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方法文章

基于脑部氧合监测与扩展血流动力学监测的猪标准化失血性休克诱导方法

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DOI：

10.3791/59332

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2019年5月21日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg-University

本文内容

摘要

失血性休克是严重创伤患者中的一种严重并发症，可导致危及生命的氧供不足。本文介绍一种通过猪放血诱导失血性休克的标准化方法，该方法由血流动力学和脑微循环氧合指标指导。

摘要

失血性休克是导致严重创伤相关死亡的主要原因之一。循环血容量和氧载体的丧失可导致氧气供应不足，并引发不可逆的器官衰竭。大脑的代偿能力极为有限，尤其容易遭受严重的缺氧性损伤。本文展示了一种通过精确计算放血量，在猪模型中可重复地诱导危及生命的失血性休克的方法。我们通过近红外光谱技术 和扩展性血流动力学监测来滴定休克的诱导过程，以呈现全身循环衰竭以及脑部微循环的氧耗竭状态。与主要依赖预设放血量来诱导休克的类似模型相比，本方法强调根据大循环和微循环功能衰竭的实际结果进行滴定调节。

引言

大量失血是创伤相关死亡的主要原因之一1,2,3。循环液体和氧载体的丧失可导致血流动力学衰竭和严重缺氧，进而引发不可逆的器官衰竭和死亡。休克的严重程度还受到低体温、凝血功能障碍和酸中毒等其他因素的影响4。特别是大脑，以及肾脏，由于其高氧需求以及无法有效进行无氧供能，因而缺乏足够的代偿能力5,6。在治疗上，迅速而及时的干预至关重要。在临床实践中，首选治疗措施是使用平衡电解质溶液进行液体复苏，随后输注浓缩红细胞和新鲜冰冻血浆。血小板浓缩物、儿茶酚胺类药物，以及对凝血功能和酸碱平衡的优化，有助于在严重创伤后恢复正常的生理状态。这一治疗理念主要聚焦于血流动力学和宏观循环的恢复。然而，多项研究表明，微循环灌注并不能与宏观循环同步恢复。尤其是脑部灌注仍持续受损，可能进一步发生缺氧7,8。

使用动物模型可使科学家建立新颖或实验性的策略。猪与人类在解剖结构、同源性及生理学上的相似性，使得研究人员能够对特定的病理因素得出结论。这两个物种具有相似的代谢系统以及对药物治疗的反应。与小型动物 模型相比，这是一个显著优势，因为在小型动物模型中，血容量、血流动力学及整体生理学的差异几乎无法模拟临床场景9。此外，可在猪模型中直接使用已获批准的医疗设备和耗材。同时，商业供应商可便捷地提供实验用猪，从而实现遗传背景和表型的高度多样性，并降低实验成本10。通过血管插管进行采血的模型十分常见11,12,13,14,15。

本研究通过动脉放血诱导出血性休克，并精确调控血流动力学衰竭和脑部氧合损伤的程度。当心指数和平均动脉压降至基线值的40%以下时，即达到出血性休克状态，该状态已被证实可导致脑区氧合饱和度显著下降8。采用脉搏轮廓心输出量（PiCCO）监测技术进行持续的血流动力学监测。首先，需通过经肺热稀释法对系统进行校准，从而计算心指数、血管外肺水含量以及全心舒张末期容积。随后，通过脉搏轮廓分析法持续计算心指数，并提供脉压变异率和每搏输出量变异率等动态前负荷参数。

该技术在临床和实验环境中已得到广泛应用。近红外光谱法（NIRS）是一种在临床和实验中成熟的方法，可实时监测脑部供氧变化。自粘式传感器被放置于左右前额，无创地计算大脑额叶皮层的脑组织氧合情况。传感器发射两种波长的红外光（700 和 900 nm），经皮层组织反射后接收信号。为评估脑部氧含量，系统按动脉血与静脉血1:3的比例计算其各自贡献，并以每5秒一次的频率更新数据。该技术对1–4 cm深度组织的检测灵敏度呈指数递减，且受穿透组织（如皮肤和颅骨）的影响，尽管颅骨对红外光具有一定的通透性。该技术有助于快速采取治疗措施，预防患者出现谵妄或缺氧性脑损伤等不良后果，并在心输出量受损时作为目标监测参数16，17。在实验性休克过程中联合使用这两种技术，可精确调节大循环状态以及评估脑部微循环障碍，从而深入研究这一危及生命的病理事件。

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方案

本实验方案已获得德国莱茵兰-普法尔茨州及机构动物护理委员会（Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz，科布伦茨，德国；主席：Dr. Silvia Eisch-Wolf；批准编号：23 177-07/G 14-1-084；2015年2月2日）的批准。实验严格遵循《活体动物实验报告指南》（Animal Research Reporting of In Vivo Experiments, ARRIVE）的指导原则进行。本研究于2015年11月至2016年3月期间设计并实施。在广泛文献调研的基础上，选择猪作为出血性休克的成熟动物模型。共纳入7只雄性麻醉猪（Sus scrofa domestica），平均体重为28 ± 2 kg，年龄为2–3个月。动物由州及机构动物护理委员会推荐的本地饲养员提供。为尽量减少应激，动物尽可能保留在其熟悉的环境中。实验预定开始前6小时停止喂食，但不禁水，以降低误吸风险。代表性实验时间进程见图1。

1. 麻醉、插管和机械通气

  1. 使用氯胺酮（4 mg·kg⁻¹）与甲苯噻嗪（2 mg·kg⁻¹）联合注射对猪进行镇静-1）和阿扎哌隆（8 mg·kg-1) 在颈部或臀肌处使用针头进行肌内注射（1.2 mm）。确保动物在镇静起效前保持稳定。
    警告： 处理动物时必须佩戴手套。
  2. 将麻醉后的动物转运至实验室。
    注意： 动物会进入深度睡眠状态，在正常操作过程中不会苏醒，例如被提起并转移至运输笼时。在此情况下，使用专用于动物运输的特殊车辆，运输时间约为20分钟。
  3. 监测外周血氧饱和度（SpO₂）2使用传感器夹在猪的尾巴或耳朵上，于到达后立即进行检测。
  4. 用无色消毒酊对皮肤进行消毒，3分钟后将外周静脉导管（1.2 mm）插入耳缘静脉。随后通过静脉注射芬太尼（4 µg·kg⁻¹）诱导麻醉。-1）和丙泊酚（3 mg·kg-1).
  5. 当所有反射消失且自主呼吸停止后，将猪仰卧位固定于担架上，并用绷带固定。
    注意： 麻醉程度是否充分须由经验丰富的研究人员通过观察眼睑反射的消失及其他对外界刺激的反应来确认。
  6. 立即使用犬用通气面罩（2号）开始无创通气。采用以下通气参数：吸氧浓度（FiO₂）2) = 1.0；呼吸频率 = 14–16 次/分钟-1气道峰压 <20 cm H2O，呼气末正压（PEEP）= 5 cm H₂O2O.
  7. 通过持续输注芬太尼（0.1–0.2 µg·kg⁻¹·min⁻¹）维持麻醉-1·h-1）和丙泊酚（8-12 mg·kg-1·h-1）并开始输注平衡电解质溶液（5 mL·kg⁻¹·h⁻¹）-1·h-1).
  8. 通过应用肌肉松弛剂（阿曲库铵 0.5 mg·kg⁻¹）以辅助气管插管-1).
  9. 通过使用普通气管插管（内径 6-7）和管芯进行插管以固定气道。使用带有 Macintosh 刀片（4 号）的普通喉镜。该操作由两人协作完成。
    1. 人员1：用一块组织将舌头固定在外部，另一只手打开吻部。
    2. 人员2：进行喉镜检查。
    3. 操作者2：当会厌显现时，将喉镜向腹侧移动。抬起会厌，确保声带可见。
      注意： 如果会厌未向背侧移动，它会粘附在软腭上，此时可用导管尖端将其松动。 alternatively，可使用其他尺寸（3 或 5）或类型的喉镜片（Miller 喉镜片）。
  10. 小心地将导管通过声带。
    注意： 气管最狭窄的部位不在声带水平，而是在声门下。如果导管无法插入，可尝试旋转导管或使用较细的导管。
  11. 拔出导引器，使用10 mL注射器向套囊注入10 mL空气以封闭套囊，并使用套囊压力计将套囊压力控制在30 cm H₂O2O
  12. 导管连接呼吸机后开始机械通气（PEEP = 5 cm H₂O）2O；潮气量 = 8 mL·kg-1；FiO₂2 = 0.4；吸气与呼气时间比 = 1:2；呼吸频率 = 根据需要调整以达到目标呼气末二氧化碳水平2 的 <6 kPa
    注意： 避免 CO 的波动2 以尽量减少呼吸对脑灌注的影响。
  13. 通过定期呼出 CO 确保管路位置正确2 通过二氧化碳波形监测，并借助听诊检查双侧通气情况。
    注意： 如果气管插管位置不当，即使尚未连接二氧化碳监测仪，气体也会迅速进入胃部，在腹壁形成可见的隆起。此时必须重新置管，并插入胃管。
  14. 两人协作下，将胃管插入胃内，以防止反流和呕吐。
    1. 人员1：用一块组织将舌头固定在外部，同时用另一只手打开吻部。
    2. 人员2：对猪喉部进行喉镜检查。
    3. 操作者2：观察食管。
    4. 操作者2：使用Magill镊将胃管沿食管推进，直至引流出胃液。
      注意： 有时，视野并不清晰。此时，将喉镜向导管背侧移动，并向腹侧推动以打开食管。操作过程中，用毯子覆盖动物身体，以防止低体温。如果动物体温下降，应使用加热系统将体温维持在生理水平（参见 材料表体温显示在PiCCO的屏幕上。

2. 仪器设备

  1. 使用绷带向后拉住后肢，以展平股部区域的皱褶，便于血管插管。
  2. 准备以下材料：一支5 mL注射器、一支10 mL注射器、一支50 mL注射器、一支Seldinger针、导引鞘（2 mm、2.7 mm、2.7 mm）、鞘用导丝、带导丝的三腔中心静脉导管（2.3 mm，30 cm）以及PiCCO导管（1.67 mm，20 cm）。
  3. 用有色消毒剂对腹股沟区域进行消毒，等待2分钟，然后用无菌纱布擦去消毒剂。重复此操作3次。第三次消毒后，不再擦除消毒剂。
  4. 用生理盐水充满所有导管。
  5. 在超声探头上涂抹超声耦合剂。用无菌开窗洞巾覆盖腹股沟区域，并用超声扫描右侧股血管。使用多普勒技术区分动脉与静脉18。
  6. 鲜红色搏动性血液可确认穿刺针位置正确。断开注射器，将导丝插入右侧股动脉。
  7. 显示右侧股静脉的纵轴，并在持续抽吸状态下，使用5 mL注射器引导Seldinger针插入。
  8. 抽出暗红色非搏动性静脉血。
  9. 显示右侧股动脉的横断面，然后将探头旋转90°，切换为动脉的纵切面视图。
  10. 在超声引导下，使用Seldinger针并在5 mL注射器持续抽吸状态下穿刺右侧股动脉。
    注意：    与其它血管通路方法相比，超声引导下的Seldinger技术显著减少失血量、组织创伤及操作时间19,20。
    1. 若无法明确确认针在不同血管中的正确位置，可采集血样，并使用血气分析仪（见材料表）分析血液气体含量。高氧 水平提示为动脉血，低氧水平则提示为静脉血。
  11. 断开注射器并撤出Seldinger针后，将中心静脉导管用导丝插入右侧股静脉。
  12. 使用超声观察双侧右侧血管，以确认导丝位置正确。
  13. 沿导丝将动脉导引鞘（2 mm）推入右侧动脉，并通过抽吸血液固定其位置。
  14. 采用Seldinger技术将中心静脉导管置入右侧股静脉。抽吸所有管腔并用生理盐水冲洗。
  15. 在左侧腹股沟区域执行相同操作，使用Seldinger技术将另一套导引鞘分别置入左侧股动脉（2.7 mm）和股静脉（2.7 mm）。
  16. 将右侧动脉导引鞘和中心静脉导管分别连接至两个换能器系统，用于测量有创血流动力学参数，并将两个换能器置于心脏水平，以获得准确读数。
  17. 将两个换能器的三通旋塞打开至大气，按照操作说明书要求将系统校准至0。
    注意：必须完全避免系统内出现气泡或血渍，以确保获得可靠数值。
  18. 将维持麻醉的所有输液从外周静脉转移至中心静脉导管。
  19. 在复苏15分钟后，记录基线值（血流动力学、肺功能测定、近红外光谱NIRS（见第4节）及PiCCO （见第3节））。
  20. 诱导出血性休克（见第5节）。

3. PiCCO 测量

注意： PiCCO 设备请参见材料表。

  1. 将PiCCO导管插入右侧动脉导入鞘中。
    注意： 在临床医学中，PiCCO导管通常通过塞丁格技术直接置入。然而，通过导入鞘进行置入也是可行的。
  2. 将导管与PiCCO系统的动脉导线以及动脉传感器直接连接至PiCCO端口。然后按照步骤2.17所述重新校准。
  3. 将PiCCO 系统的静脉测量单元连接至左侧静脉导入鞘。
    注意： 必须将静脉和动脉探头在相距一定距离的位置连接。否则，测量将受到干扰，因为向静脉系统注入冷盐水溶液会影响动脉测量结果。有关PiCCO的更多细节，请参见 Mayer和Suttner21。
  4. 打开PiCCO系统，并确认开始对新患者进行测量。
  5. 输入动物的体型和体重，并将类别切换为“成人”。
  6. 输入方案名称和编号，然后点击 退出。
  7. 将注射体积设置为10 mL。
    注意： 所选注射溶液的体积可以调整。较大的体积可使测量值更具可靠性。选择较小体积可避免因重复注射引起的血液稀释效应。
  8. 输入中心静脉压。
  9. 将三通旋塞阀打开通向大气，点击 归零 进行系统校准，然后点击 退出。
  10. 按照下述方法校准连续心输出量测量，并点击 TD（热稀释法）。准备一支含有10 mL、温度为4 °C的生理盐水溶液的注射器，然后点击 开始。
  11. 快速而稳定地将10 mL冷盐水溶液注入静脉测量单元，等待测量完成，直至系统提示重复操作。
  12. 重复此过程，直至完成三次测量。
  13. 让系统计算所有参数的平均值，然后点击 退出。
  14. 完成全部校准后，立即开始测量。为监测休克诱导情况，请重点关注PiCCO导出的参数——心脏指数。

4. 脑区氧饱和度

注意：用于监测脑区氧合的设备，请参见材料表。

  1. 使用一次性剃须刀和水剃除猪的前额毛发，并将两个自粘式传感器（参见材料表）贴附于猪的前额用于近红外光谱（NIRS）检测。
  2. 将前置放大器连接至监测仪，并将传感器电缆的彩色编码连接器插入前置放大器对应的接口。
  3. 关闭前置放大器的锁定装置，并将传感器连接至传感器电缆。
    注意： 为记录实时数据，必须将一个U盘插入NIRS监测仪的USB接口。
  4. 打开监测仪，点击新患者，输入研究名称，然后点击完成。
  5. 检查输入信号。当信号稳定后，点击基线菜单，然后点击设置基线。如果已输入过基线，请点击是确认新基线，然后点击事件标记。
  6. 使用键盘上的箭头按钮和下一个事件选择事件；选择事件3 诱导，然后按下选择事件。
    注意： 如需进一步信息，请参考NIRS系统的操作手册22。

5. 出血性休克诱导

  1. 将左侧导入鞘管与三通阀连接。将三通阀的一个端口连接至50 mL注射器，另一个端口连接至空的输液瓶。
    注意： 或者，抽出的血液可收集于含枸橼酸盐的血袋中，以备后续自体输血。这是控制性放血的主要优势之一。
  2. 测量并记录确切的血流动力学参数，并计算心指数和平均动脉压基线值的40%作为血流动力学目标值。按照步骤4.6所述，在近红外光谱（NIRS）系统中设置事件93 血液丢失。
    注意： 当心指数和平均动脉压降至基线值的40%以下时，即达到出血性休克状态。若脑区氧合饱和度（crSO2）下降超过20%，更有利于反映微循环功能障碍。达到此状态所需的平均失血量约为25–35 mL·kg-1。
  3. 用注射器抽出50 mL血液，然后旋转三通阀，将血液推入空瓶中。
  4. 记录已移除的血液体积。
  5. 密切监测动脉血压、心指数及crSO2。重复放血操作，直至达到目标血压和心指数（通常在20–30分钟内完成）。
  6. 按照步骤4.6所述，在NIRS设备中设置事件97 低血压。
    注意： 不可过快放血，以免导致急性心循环衰竭。完成休克诱导程序后，动物模型可用于多种治疗干预实验。

6. 实验结束与安乐死

  1. 向中心静脉导管内注入 0.5 mg 芬太尼，并等待 5 分钟。
  2. 向中心静脉导管内注入 200 mg 丙泊酚，并使用 40 mmol 氯化钾实施安乐死。

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结果

启动休克诱导后，可观察到短暂的代偿期。随着持续放血，如近红外光谱监测的脑组织氧饱和度（crSO2）、心脏指数、胸腔内血容量指数及全心舒张末期容积指数显著下降所示，出现前述的心血管循环失代偿现象（图2、图3 和 图4）。此外，心率显著增快及动脉血压下降是失血性休克的常见表现（图2）。每搏输出量变异度显著升高（图3）。肺血管外水含量和全身血管阻力通常不受明显影响（图3）。在停止放血（28 ± 2 mL·kg-1）后，血流动力学参数仍维持在极低水平。与此同时，crSO2 也显著下降。这些传感器的初始读数通常并不完全一致，但其下降的百分比具有可比性。

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讨论

本方案描述了一种通过在猪体内进行受控动脉放血以诱导出血性休克的方法，该方法由全身血流动力学及脑部微循环障碍共同指导。通过计算放血量为25-35 mL kg-1来达到休克状态，并通过上述一系列替代参数综合判断，确认出现显著的心血管循环衰竭。若不进行治疗，该操作在66%的动物中可在2小时内导致死亡，突显了该模型的严重性与可重复性。另一方面，充分的液体复苏可使循环重新稳定，并验证了其可模拟临床场景的可行性8。然而，若失血量较少，可能不足以引起影响crSO2的血流动力学不稳定，从而导致实验失败。所移除血液的量需要 根据动物体重进行调整，以对应其总血容量8。

该方法使科学家能够研究这种危及生命状况的各个方面，并为在模拟临床场景下探讨多种治疗干预措施提供了机会。在此背景下，需要特别指出的是，在显性失血性休克期间 ，仅依靠大循环难以反映微循环及器官氧供是否完整或受损7。该操作方法的优势在于其...

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披露

该近红外光谱（NIRS）设备由美国美敦力公司（Medtronic PLC）无偿提供，仅用于实验研究目的。Alexander Ziebart、Andreas Garcia-Bardon 和 Erik K. Hartmann 收到了美敦力公司支付的医师培训课程授课酬金。所有作者均声明不存在经济利益或其他利益冲突。

致谢

作者感谢 Dagmar Dirvonskis 提供的出色技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
三通旋塞阀 蓝色Becton Dickinson Infusion Therapy AB，瑞典赫尔辛堡394602药物给药
三通旋塞阀 红色Becton Dickinson Infusion Therapy AB 赫尔辛堡，瑞典394605药物给药/休克诱导
阿曲库铵Hikma Pharma GmbH ，马丁斯里德AM03AC04*麻醉
Canula 20 GBecton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga，西班牙301300血管通路
Datex Ohmeda S5GE Healthcare Finland Oy，赫尔辛基，芬兰-血流动力学监测仪
消毒 Schülke & Mayr GmbH，德国104802消毒 
海德堡出版社ängerung 75CMFresenius Kabi Deutschland GmbH2873112  药物给药/休克诱导
INVOS 5100C 脑部Medtronic PLC，美国-脑区氧合监测仪 
INVOS 脑部/体感氧饱和度成人大传感器Medtronic PLC，美国20884521211152脑区氧合监测 
气管内导管Teleflex Medical Sdn. Bhd，马来西亚112482插管
经气管插管导引器  Wirutec GmbH，德国苏尔茨巴赫5033062插管
Engströmöm CarestationGE Healthcare，美国麦迪逊-呼吸机
芬太尼扬森-西拉格有限公司，诺伊斯AA0014*麻醉
手套Paul Hartmann，德国海登海姆9422131自我保护
Incetomat-线 150 cmFresenius, Kabi GmbH，德国巴特洪堡9004112药物给药
氯胺酮Hameln Pharmaceuticals GmbH，瑞士苏黎世AN01AX03*镇静
喉镜Teleflex Medical Sdn. Bhd，马来西亚671067-000020插管
逻辑压力监测系统Smith- Medical GmbH  美国明尼阿波利斯MX9606血流动力学监测仪
Logicath 7 Fr 三腔 30 cm史密斯-医疗有限公司（Smith- Medical GmbH）  美国明尼阿波利斯MXA233x30x70-E血管通路/药物给药
Masimo Radical 7Masimo Corporation，美国加利福尼亚州尔湾市-血流动力学监测仪
用于狗通气的面罩Henry Schein，Melville，美国730-246通气
原装 Perfusor 注射器 50 mL 鲁尔锁B.Braun Melsungen AG，德国美尔森8728810F药物给药
PICCO 热稀释法。F5/20CM EW MAQUET Cardiovascular GmbH，德国拉施塔特PV2015L20-A  血流动力学监测仪
8.5 Fr 和 9 Fr 带止血阀/侧管的经皮鞘管导入套装，10 cmArrow国际公司，美国雷丁AK-07903血管通路/休克诱导
Perfusor FM BraunB.Braun Melsungen AG，德国美尔森8713820药物给药
氯化钾Fresenius, Kabi GmbH，德国巴特洪堡6178549安乐死
丙泊酚 2%Fresenius, Kabi GmbH，德国巴特洪堡  AN01AX10*麻醉
 脉搏轮廓心输出量（PiCCO）2) Pulsion Medical Systems，德国菲尔德基兴-血流动力学监测仪
Sonosite Micromaxx 超声系统富士胶片，索诺声博瑟尔，博瑟尔，美国 -血管通路
不锈钢 Macintosh 4 号Teleflex Medical Sdn. Bhd，霹雳州，马来西亚  马来西亚670000插管
SterofundinB.Braun Melsungen AG，德国美尔森AB05BB01*平衡电解质输注
Stresnil 40 mg/mL  Lilly Germany GmbH，德国威斯巴登QN05AD90镇静
10 mL 注射器Becton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga，西班牙309110药物给药
2 mL 注射器Becton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga，西班牙300928药物给药
20 mL 注射器Becton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga，西班牙300296药物给药
5 mL 注射器Becton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga，西班牙309050药物给药
22 G 静脉导管B.Braun Melsungen AG，德国美尔森4269110S-01血管通路
*ATC：  解剖学治疗学化学/限定日剂量分类 

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