在鉴定维持 HIV-1 感染周期的病毒/宿主核仁因子方面的应用价值。该策略所采用的概念同样适用于其他需要表征尚未充分研究通路的病毒和疾病模型。 顺式-作用靶点——Rev反应元件（RRE）。在Rev富含精氨酸基序（ARM）的COOH末端存在一个核仁定位信号（NoLS），可介导Rev/RRE复合物在核仁中的积累。除介导不依赖mRNA的核输出和剪接外，核仁因子还可能通过其他多种功能支持HIV-1感染周期。本文描述了一种免疫共沉淀方法，用于在HIV-1复制存在条件下，对野生型（WT）Rev与Rev核仁突变体（包括缺失突变和单点Rev-NoLS突变）进行比较，并结合质谱分析。在Rev-NoLS突变存在时，参与核质运输的核仁因子（如核磷蛋白B23和核仁素C23）以及细胞剪接因子均丧失与Rev的相互作用。其他多种核仁因子（如snoRNA C/D box 58）也被发现与Rev突变体的相互作用减弱，但其在HIV-1复制周期中的功能仍不明确。本文结果展示了该方法在鉴定维持HIV-1感染周期的病毒/宿主核仁因子方面的应用价值。该方法所采用的概念同样适用于其他需要表征尚未充分研究通路的病毒及疾病模型。

引言

核仁被认为是多种细胞宿主因子与病毒因子相互作用的场所，这些因子对病毒复制至关重要。核仁是一种复杂的结构，可分为三个不同的区室：纤维区、致密纤维组分区和颗粒区。HIV-1 Rev蛋白特异性定位于颗粒区，但这种定位模式的原因尚不清楚。当NoLS序列中存在单点突变（Rev突变4、5和6）时，Rev仍保持核仁定位模式，并且先前研究已表明其可恢复HIV-1_HXB2的复制能力，但效率低于野生型Rev¹。所有单点突变均无法维持HIV-1_NL4-3 的感染周期。当NoLS序列中存在多个单点突变（Rev-NoLS突变2和9）时，Rev被观察到在细胞核和细胞质中弥散分布，且无法恢复HIV-1_HXB2的复制¹。本项蛋白质组学研究的目标是解析参与Rev介导的HIV-1感染通路的核仁及非核仁细胞因子。通过Rev与核仁磷酸蛋白B23的相互作用来优化Rev免疫沉淀条件，此前研究表明，在存在核仁突变的情况下，B23与Rev的相互作用会丧失。

Rev 的细胞因子在以往已被广泛研究；然而，这些研究均未在病毒致病背景下进行。本研究在 HIV-1 复制过程中通过 Rev 相互作用所表征的一个特定蛋白是核仁磷酸蛋白 B23——在两栖动物中也称为核仁素（nucleophosmin, NPM）、numatrin 或 NO38^2,3,4B23 以三种同工型（NPM1、NPM2 和 NPM3）表达——均属于核仁磷酸蛋白/核质素核伴侣蛋白家族^5,6NPM1 分子伴侣在核小体的正确组装以及参与染色质高级结构的蛋白质/核酸复合物的形成中发挥功能^7,8，并通过N端核心结构域（残基1-120）防止靶蛋白的聚集和错误折叠⁹NPM1的功能延伸至核糖体生成，通过介导前核糖体颗粒在细胞核与细胞质之间的转运实现^10,11内转录间隔序列中前体核糖体RNA的加工^12,13，并在核糖体组装过程中抑制蛋白质的核仁聚集^14,15. NPM1 参与抑制细胞凋亡¹⁶ 以及在肿瘤抑制因子ARF的稳定中^17,18 和 p53¹⁹，揭示其具有致癌因子和肿瘤抑制因子的双重作用。NPM1 参与细胞基因组稳定性、中心体复制和转录等生物学活动。在细胞周期间期，NPM1 存在于核仁中；在有丝分裂期间，位于染色体周围；在有丝分裂结束时，则存在于前核仁体（PNB）中。相较于 NPM1，NPM2 和 NPM3 的研究较少，且 NPM1 在恶性肿瘤中表达水平会发生改变²⁰.

NPM1 通过其内部的核输出信号（NES）和核定位信号（NLS）参与多种核/核仁蛋白的核质穿梭过程，已有文献记载^9,21，并被先前报道可驱动 HIV-1 Tat 和 Rev 蛋白的核输入。当存在 B23 结合结构域-β-半乳糖苷酶融合蛋白时，Tat 在细胞质中发生错位定位并丧失转激活活性，这表明 Tat 与 B23 具有强亲和力²。另一项研究证实，在不含 RRE 的 mRNA 存在的情况下，Rev 与 B23 可形成稳定复合物；而在 RRE mRNA 存在时，Rev 会从 B23 上解离，并优先结合 HIV RRE，从而导致 B23 被置换²²。目前尚不清楚 Tat 的转激活作用以及 Rev 以 HIV mRNA 取代 B23 的交换过程在亚核水平的具体发生位置。据推测，这两种蛋白可能通过与 B23 相互作用同时进入核仁。预计还有其他宿主细胞蛋白参与 HIV 核仁通路。本蛋白质组学研究所描述的方法将有助于阐明核仁在 HIV-1 致病过程中与宿主细胞因子之间的相互作用。

通过表达 Rev NoLS 单点突变（M4、M5 和 M6）以及多个精氨酸替换突变（M2 和 M9），启动了用于 HIV-1_HXB2 产生的蛋白质组学研究。在此模型中，将带有 3' 端 Flag 标签的野生型（WT）Rev 及其核仁定位信号突变体转染至稳定表达 Rev 缺陷型 HIV-1_HXB2（HLfB）的 HeLa 细胞系中。与不能挽救 Rev 缺陷的 Rev-NoLS 突变体（M2 和 M9）相比，WT Rev 的存在可使 HLfB 培养体系中发生病毒复制；而 M4、M5 和 M6 突变体虽能支持病毒复制，但效率低于 WT Rev¹。在 Rev 表达条件下，病毒增殖 48 小时后收集细胞裂解液，并使用针对 Rev/B23 相互作用优化的裂解缓冲液进行免疫沉淀。文中描述了通过不同盐浓度优化裂解缓冲液的条件，并比较和分析了 HIV-1 Rev 蛋白在银染或考马斯亮蓝染色 SDS-PAGE 凝胶中的洗脱方法。第一种蛋白质组学方法是对表达的 WT Rev、M2、M6 和 M9 洗脱样品直接进行串联质谱分析。第二种方法则对 WT Rev、M4、M5 和 M6 的洗脱物进行凝胶切取处理，并与第一种方法进行比较。分析了肽段对 Rev-NoLS 突变体相对于 WT Rev 的亲和性，并展示了蛋白质鉴定的概率。这些方法揭示了可能参与 HIV-1 复制过程中 Rev 介导的 mRNA 核质运输和剪接的潜在因子（包括核仁和非核仁因子）。总体而言，本文所述的细胞裂解、免疫沉淀（IP）和洗脱条件适用于研究其他病毒蛋白及其激活和调控感染通路所需的宿主细胞因子。该方法同样适用于研究多种疾病模型持续存在所依赖的细胞宿主因子。在此蛋白质组学模型中，HIV-1 Rev 的免疫沉淀经过优化以增强与 B23 的相互作用，从而阐明参与核质穿梭活性及 HIV-1 mRNA 结合的核仁因子。此外，可参照 HLfB 细胞系，构建稳定表达特定关键蛋白缺陷型传染性疾病模型的细胞系，用于研究感兴趣的感染通路。

方案

1. 细胞培养

1. 在添加了10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺和1 mM丙酮酸钠的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HLfB细胞，使用经组织培养处理的100 mm培养皿。将细胞培养物置于37 °C、含5% CO₂的湿化培养箱中。当细胞融合时，传代至细胞密度为1 x 10⁶ 个细胞/mL。
2. 弃去细胞培养基。用10 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗细胞。移除并弃去1× PBS，注意不要破坏细胞层。
3. 向细胞中加入2 mL 1×胰蛋白酶-EDTA溶液。轻轻晃动培养皿使溶液覆盖单层细胞，并在37 °C湿化环境中孵育5分钟。
4. 用手掌用力轻拍培养皿侧面以使细胞脱落。将脱落的细胞重悬于8 mL新鲜培养基中。在400 × g 条件下离心5分钟。
5. 弃去培养基，注意不要破坏细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于10 mL新鲜培养基中。取1 mL浓缩细胞与9 mL新鲜培养基混合，接种至经组织培养处理的100 mm培养皿中进行传代培养。
   注意：针对每种Rev-NoLS突变，3个100 mm的HLfB或HeLa细胞培养皿可提供足量蛋白裂解液用于蛋白质印迹分析和质谱检测。额外增加培养皿用于设置野生型Rev阳性对照和阴性对照。若使用不同类型的细胞，传代时的细胞体积需进行优化。

2. HIV-1 复制过程中 Rev-NoLS-3'flag 突变体的表达

1. 将HLfB细胞培养至细胞密度为2 x 10⁶ 个细胞/mL。为每块100 mm培养板配制4 mL磷酸钙-DNA悬浮液，步骤如下：
   1. 标记两个15 mL离心管为1号和2号。向1号管中加入2 mL 2x HBS（0.05 M HEPES、0.28 M NaCl和1.5 mM Na₂HPO₄ [pH 7.12]）。向2号管中加入TE 79/10（1 mM Tris-HCl和0.1 mM EDTA [pH 7.9]），TE 79/10的体积为1.760 mL减去DNA的体积。
   2. 向2号管中加入20 µg含有目标Rev-NoLs-3'flag突变的质粒，通过重悬混匀。再向2号管中加入240 µL 2 M CaCl₂，再次通过重悬混匀。
   3. 将2号管中的混合液逐滴转移至1号管中，同时轻轻混匀。室温静置30分钟。涡旋震荡沉淀物。
2. 将1 mL上述悬浮液逐滴加入3块细胞培养用100 mm培养板中，同时轻轻旋转培养皿使液体混匀。将培养板放回培养箱，转染混合物孵育6小时。随后弃去转染混合物，每板更换10 mL新鲜培养基，继续培养42小时。

3. 病毒蛋白裂解液的收集

1. 转染后48小时弃去细胞培养基。将每个100 mm培养皿置于冰上。为每个Rev-NoLS突变样本标记15 mL离心管，并将离心管置于冰上。
2. 用10 mL预冷的1×PBS轻轻冲洗细胞，避免破坏细胞层。弃去1×PBS。向每个100 mm培养皿中加入3 mL裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl [pH 8.0]、137 mM NaCl和1% X-100去污剂[参见材料表]），该缓冲液需预先加入蛋白酶抑制剂混合物。
3. 使用细胞刮刀破坏细胞层。倾斜培养皿，轻柔刮取并收集细胞成液滴。用1,000 µL移液器收集细胞裂解物，并将三个100 mm培养皿的裂解物混入已预先标记的15 mL离心管中。
4. 将细胞裂解物置于冰上孵育15分钟，每5分钟涡旋震荡一次。在15,000 × g 条件下离心5分钟。
5. 小心收集上清液蛋白，避免扰动细胞碎片沉淀，并转移至另一无菌15 mL离心管中。使用Bradford法测定病毒蛋白裂解物的浓度（见第4节）。
6. 保留一份输入样品（20 µg）用于蛋白质印迹分析。加入2×上样缓冲液（20%甘油、0.02%溴酚蓝、125 mM Tris-Cl [pH 6.8]、5% SDS和10% 2-巯基乙醇）至终体积。在95 °C下煮沸10分钟，随后将输入样品保存于-20 °C。

4. 考马斯亮蓝法蛋白定量分析

注意：在生成蛋白质标准曲线之前，需从100倍浓缩的牛血清白蛋白（BSA）原液配制10倍浓缩的BSA。

1. 将水分别移取至微量离心管中，用于以下空白样和标准品：空白样 = 800 µL；标准品1 = 2 mg/mL，798 µL；标准品2 = 4 mg/mL，796 µL；标准品3 = 6 mg/mL，794 µL；标准品4 = 8 mg/mL，792 µL；标准品5 = 10 mg/mL，790 µL。将10倍浓度的BSA分别移取至对应的标准品中：标准品1 = 2 µL；标准品2 = 4 µL；标准品3 = 6 µL；标准品4 = 8 µL；标准品5 = 10 µL。
2. 通过将795 µL水与5 µL蛋白样品混合，制备蛋白样品混合液。向每个空白样、标准品和蛋白样品中加入200 µL蛋白检测试剂（见材料表）。短暂涡旋振荡以混匀，并在室温（18–20 °C）下孵育5分钟。
3. 将空白样、标准品和蛋白样品转移至比色皿中。在595 nm波长下测定各样品的蛋白浓度。

5. Rev-NoLS-3'flag 的共免疫沉淀

1. 用 500 µL 含蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液冲洗 25 µL M2 亲和凝胶珠（见材料表）。每个突变样本和对照组均需冲洗更多的亲和凝胶珠。
   注意：为两次凝胶实验（共 50 µL）准备足够的 M2 亲和凝胶珠——一次用于蛋白质印迹分析，另一次用于蛋白染色和质谱分析。
2. 在 4 °C 下以 820 × g 离心 2 分钟，弃去上清液。再冲洗两次。
3. 将病毒蛋白裂解液（总反应体积为 5 mL，浓度为 1 mg/mL）加入预先冲洗过的 M2 亲和珠中。用裂解缓冲液调节总体积。
4. 在 4 °C 下旋转孵育反应 3 小时。以 820 × g 离心 1 分钟，沉淀 M2 亲和珠/病毒蛋白裂解液复合物。
5. 收集上清液，并保留一份 IP 后样品等分试样（20 µg）用于蛋白质印迹分析。测定 IP 后裂解液的蛋白浓度，取 20 µg 用于蛋白质印迹。
6. 加入 2× 上样缓冲液至终体积。在 95 °C 下煮沸 10 分钟，将 IP 后样品储存于 -20 °C。
7. 用 750 µL 裂解缓冲液冲洗 M2 珠，于 4 °C 在旋转器上洗涤 5 分钟。以 820 × g 离心 M2 珠，弃去上清液。
8. 在 4 °C 的旋转器上重复步骤 5.7 中的洗涤操作两次，每次 5 分钟。第三次洗涤后，使用长型凝胶加样枪头从 M2 珠/共免疫沉淀复合物中彻底去除残留的裂解缓冲液。
   注意：在去除微量裂解缓冲液前，先用平头镊子夹住凝胶加样枪头末端，以防止 M2 珠被搅动或吸入枪头。
9. 将 M2 珠重悬于 55 µL 的 2× 上样缓冲液中，在 95 °C 下煮沸 10 分钟。
10. 将 25 µL 洗脱液分别上样至两块独立的 SDS-PAGE 凝胶（一块用于蛋白质印迹分析，另一块用于考马斯亮蓝染色）。

6. SDS-PAGE 凝胶的制备

1. 在50 mL离心管中混合以下试剂，制备两块15% SDS-丙烯酰胺分离胶（最终体积为40 mL，可制备四块凝胶）：4.16 mL超纯水、15 mL 40%丙烯酰胺:双丙烯酰胺（29:1）、10 mL 1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）、400 µL 10% SDS、400 µL 10%过硫酸铵和40 µL TEMED。
2. 通过反复倒置50 mL离心管数次混匀分离胶溶液。将分离胶混合液移入已预先清洗的Western凝胶装置中（共四块凝胶——三块用于Western免疫印迹，一块用于考马斯亮蓝/银染）。
3. 轻柔地加入足够的水覆盖凝胶混合液的顶层。静置使分离胶充分聚合。
4. 倾去分离胶上方的水层，并使用精细擦拭纸（见材料表）吸除残留水分。
5. 在50 mL离心管中混合以下试剂，制备两块5% SDS-丙烯酰胺浓缩胶（最终体积为20 mL，可制备四块凝胶）：11.88 mL超纯水、2.5 mL 40%丙烯酰胺:双丙烯酰胺（29:1）、5.2 mL 1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）、200 µL 10% SDS、200 µL 10%过硫酸铵和20 µL TEMED。
6. 通过反复倒置50 mL离心管数次混匀浓缩胶溶液。将浓缩胶混合液加至分离胶上方，直至填满装置顶部。
7. 将含有适当孔数的凝胶梳插入浓缩胶中。使用精细擦拭纸（见材料表）吸除溢出的胶液。静置使浓缩胶完全聚合。
8. 用1× Western电泳缓冲液充满Western凝胶装置（5×储存液配方：250 mM Tris-Cl [pH 8.3]、1.92 M甘氨酸、0.5% SDS和10 mM EDTA）。
9. 轻柔地从浓缩胶中拔出凝胶梳。让1× Western电泳缓冲液充满加样孔。在上样前，用注射器以1× Western电泳缓冲液冲洗每个加样孔。
10. 将Western免疫印迹样品分别加入对应的凝胶孔中（包括上样输入样品、共免疫沉淀样品和IP后样品）。同时加入Western凝胶蛋白分子量标准。
11. 将用于考马斯亮蓝/银染的共免疫沉淀样品加入另一块凝胶中。同时加入Western凝胶蛋白分子量标准。
12. 将电泳装置连接至电源，以100 V电压电泳，直至加样染料迁移至分离胶。随后将电压升至140 V，继续电泳至加样染料迁移至分离胶底部。

7. 蛋白质印迹转膜

1. 拆卸 Western 胶电泳装置。切下并弃去浓缩胶，保留分离胶完整。
2. 将分离胶轻轻转移至盛有 Western 转膜缓冲液（25 mM Tris，194 mM 甘氨酸，0.005% SDS，20% 甲醇）的洁净托盘中，浸泡 15 分钟。
3. 按以下步骤组装转膜装置：
   1. 根据分离胶的尺寸，裁剪三张 PVDF 转膜膜和六张滤纸（见材料表）。
   2. 将 PVDF 膜浸入甲醇中 5 分钟，随后在水中水化 5 分钟。将 PVDF 膜置于 Western 转膜缓冲液中备用。
   3. 将胶板夹置于部分装有 Western 转膜缓冲液的玻璃烤盘中，黑色面朝下。
   4. 将一块用 Western 转膜缓冲液浸透的海绵垫紧贴在胶板夹的黑色面上。
   5. 将一张滤纸浸入 Western 转膜缓冲液后，放置在海绵垫上，再将分离胶置于滤纸上。
      注意：应确保分离胶的加样方向正确，以便蛋白质能正确转至 PVDF 膜上。
   6. 将一张 PVDF 转膜置于分离胶上方，再用 Western 转膜缓冲液润湿另一张滤纸，覆盖在 PVDF 转膜上。
   7. 在滤纸上再放置一块浸透 Western 转膜缓冲液的海绵垫，小心合上胶板夹的白色面，并将夹子牢固锁紧。
   8. 将胶板夹插入转膜装置的电极组件中。对每个剩余的分离胶重复步骤 7.3.4–7.3.8。
   9. 用 Western 转膜缓冲液注满转膜槽，并将搅拌子放入槽内。
   10. 将转膜槽置于磁力搅拌器上，调节搅拌速度至 5–6，确保搅拌子不卡住且不碰撞胶板夹。
   11. 将转膜装置连接至电源，在 4 °C 条件下以 100 V 恒压转膜 1 小时。

8. 免疫印迹

1. 取出凝胶支架盒，将黑色面朝下放置在干净的玻璃烤盘上。打开盒体，小心丢弃海绵垫和滤纸。在PVDF膜的一角做标记，以确定正确的加样方向。保持膜处于湿润状态。
   注意：PVDF膜可在空气中干燥后置于洁净、密封的容器中保存。通过重复步骤7.3.2重新水化膜。
2. 将膜放入100 mL封闭液（5%脱脂奶粉，1×TBS，0.1% Tween 20）中，在室温（18–20 °C）下轻轻摇动封闭1小时。
3. 在25 kDa蛋白marker上方横向切割膜。将含有大于25 kDa蛋白条带的膜上部放入含B23小鼠单克隆IgG₁（1:500稀释）的封闭液中，4 °C轻轻摇动封闭过夜。
4. 将含有小于25 kDa蛋白条带的膜下部放入含M2小鼠单克隆IgG₁（1:1,000稀释，见材料表）的封闭液中，4 °C轻轻摇动封闭过夜。
5. 在摇床上用25 mL洗涤液（1×TBS，0.1% Tween 20）洗涤膜3次，每次10分钟。
6. 将膜在封闭液中稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG₁（1:5,000稀释）中室温孵育1小时。随后在摇床上用25 mL洗涤液洗涤膜3次，每次10分钟。
7. 配制化学发光Western印迹底物。使用p1000移液器将底物加至膜上。
8. 将每张膜在化学发光Western印迹底物中显色5分钟。取出膜，用洁净擦拭纸吸去多余底物（见材料表）。
9. 将膜放入固定在暗盒内侧的干净透明文件保护袋中。将暗盒带入暗室，插入一张X光胶片，锁紧暗盒并孵育5–15分钟。取出胶片并进行显影。

9. 考马斯亮蓝染色

1. 拆卸 Western 胶电泳装置。切下并弃去浓缩胶，保留分离胶完整。将分离胶轻轻转移至盛有 25 mL 超纯水的洁净托盘中。
2. 将凝胶置于摇床上孵育 15 分钟。使用轻柔振荡以防止分离胶破碎。弃去超纯水，并重复洗涤步骤 2 次。
   注意：如果洗涤步骤后仍残留 SDS 气泡，可将凝胶在超纯水中洗涤过夜。残留的 SDS 可能导致凝胶染色背景过高。
3. 通过倒置瓶身混合考马斯亮蓝染色液（见材料表）。加入 100 mL 考马斯亮蓝染色液以覆盖分离胶，并在摇床上孵育 1 小时。弃去染色液，将凝胶在去离子水中于摇床上洗涤 15 分钟。
4. 弃去去离子水，再重复洗涤步骤 2 次。持续洗涤凝胶，直至观察到蛋白质条带达到理想的分辨效果。

10. 银染

1. 拆卸 Western 凝胶电泳装置。切下并弃去浓缩胶，保留分离胶完整。将分离胶轻轻转移至盛有 25 mL 超纯水的洁净托盘中。
2. 在摇床上孵育凝胶 15 分钟。使用轻柔振荡以防止分离胶破裂。弃去超纯水，并重复洗涤步骤 2 次。
   注意：如果洗涤步骤后仍残留 SDS 气泡，可将凝胶在超纯水中洗涤过夜。残留的 SDS 可能导致凝胶背景染色过高。
3. 用 30% 乙醇:10% 乙酸溶液（水:乙醇:乙酸 = 6:3:1）在室温下固定凝胶过夜。在 10% 乙醇溶液中洗涤凝胶 5 分钟（室温）。更换乙醇溶液，再洗涤 5 分钟。
4. 使用 Pierce 银染试剂盒配制致敏工作液：将 1 份银染致敏剂与 500 份超纯水混合（50 µL 致敏剂 + 25 mL 超纯水）。将分离胶在致敏工作液中孵育 1 分钟。用超纯水洗涤凝胶 1 分钟，更换水后再次洗涤 1 分钟。
5. 配制染色工作液：将 1 份银染增强剂与 50 份银染液混合（500 µL 增强剂 + 25 mL 银染液）。将凝胶在染色工作液中孵育 30 分钟。
6. 配制显影工作液：将 1 份银染增强剂与 50 份银染显影剂混合（500 µL 增强剂 + 25 mL 显影剂）。配制 5% 乙酸溶液作为终止液。用超纯水洗涤凝胶 1 分钟，更换水后继续洗涤 1 分钟。
7. 将水更换为显影工作液，孵育至达到所需的蛋白条带强度（约 5 分钟）。用终止液替换显影工作液，孵育 10 分钟。

11. 考马斯亮蓝染色凝胶条带的胶内还原、烷基化及消化

1. 使用洁净的剃刀从凝胶上切下胶带，将每块凝胶切成约5 mm的立方体，并放入干净的0.5 mL微量离心管中。
2. 用含1:1乙腈:水的100 mM碳酸氢铵溶液在室温下覆盖凝胶块，脱色15分钟，弃去上清液。重复此步骤一次。
3. 将凝胶块在真空离心机中干燥5分钟。用含10 mM二硫苏糖醇的100 mM碳酸氢铵溶液覆盖干燥的凝胶块，在56 °C孵育1小时，以还原蛋白质。
4. 吸除上清液。用含100 mM碘乙酰胺的水溶液覆盖凝胶块，室温避光孵育1小时，以烷基化蛋白质。
5. 吸除上清液，用乙腈覆盖凝胶块，在室温下轻轻振荡15分钟，使凝胶块收缩。吸除上清液后，用100 mM碳酸氢铵溶液覆盖凝胶块，在室温下轻轻振荡15分钟，使其重新溶胀。
6. 重复步骤11.5。将凝胶块在真空离心机中干燥5分钟。
7. 用100 mM碳酸氢铵溶液配制的50 ng/µL测序级修饰胰蛋白酶（见材料表）覆盖凝胶块，静置5分钟使其溶胀，然后吸除多余液体。再用100 mM碳酸氢铵溶液覆盖凝胶块，使其充分重新溶胀，加入足够的100 mM碳酸氢铵溶液以完全浸没凝胶块。
8. 在37 °C孵育凝胶块过夜。通过加入相当于总体积1/10的含10%甲酸的水溶液终止反应。收集各管中的上清液。
9. 用含1%甲酸的60%乙腈溶液覆盖凝胶块，轻轻振荡孵育15分钟，以提取凝胶中的肽段。
10. 在真空离心机中将合并的上清液浓缩至体积小于20 µL，注意避免完全干燥。加入1%甲酸，使总体积恢复至20 µL。

12. 液相色谱/质谱分析

注意：样品使用配备超高效液相色谱仪、纳米电喷雾源和色谱柱的质谱仪进行分析（参见材料表）。溶剂A和溶剂B分别为含0.1%甲酸的水溶液和乙腈。

1. 将消化后的蛋白质加入高回收率聚丙烯自动进样瓶中，并将进样瓶放入UPLC系统的样品管理器中。
2. 每份样品进样6 µL。以99%溶剂A/1%溶剂B的条件，在8 µL/min流速下将每份样品加载至纳米捕获柱1.5分钟。
3. 采用线性梯度洗脱肽段进入质谱仪：在30分钟内将溶剂B从3%升至35%，随后在4分钟内从35%升至50%，再在1分钟内从50%升至90%。维持90%乙腈3分钟，然后在5分钟内将溶剂B比例降至3%。
4. 以正离子全扫描模式采集质谱数据，分辨率为20,000。扫描范围为100至2,000 Da，每0.6秒采集一次谱图。采用MS^E模式采集数据，交替进行无碰撞能量和高碰撞能量的扫描。
5. 对于高碰撞能量，将Trap池中的碰撞能量从15 V线性 ramp 至40 V。每30秒采集一次锁质量谱，使用[Glu₁]-纤维蛋白肽B的+2价离子作为锁质量。在每对样品之间使用溶剂A进行空白进样，并采用相同的采集方法，以控制样品残留。

13. 质谱数据分析

1. 将质谱结果文件复制到运行定量与定性蛋白质组学研究平台（例如 ProteinLynx Global Server）的计算机上。数据分析对 CPU 资源要求较高，应在独立的高性能数据分析计算机上进行。
2. 为数据创建一个新项目。创建一个新的微孔板以代表自动进样器板，并将各样品分配至微孔板中与其在自动进样器中相同的位置。
3. 为每个样品设置样品处理参数。所用参数包括：自动色谱峰宽和 MSTOF 分辨率；低能量阈值为 100 计数；升高水平阈值为 5 计数；强度阈值为 500 计数。
4. 为每个样品设置工作流程参数。所用参数包括：数据库为串联的人类 SwissProt 与 HIV 数据库，并包含反向序列；自动肽段和碎片离子容差；每条肽段最少碎片离子匹配数为 3；每种蛋白质最少碎片离子匹配数为 7；每种蛋白质最少肽段匹配数为 1；主要消化试剂为胰蛋白酶；允许漏切位点数为 1；固定修饰试剂为 carbamidomethyl C；可变修饰试剂为 oxidation M；错误发现率设为 100。
5. 选择样品并点击 处理最新原始数据。搜索完成后，选择样品并点击 导出数据至 Scaffold（版本 3）。打开 Scaffold，创建一个新文件，并使用前体离子定量法将从蛋白质组学平台导出的每个文件作为新的生物样品导入。
6. 当所有文件导入后，进入 加载并分析数据 界面。选择与搜索时相同的数据库，并使用 LFDR 评分及标准实验范围蛋白质分组方式导入数据。在分析过程中，将显示选项设为 蛋白质鉴定概率，蛋白质阈值设为 20%，最少肽段数量设为 1，肽段阈值设为 0%。

结果

Rev-NoLS 的单点和多点精氨酸突变（对应多种亚细胞定位模式）被用于检测其与细胞宿主因子相互作用的能力，并与野生型（WT）Rev 进行比较。在 HLfB 培养物中表达 WT Rev-3'flag 和 pcDNA-flag 载体。从全细胞裂解液中提取蛋白复合物，并用银染试剂染色。图1显示，在含有不同浓度 NaCl（137 mM、200 mM 和 300 mM）的三种不同裂解缓冲液条件下，均可检测到 Rev-NoLS-3'flag（约 18 kDa）。核仁磷酸蛋白 B23（37 kDa）在低盐浓度（137 mM，第 2–4 泳道）的裂解缓冲液中可被检测到，在含 200 mM NaCl 的缓冲液中几乎不可见，在高盐浓度（300 mM NaCl）的缓冲液中则无法检测。在图2中，于 HLfB 培养物中表达了 WT Rev-3'flag、Rev-NoLS M1-3'flag 和 pcDNA-flag 载体。蛋白复合物来源于两种裂解缓冲液条件（137 mM 和 200 mM NaCl）制备的全...

讨论

通过质谱分析比较在 HIV-1 存在条件下 Rev-NoLS 突变体与野生型（WT）Rev，以了解参与病毒复制周期的核仁因子。该方法可鉴定病毒传染性所必需的核仁组分。核仁蛋白 B23 对 Rev-NoLS 具有高亲和力，并参与 Rev 的核仁定位³以及 Rev 结合的 HIV mRNA 的核质运输²²。通过在病毒产生过程中对 Rev-3'flag 进行免疫沉淀，评估了 B23 与包含单个或多个精氨酸替换的 Rev-NoLS 突变体之间的亲和力（图 2；WT 及突变体 M2、M6 和 M9）。此前已在 HIV-1 复制背景下研究过 B23 与单点 Rev-NoLS 突变体 M4、M5 和 M6 的亲和力。在先前的研究中，M4、M5 和 M6 的免疫沉淀洗脱物经抗 α-flag 抗体进行 Western 免疫印迹分析，以检测 Rev 和 B23 的亲和性¹。在 Rev 单点突变背景下，B23 的结合亲和力显著降低。而在 HIV 复制过程中，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸	Fisher Chemical	A38S-212
乙腈	Fisher Chemical	A955-500
丙烯酰胺:双丙烯酰胺	BioRad	1610158
碳酸氢铵	Fisher Chemical	A643-500
过硫酸铵	Sigma-Aldrich	7727-54-0
ANTI-Flag M2 亲和凝胶	Sigma-Aldrich	A2220
抗 Flag M2 小鼠单克隆 IgG	Sigma-Aldrich	F3165
BioMax MS 胶片	Carestream	8294985
Bio-Rad 蛋白检测试剂浓缩液，450 mL	Bio-Rad	5000006
B23 小鼠单克隆 IgG	Santa Cruz Biotechnologies	sc-47725
溴酚蓝	Sigma-Aldrich	B0126
雀巢脱脂奶粉	Nestle	N/A
细胞刮刀	ThermoFisher Scientific	179693PK
C18IonKey nanoTile 色谱柱	Waters	186003763
Corning 100 mm 经组织培养处理的培养皿	Fisher Scientific	08-772-22
二硫苏糖醇	Thermo Scientific	J1539714
1 × DPBS	Corning	21-030-CVRS
ECL 化学发光 Western 印迹底物	Pierce	32106
乙醇，200 证明	Fisher Chemical	A409-4
FBS	Gibco	16000044
甲酸	Fisher Chemical	A117-50
GelCode 蓝色染色试剂	ThermoFisher	24590
甘油	Fisher Chemical	56-81-5
山羊抗小鼠 IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnologies	sc-2005
碘乙酰胺	ACROS Organics	122270050
KimWipe 精细擦拭纸	Kimberly Clark Professional	34120
L-谷氨酰胺	Gibco	25030081
甲醇	Fisher Chemical	67-56-1
NanoAcuity UPLC	Waters	N/A
Pierce 银染试剂盒	Thermo Scientific	24600df
15 mL 聚丙烯圆锥形离心管	Falcon	352097
预染蛋白质标准品，10 至 180 kDa	Thermo Scientific	26616
蛋白酶抑制剂混合物	Roche	4693132001
纯化 BSA	New England Biolabs	B9001
PVDF  Western 印迹膜	Roche	3010040001
丙酮酸钠	Gibco	11360070
10 × TBS	Fisher Bioreagents	BP2471500
TEMED	BioRad	1610880edu
Triton X-100 去垢剂溶液	BioRad	1610407
Trizaic 源	Waters	N/A
胰蛋白酶-EDTA	Corning	25-051-CIS
Tween 20	BioRad	1706531
Synapt G2 质谱仪	Waters	N/A
Whatman 滤纸	Tisch Scientific	10427813