使用前 Vivo 共聚焦显微镜可视化淋巴节点结构和细胞定位

Summary

该协议描述了一种在不改变器官结构的情况下在排空淋巴结中成像不同细胞群的技术。

Abstract

淋巴结(LUN)是体内传播的器官,与先天免疫反应可以连接适应性免疫。事实上,LN战略性地插在淋巴血管的路径中,允许组织抗原与LN中所有常驻免疫细胞亲密接触。因此,使用外体全LN成像了解细胞组成、分布、位置和相互作用,将增进有关人体如何协调局部和全身免疫反应的知识。该协议显示了在体内给荧光标记抗体进行体内给药后,使用传统的共聚焦显微镜和库存试剂,允许非常可重复且易于执行的方法的体外成像策略。通过皮下抗体注射,可以在排空LUN中标记不同的细胞群,而不影响可能由传统免疫荧光显微镜技术破坏的组织结构。

Introduction

淋巴结 (Lun) 是卵形器官,广泛存在于全身,具有桥接先天和自适应免疫反应的关键功能。LUN过滤淋巴,以识别外来颗粒和癌细胞,以对它们进行免疫反应1。抗原呈现细胞(ApCs),T细胞和B细胞一起产生抗原特异性抗体(体液免疫)和细胞毒性淋巴细胞(细胞免疫),以消除外来颗粒和癌细胞2。因此,了解淋巴系统中免疫细胞的动态对疫苗开发和癌症免疫治疗具有重要影响。

强大的显微镜的出现-包括新的共聚焦和超分辨率显微镜-使一个非凡的进步,在理解不同的免疫细胞群体如何在他们的原生环境中如何运行3。现在,可以使用与转基因小鼠结合探针,在特定靶^点4、5的控制下表达荧光蛋白,可以成像几个同时发生的细胞亚型。事实上,高维技术,包括大规模细胞学和多参数流分析,对于扩大我们对^{健康和疾病中}不同免疫细胞的分块和功能的知识^{至关重要。7.}然而,为了准备这些技术的样本,组织需要消化,细胞从自然环境中分离出来,在细胞悬浮液中进行分析。为了超越这些限制,并允许生物学更好的翻译,这里提出的协议的目标是应用一个简单的方法,使用库存共聚焦显微镜图像外....

Protocol

该协议由哈佛医学院动物常设委员会和布里格姆妇女医院批准,协议2016N000230。

1. 用于实验的老鼠

1. 在B6背景上使用8周大的雄性小鼠和雌性小鼠进行抗体混合。
2. 使用 CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT小鼠确定是否也可以将前体全 LN 成像应用于报告小鼠,而无需施用抗体混合物,并调查是否存在单核细胞,包括抗原呈现细胞和噬菌体,及其在LN中的分布。
   注:CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT报告小鼠分别在 CX3CR1 和 CCR2 启动子的控制下插入绿色荧光蛋白 (GFP) 和红色荧光蛋白 (RFP)。报告小鼠可使用抗体混合物或不注射抗体混合物。请参阅参考4,了解在报告小鼠中注射抗体混合物。如果没有注射抗体,继续手术。

2. 抗体混合制剂和注射

注: 对步骤 1.1 中描述的小鼠执行这些步骤。

1. 稀释 1:10 的亮紫罗兰 (BV) 421 抗 CD4 (GK1.5; 0.2 毫克/升/升,1:10 的亮蓝色 (BB) 515 抗 CD19 (1D3; 0.2 mg/mL) 和 1:20 的植物性二青素 (PE) 抗 F4/80 (T45....

Results

本手稿展示了在注射荧光标记抗体以染色这些器官的特定细胞群后,在不破坏其结构的情况下去除淋巴结的技术(图1和图2).

LN细胞与BV421抗CD4和BB515抗CD19和共聚焦成像分析的免疫标记的强大组合,定义了T细胞(CD4+)和B细胞(CD19+)在铀素和波普利特LN中的定位。在两个器官中,B细胞卵泡被T细胞群包围(图3,图4和视频1),这是LN结构1的标志。为了排除淋巴窦内方的噬菌体可以捕获注射的荧光抗体并导致细胞标记的非特异性标记的可能性,在抗体混合物中包括PE抗F4/80。如图5所示,方细胞没有内化注入的抗体,表明B细胞和T细胞染色是特异性的。此外,视频1显示T和B.......

Discussion

成像与其他技术(包括分子生物学和高维免疫分型)的结合增强了我们在其原生环境中研究免疫细胞的能力。事实上,虽然其他方法可能需要组织消化和细胞分离(这可能导致组织完整性的丧失),但使用体内或前体成像在以地理方式调查不同细胞亚型方面具有很大优势^3,16.转基因小鼠菌株的可得性迅速增加,这种菌株专门针对细胞表达不同的荧光。重要的是,报告小鼠和抗体混合物的注射是在同一^器官4中染色体内不同细胞群的有力工具。此外,像CRISPR/Cas9这样的基因编辑工具的普及使得不同的群体能够自定义他们的小鼠菌株,几乎任何细胞类型都可以在其真实^位置17中成像。使用这种方法,可以深入详细地评估不同细胞类型之间的空间和功能关系。然而,如果细胞运动或体内动态事件的成像不是强制性的,可以使用不太复杂的实验方法。在这种情况下,抗体和探针在体内传递,器官(或样品)在显微镜中直接可视化。

在这里,我们描述了一个简.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV421 抗 CD4	BD Horizon	562891	GK1.5;0.2 mg mL-1
BB515 抗 CD19	BD Horizon		564509 1D3;0.2 mg mL-1
BB515 大鼠 IgG2a 和 kappa;同种型对照	BD Horizon	564418	R35-95;0.2 mg mL-1
sup>BV421 小鼠 IgG2b，K 同种型对照	BD Horizon	562603	R35-38 0.2 mg mL-1
Cellview 培养皿	Greiner-Bio	627861	35x10 mm，玻璃底
注射器	BD Plastipak-Insulin		U-100
Kimwipes	Kimtech Science Brand	7557	尺寸 21 x 20 厘米/每盒 100 张
微外科弯曲镊子	WEP 定制手术器械		12.5 厘米
显微外科弯曲剪刀	WEP 定制手术器械		11.5 厘米
针	BD PrecisionGlide-30		量规和时间; ½ 英寸
尼康 Eclipse Te + A1R 共聚焦头	尼康	-	加载主要的 4 条激光线（405、488、543 和 647 nm）
PE 抗 F4/80	BD 药学	565410	T45-2342;0.2 毫克 mL-1
PE 大鼠 IgG2a，κ同型对照	BD Pharmigen	553930	R35-95;0.2 mg mL-1
>蔡司 LSM 710 共聚焦显微镜		司	装载有 4 条主要激光线（405、488、543 和 647 nm）