本方案描述了一种在不改变器官结构的情况下对引流淋巴结中不同细胞群体进行成像的技术。
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摘要
摘要
淋巴结（LNs）是分布于体内的器官，是先天性免疫应答与适应性免疫相互连接的场所。事实上，淋巴结在淋巴管通路中具有战略性的位置，可使组织抗原与淋巴结内所有定居的免疫细胞发生密切接触。因此，利用离体全淋巴结成像技术来研究细胞组成、分布、定位及相互作用，将有助于深入了解机体如何协调局部与全身免疫应答。本方案介绍了一种在体内给予荧光标记抗体后的离体成像策略，该方法可使用常规共聚焦显微镜和现成试剂，具有高度可重复性和操作简便的优点。通过皮下注射抗体，可在不影响组织结构的前提下，对引流淋巴结中的不同细胞群体进行标记，避免了传统免疫荧光显微技术可能造成的组织损伤。
引言
淋巴结（LNs）是呈卵圆形的器官，广泛分布于全身，其关键功能是连接先天性免疫应答与适应性免疫应答。淋巴结可过滤淋巴液，以识别外来颗粒和癌细胞，并启动相应的免疫应答1。抗原呈递细胞（APCs）、T细胞和B细胞协同作用，产生针对特异性抗原的抗体（体液免疫）以及细胞毒性淋巴细胞（细胞免疫），从而清除外来颗粒和癌细胞2。因此，深入了解淋巴系统中免疫细胞的动态变化，对于疫苗研发和癌症免疫治疗具有重要意义。
强大显微镜技术的出现——包括新型共聚焦显微镜和超分辨率显微镜——极大地推动了人们对不同免疫细胞群体在其原生环境中行为方式的理解3。如今，通过结合使用特异性靶点调控下表达荧光蛋白的转基因小鼠与多种探针，已可实现对多种细胞亚群的同时成像4,5。事实上，高维技术（包括质谱流式细胞术和多参数流式分析）在拓展我们对健康与疾病状态下不同免疫细胞区室化分布及功能认知方面发挥了关键作用6,7。然而，为准备适用于这些技术的样本，组织需经过消化处理，细胞也被从其天然微环境中分离，进而以单细胞悬液形式进行分析。为了克服这些局限性，并促进生物学研究中更贴近生理状态的结果转化，本方案旨在应用一种简便的方法，利用常规共聚焦显微镜对离体完整淋巴结进行成像，相较于传统免疫荧光染色，该方法在成像速度、组织结构保存和细胞活性方面均具有优势。通过采用此方法，我们发现，缺乏γδ T细胞（一类参与宿主抵御病原体早期防御的T淋巴细胞亚型）的小鼠，其生发中心和T细胞区结构较野生型小鼠明显受损4。这些发现促使我们进一步开展研究，证实了γδ T细胞在淋巴器官稳态维持及体液免疫应答中发挥关键作用4。此外，本方案通过皮下注射方式给予探针和抗体，使其经由组织淋巴循环进入淋巴结，模拟了生理递送途径。这一策略建立在此前多项研究基础之上，这些研究曾利用原位抗体标记技术对淋巴系统相关结构8,9、生发中心动态变化10,11,12以及血液流动可及性靶点13,14,15进行可视化观察。
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方案
该方案已获哈佛医学院和布莱根妇女医院动物保护常设委员会批准，方案编号为2016N000230。
1. 实验所用小鼠
- 使用8周龄的B6背景雄性和雌性小鼠进行抗体混合物的给药。
- 使用CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT小鼠，以确定体外完整淋巴结成像是否也可应用于无需给予抗体混合物的报告基因小鼠，并用于研究单核细胞（包括抗原呈递细胞和吞噬细胞）的存在及其在淋巴结中的分布情况。
注：CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT报告基因小鼠分别在CX3CR1和CCR2启动子控制下插入了绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）。报告基因小鼠可选择性地联合或不联合注射抗体混合物。关于在报告基因小鼠中注射抗体混合物的详细信息，请参见参考文献4。若不进行抗体注射，则直接进入手术步骤。
2. 抗体混合物的制备与注射
注意：对步骤 1.1 中描述的小鼠执行这些步骤。
- 将BV421抗CD4（GK1.5；0.2 mg/mL）按1:10稀释，BB515抗CD19（1D3；0.2 mg/mL）按1:10稀释，PE抗F4/80（T45-2342；0.2 mg/mL）按1:20稀释，溶于PBS中，配制成适当终体积，用于注射至内侧大腿（用于成像腹股沟淋巴结）或足垫（用于成像腘窝淋巴结）。
注意：同型对照使用BV421小鼠IgG2b, k同型对照（R35-38；0.2 mg/mL）；PE大鼠IgG2a, κ同型对照（R35-95；0.2 mg/mL）；BB515大鼠IgG2a, κ同型对照（R35-95；0.2 mg/mL）。若更换染色抗体，应使用相应的同型对照。 - 为成像腹股沟淋巴结，将100 µL抗体混合液经皮下注射至内侧大腿（图1A）。或者，为成像腘窝淋巴结，将50 µL抗体混合液经皮下注射至足垫（图2A）。使用精细的1 mL胰岛素注射器（胰岛素U-100），配以0.30 mm × 13 mm（30号 × ½英寸）针头。
注意：确保腹股沟淋巴结染色的注射为皮下注射而非肌肉注射（i.m.），因为若进行肌肉注射，抗体混合液无法被正常引流。 - 在注射抗体混合液前，不要对动物进行麻醉。
- 注射后至少等待3小时（腹股沟引流淋巴结）或12小时（腘窝引流淋巴结），再取出器官。
- 若使用如BV（Brilliant Violet）或BB（Brilliant Blue）等大分子聚合物荧光染料未能完全观察到淋巴结细胞标记，可改用较小的荧光素，如异硫氰酸荧光素（FITC）、PE（phycoerythrin）和别藻蓝蛋白（APC）作为替代。
3. 切除腹股沟引流淋巴结的手术步骤
- 采用 CO2 窒息法处死小鼠，随后进行颈椎脱位。
- 用胶带将小鼠固定在丙烯酸板上，并用棉签在腹部皮肤涂抹矿物油，以防止切口周围残留毛发（图1B）。无需去除毛发。
- 使用显微外科弯剪（11.5 cm）和显微外科弯镊（12.5 cm），从耻骨至剑突沿腹中线做纵行切口（图1C）。
- 将腹部肌肉组织与皮肤分离（图1D）。
- 在纵行切口线的顶端和底端做横向皮肤切口，以在目标侧（根据抗体混合物注射侧）形成皮瓣，并翻开皮肤以暴露淋巴结（图1E）。
- 用胶带将皮瓣固定在丙烯酸板上（图1F）。
- 使用显微外科弯镊摘除腹股沟引流淋巴结（图1F）。淋巴结在皮下呈半透明、通常为双叶状的球形结构。
4. 切除引流腘窝淋巴结的手术操作
- 使用 CO2 窒息法处死小鼠，随后进行颈椎脱位。
- 用胶带将小鼠固定在丙烯酸板上，使其呈俯卧位，并用棉签在小腿和膝部涂抹石蜡油（图 2A-D）。
- 从小鼠足跟至膝关节沿中线在小腿处做切口（图 2E,F）。
- 将小腿肌肉组织与皮肤分离（图 2F,G）。
- 暴露腘窝（图 2G）。腘淋巴结呈透明球状，位于腘窝内。
- 使用显微外科弯镊摘除腘淋巴结（图 2G）。
- 或者，将小鼠翻转为仰卧位，于股二头肌与半腱肌之间进入腘窝，通过从小腿足跟至膝关节做中线切口并分离小腿肌肉与皮肤，以摘除腘淋巴结。
注意：腘窝是位于膝关节后方的浅凹区域。需小心切开，以便观察腘淋巴结。
5. 淋巴结制备
- 将整个器官置于带玻璃底的培养皿（35 mm × 10 mm）中，使用显微外科弯头镊子去除器官周围附着的脂肪组织（图1G-I 和 图2H）。
- 将器官居中放置于培养皿中央（图1J 和 图2H）。
- 用一片精细擦拭纸覆盖器官，并用室温的0.9%生理盐水或磷酸盐缓冲液保持湿润（图1K-M 和 图2H）。
注意：淋巴结取出后无需清洗，且无需在生物安全柜内进行淋巴结分离操作。
6. 离体共聚焦显微镜（成像）
- 将培养皿置于倒置共聚焦显微镜的插槽中（图1N 和 图2H）。
- 在共聚焦显微镜下对淋巴结（LNs）进行成像（图1O 和 图2H）。
- 首先使用共聚焦显微镜的常规透射光，配合4x或10x物镜获取正确的焦平面，然后从透射光模式切换至激光模式。
注意：如果共聚焦显微镜无4x物镜，也可使用10x物镜准确完成对焦。 - 使用同型对照染色、未染色或无荧光样本（表1）调节激光功率、偏移（offset）和增益，以消除自发荧光及抗体非特异性染色背景；本研究中所用荧光标记抗体包括BV-421标记的抗CD4、BB515标记的抗CD19以及PE标记的抗F4/80。
- 使用微调旋钮和载物台移动装置，分别调节 Z 轴和 XY 轴位置，以定位至淋巴结中感兴趣的区域。
- 在4x、10x和20x物镜下采集图像，重点关注淋巴结结构和细胞分布情况，图像分辨率设为1024 × 1024像素。
注意：每只动物每个物镜下至少在五个不同视野采集图像。 - 使用图像分析软件对图像进行处理，分离荧光通道，添加比例尺和所需颜色，并重建三维视图。
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结果
本手稿展示了在向腹股沟和腘窝淋巴结注射荧光标记抗体以标记这些器官中特定细胞群后，如何在不破坏其结构的情况下切除这些淋巴结的技术（图1 和 图2）。
通过使用BV421标记的抗CD4抗体和BB515标记的抗CD19抗体对淋巴结细胞进行免疫标记，并结合共聚焦成像分析，明确了T细胞（CD4+）和B细胞（CD19+）在腹股沟和腘窝淋巴结中的定位。在这两种器官中，B细胞滤泡均被T细胞群所包围（图3、图4 和 视频1），这是淋巴结结构的典型特征1。为排除沿淋巴窦排列的吞噬细胞可能捕获注射的荧光抗体而导致细胞标志物非特异性标记的可能性，抗体混合物中包含了PE标记的抗F4/80抗体。如图5所示，吞噬细胞并未内化注射的抗体，...
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讨论
将成像技术与其他方法（包括分子生物学和高维免疫表型分析）相结合，显著提升了我们在原生环境中研究免疫细胞的能力。事实上，与其他可能需要组织消化和细胞分离（可能导致组织完整性丧失）的方法相比，在体或离体成像技术在以空间地理方式研究不同细胞亚群方面具有显著优势3,16。目前，能够特异性靶向细胞表达不同荧光蛋白的转基因小鼠品系正迅速增加，这并不令人意外。尤为重要的是，报告基因小鼠与抗体混合物注射相结合，成为在同一个器官内对不同细胞群体进行在体标记的有力工具4。此外，随着CRISPR/Cas9等基因编辑工具的普及，不同研究团队现已能够定制化构建小鼠模型，使得几乎任何类型的细胞都可在其真实位置被成像17。利用该方法，可深入细致地评估不同类型细胞之间的空间关系与功能联系。然而，如果并非必须进行在体细胞运动或动态事件的成像，则可采用较为简单的实验方案。在此情况下，抗体和探针在体内递送后，可直接在显微镜下观察器官（或组织样本）。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：R01 AI43458，授予 H.L.W.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BV421 抗 CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5；0.2 mg mL-1 |
| BB515 抗 CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3；0.2 mg mL-1 |
| BB515 大鼠 IgG2a，κ 同型对照 | BD Horizon | 564418 | R35-95；0.2 mg mL-1 |
| BV421 小鼠 IgG2b，K 同型对照 | BD Horizon | 562603 | R35-38；0.2 mg mL-1 |
| Cellview 培养皿 | Greiner-Bio | 627861 | 35×10 mm，带玻璃底 |
| 胰岛素注射器 | BD Plastipak | - | 胰岛素 U-100 |
| Kimwipes 擦镜纸 | Kimtech Science 品牌 | 7557 | 尺寸 21 × 20 cm / 每盒 100 张 |
| 显微外科弯头镊 | WEP 外科器械 | 定制 | 12.5 cm |
| 显微外科弯头剪 | WEP 外科器械 | 定制 | 11.5 cm |
| 针头 | BD PrecisionGlide | - | 30 号 × ½ 英寸 |
| Nikon Eclipse Te + A1R 共聚焦显微镜头 | Nikon | - | 配备主要 4 种激光线（405、488、543 和 647 nm） |
| PE 抗 F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342；0.2 mg mL-1 |
| PE 大鼠 IgG2a，κ 同型对照 | BD Pharmigen | 553930 | R35-95；0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 共聚焦显微镜 | Zeiss | - | 配备主要 4 种激光线（405、488、543 和 647 nm） |
参考文献
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