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方法文章

利用旋转土芯法研究通过共同菌根网络连接的植物间相互作用

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DOI：

10.3791/59338

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2019年3月26日

 , 
1Department of Biology, North Central College, 2Department of Biology, University of Miami

通讯作者： Joanna Weremijewicz <jweremi@gmail.com>

本文内容

摘要

群落中的大多数植物可能都通过丛枝菌根（AM）真菌相互连接，但关于这些真菌对植物相互作用的调控作用，以往研究主要通过比较植物在有无菌根条件下的生长情况来开展。本文介绍一种在菌根植物之间调控共有菌根网络的方法，以研究其对植物相互作用的影响。

摘要

丛枝菌根（AM）真菌影响植物的矿质营养吸收和生长，因此可能影响植物间的相互作用。其作用能力源于菌丝体在根际养分耗竭区以外的延伸，最终将个体通过共同的菌根网络（CMN）相互连接。然而，大多数实验通过比较植物在有无菌根真菌条件下的生长来研究AM真菌在植物相互作用中的作用，这种方法未能明确揭示CMN的具体功能。本文提出一种通过操控CMN来研究其在植物相互作用中作用的方法。该方法采用底部为圆锥形、带有尼龙网和/或覆盖狭缝开口的疏水材料的改良容器，结合15N肥料以及贫营养的中间砂层。CMN可在相互作用的个体间保持完整，或通过旋转容器切断，或通过实心屏障阻止其形成。我们的研究结果表明，旋转容器足以破坏CMN并阻止其在CMN间对植物相互作用的影响。该方法的优势在于模拟了自然界的某些特征，例如幼苗接入已建立的CMN，以及利用一组可能提供多样化益处的AM真菌。尽管本实验仅限于研究苗期植物，但利用该方法可检测CMN间的植物相互作用，因此可用于探究CMN在生态系统中功能相关的生物学问题。

引言

丛枝菌根（AM）真菌在4.6亿年前协助植物完成了对陆地的定殖1 如今，它们已成为大多数植物普遍存在的共生体2，为植物提供生长所必需的矿质营养。菌根真菌的菌丝纤细如丝线，能够延伸至根系周围养分耗竭区以外的区域搜寻矿质养分，常接触并定殖邻近植物的根系，从而形成“共同菌根网络”（CMN）。当真菌萌发菌丝加入已建立的网络时，也可能形成共同菌根网络。3，或当丛枝菌根菌丝与同种菌丝融合（吻合）时4,5,6,7这些菌丝体在土壤中的分布范围极为广泛，菌丝体占草原和牧场土壤中微生物总生物量的20%至30%8 并拉伸至111 m·cm-3 在未受干扰的草原中9.

丛枝菌根网络在相互连接的邻近植物之间分配矿物质养分10,11,12,13。植物所需磷的最高可达80%以及氮的25%可来自丛枝菌根真菌，而作为交换，植物可向真菌提供其固定碳总量的最高达20%14。最近的体外根器官培养研究表明，菌根网络倾向于优先与向真菌提供最多碳的寄主根系进行矿物质养分交换11,12。此外，不同种类的丛枝菌根真菌作为共生伙伴的质量可能存在差异，某些真菌能以较少的碳交换更多的磷，而其他真菌则不然15。尽管根器官培养体系因其可提供严格控制的环境并能直接观察菌丝连接，是研究丛枝菌根共生关系的有益模型，但该体系不包含进行光合作用的地上茎叶部分 而这些地上部分会影响 光合作用、蒸腾作用和昼夜节律变化等重要生理过程，并同时作为碳和矿物质养分的汇。

在自然界中，幼苗很可能接入已建立的共同菌根网络（CMNs）。然而直到最近，科学家通常仅通过在有无丛枝菌根（AM）真菌的条件下种植植物（常使用单一AM真菌物种）来研究AM真菌对植物营养的影响。尽管这些研究极大地增进了我们对丛枝菌根的理解，但这种方法忽视了CMNs在相互连接的寄主植物之间可能发挥的关键作用。特别是那些生长高度依赖AM真菌的植物，在缺乏AM真菌时相互作用极小16,17，因此将其作为基线参照的“对照”时，可能会干扰我们对AM真菌介导的植物间相互作用的正确解读。

我们提出一种旋转核心方法，用于研究菌根网络（CMNs）在植物相互作用和种群结构形成中的作用。该方法模拟了自然界中丛枝菌根（AM）共生关系的组成部分，因为完整植株会接入已建立的菌根网络，且所有植物均在丛枝菌根真菌存在条件下生长。通过消除根系间的直接接触，本方法可特异性地聚焦于由丛枝菌根真菌介导的相互作用，同时追踪矿质养分在菌根网络中的移动过程。本方法在以往研究基础上发展而来，此前已有研究在野外和温室中利用旋转核心技术，以更真实地理解丛枝菌根的功能。

旋转土芯法在文献中已被确立为一种操控菌丝外菌丝的方法18,19,20,21，过去二十年来根据其用途不同经历了多种形式的演变。最初，使用允许菌丝进入的网袋或屏障，以建立无根区，用于量化土壤中丛枝菌根菌丝的数量22,23。随后，发展出由刚性水管或带槽塑料管包裹的圆柱形土壤土芯，槽口覆盖尼龙网，允许菌丝穿透但阻止根系进入。这种装置可轻松旋转，以破坏菌丝外菌丝体18,24,25。将旋转土芯置于植株之间，可定量测定每克土壤中菌丝长度18、13C向菌丝外菌丝体的转移量24，或从无植株土芯中吸收的磷量18。此类土芯的另一用途是在田间将植物种植于其中，通过频繁旋转破坏菌丝以减少丛枝菌根真菌对根系的定殖，从而替代灭菌或杀菌剂处理——这两种方法均会对土壤有机质及其他微生物产生间接影响18。

菌丝网络屏障法已被用于研究通过共同菌根网络（CMNs）的养分分配和植物间相互作用，但此前的研究均在矩形微宇宙系统中进行，而非使用旋转土芯。Walder 等人26 研究了……之间的相互作用 Linum usitatissimum （亚麻）和 高粱（Sorghum bicolor） 通过利用同位素示踪AM真菌菌根网络中的矿质养分与碳交换，研究高粱（sorghum）的碳-养分交换过程 Rhizophagus irregularis 或 Funneliformis mosseae26该研究中的微宇宙系统包括由网隔分隔的植物区室、仅菌根菌丝可进入的菌丝区室，以及含有放射性同位素和稳定同位素标记的标记菌丝区室。作为对照，研究设置了不含菌根真菌的处理组。Song et al.27 采用类似方法发现植物信号仅能在已形成的菌根网络（CMNs）之间传递 F. mosseae 当一株植物被真菌病原体感染时。此外，与 Walder 等人的研究类似。26，Merrild 等28 在由网状结构分隔的独立隔间中种植植物，以研究植物的生长表现 Solanum lycopersicum （番茄）幼苗通过菌根网络与大型植株相连 Cucumis sativus （黄瓜）植株作为丰富的碳源。他们还采用了不接种丛枝菌根真菌的处理方式，以替代切断菌根网络的方法28在另一项相关实验中，使用标记的网袋研究了碳与磷的交换。 32P. 菌根微宇宙实验中采用菌丝网状屏障和CMN切断处理的方法由Janos等人使用。29，研究了稀树草原树种幼苗之间的竞争相互作用 Eucalyptus tetrodonta 以及热带雨林树木的移植， Litsea glutinosa在该研究中，Janos 等人29 抬起含有幼苗的隔室数厘米，通过相互滑动网状层以切断菌丝连接29.

旋转根芯法发展的最后一步是在置于花盆或微宇宙系统中的根芯内种植植物20,30。Wyss30利用旋转根芯来确定胞外菌根菌丝是否能够从供体或“护理”性丛枝菌根（AM）宿主植物Tamarindus indica向外扩散并定殖Pinus elliottii幼苗，以及外生菌根真菌的胞外菌丝如何影响幼苗的生长表现。在微宇宙系统中使用了大型商用管状育苗容器（材料表），这些容器要么为实心塑料材质（无菌丝网络，CMNs），要么带有槽孔并覆盖疏水膜。带有槽孔的育苗容器要么不旋转（保持完整的CMNs），要么进行旋转以切断已建立的菌丝网络（CMNs）。Babikova等人20使用不同孔径网 barrier 的旋转根芯，研究了Vicia faba（蚕豆）植物之间通过菌丝网络（CMNs）进行的地下信号传递。在他们的研究中，直径为30 cm的中型微宇宙系统中的中心供体植物通过根系和菌丝（无屏障）连接，或仅通过穿过40 μm网 barrier 建立的菌丝网络（CMNs）连接。通过旋转被网 barrier 包裹的根芯，可切断中心植物与邻近植物之间的相互作用；或者使用0.5 μm的细网 barrier 包裹根芯，以阻止菌丝网络（CMNs）的形成。

本文介绍一种结合了先前旋转核心法多个方面的实验方法，用于研究共同菌根网络（CMNs）对植物间直接相互作用的影响，并结合稳定同位素示踪技术。本方法采用“目标植物”策略，即以某一中心关注植物为核心，周围种植邻近植物。植物生长于可旋转的幼苗容器内，容器带有插槽并覆盖尼龙丝网、疏水膜，或采用未改装的实心塑料结构。共同菌根网络每周切断一次或保持完整，同时利用15N稳定同位素追踪氮素从邻近植物旋转核心向中心目标植物的转移情况。通过比较植物个体大小与矿质养分及稳定同位素吸收的关系，评估在寄主植物相互作用中哪些植物可能因CMNs而受益或受到不利影响。

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方案

1. 可旋转核心部件的构建与组装

  1. 改造商用管状育苗容器（后文简称“容器”；材料表），使其具有19 mm宽 × 48 cm长的开口。
    1. 使用台钻并配备19 mm的空心钻头（无中心导向麻花钻），在容器（直径2.5 cm × 长度12.1 cm）的侧壁上上下切割两个孔，使两孔间距约为1 cm。将容器紧贴台钻上的挡板，并使用带有短销钉的止动装置插入容器内部，以帮助固定容器位置，防止钻孔时移动。建议使用柔性塑料材质的容器，以防开裂。
    2. 用剪刀、电线钳或铁皮剪（对于刚性塑料可使用弓锯）将两孔之间残留的细窄塑料条剪断，形成一个长约5 cm、宽约2 cm的狭长开口。
    3. 在容器另一侧重复步骤1.1.1–1.1.2。
  2. 用尼龙网或疏水膜覆盖上述狭缝（图1A）。
    1. 将孔径为40 μm的尼龙网裁剪成9.5 cm × 8.5 cm的片状，数量与容器数量一致。
    2. 使用高强度工业热熔胶，将尼龙网从容器外侧粘贴，覆盖两个开口，确保织物边缘略有重叠。
    3. 若需阻止液态水通过（例如使用水溶性养分或稳定同位素时），可在尼龙网外层再覆盖一层疏水膜31,32（材料表），该膜允许丛枝菌根真菌菌丝通过，但仅允许水蒸气扩散，不允许液态水透过。
    4. 在容器开口周围及尼龙网的长边处涂抹热熔胶。滚动容器使其与织物贴合，避免烫伤手指。在织物边缘重叠处再加一层胶，然后将边缘压在硬纸板上，确保密封牢固。滚动方向应始终保持一致，该方向即为最终容器在花盆或微宇宙中旋转的方向，以避免重叠的网边因反向受力而嵌入基质中。
    5. 待胶冷却后，使用柔性胶带（如电工胶带）将织物的顶部和底部边缘固定在容器上，防止边缘松脱或撕裂。
  3. 使用与步骤1.2.5相同的胶带，封住每个容器锥形末端侧面的小孔（非底部尖端的孔），以防止根系从容器中长出并进入花盆或微宇宙的其他部分。
  4. 为防止土壤流失同时保证排水，在每个容器底部放入一颗玻璃弹珠。
  5. 对于不涉及任何菌根网络（CMN）形成的对照处理，应使用未改造的实心容器（图1A）。

2. 组装适合容器锥形末端的花盆或微型生态系统

  1. 为确保容器直立且位置固定并具有良好的排水性，将花盆倒置，使盆底朝上。使用弓形锯沿盆底边缘切割，保留一小圈边缘作为支撑。
  2. 聚苯乙烯泡沫的制备
    1. 使用带圆形切割夹具的带锯，将约 36 mm 厚的聚苯乙烯泡沫切割成与花盆底部相同直径的圆形。
    2. 使用台钻和 19 mm 环形锯（不带中心麻花钻头），按照容器将要放置的布局在泡沫上钻孔。
    3. 在目标植株实验中，中心钻一个孔，并在其周围等间距钻孔以放置邻近个体。对于直径为 15.5 cm 的花盆，围绕直径为 11 cm 的圆周，在圆周上等间距（相距 12 mm）钻六个孔（图 1B）。
    4. 在微型生态系统实验中，将孔按六边形或正方形阵列排列（图 1C, D）。

3. 容器和花盆中填充土壤与沙子混合物

  1. 选择合适的土壤混合物，并将野外采集或盆栽培养的丛枝菌根（AM）真菌接种物加入土壤中，方法是将根段（1–2 cm长）剪碎后均匀地与土壤充分混合。将目标土壤与无菌的石英砂或玻璃珠混合，以降低植物可利用的矿质养分浓度。
  2. 将装好土壤的容器置于打孔的泡沫板或微宇宙底部，并用无菌基质填充容器间的孔隙。
  3. 使用漏斗辅助，将低养分的石英砂混合物填入容器之间的空隙，以便填充狭小空间。为确保良好的排水性并模拟土壤质地，可在混凝土搅拌机中将中等粒径砂（如6-20级）与小粒径砂（如30-65级）混合。

4. 在花盆/微宇宙中建立菌根网络

  1. 将所需物种的植物作为“护理”植物预接种到每个容器中，以维持丛枝菌根真菌的生长，使其能够在容器间扩散并建立菌根网络。
  2. 当所有容器中均形成幼苗后，通过剪除地上部分，使每个容器中仅保留一株个体。
  3. 给予 2-3 个月时间，使植物生长并完成菌根网络的建立。

5. 实验植株的建立与处理

  1. 通过播种或移栽的方式将实验植物种植到容器中。若采用播种，需等待所有容器中均出现萌发的幼苗后，再通过剪除地上部的方式去除预处理的护理植物。若采用移栽，则应在移栽实验幼苗前剪除所有预处理植株，以避免产生非预期的竞争效应。
  2. 通过以下两种方式建立菌根网络（CMN）处理：在整个实验期间保持容器位置不变（完整CMN），或每周旋转容器以物理切断在不同容器间延伸的菌丝（切断CMN；图1A）。在切断CMN时，应将每个容器旋转一整周，以避免无意中改变地上部分的相互作用，特别是对向日性植物而言。
  3. 旋转操作后应立即对所有盆栽或微宇宙系统充分浇水，以重新建立间隙基质与容器壁之间的接触。

6. 矿质养分在菌根网络中移动的示踪

  1. 用0.5% 15N标记的KNO3和NH4Cl对邻近植株进行施肥。
  2. 用相同浓度的14N肥料对目标个体进行施肥。

7. 实验的监测与维护

  1. 在实验过程中，应定期（至少每月一次）重新随机化花盆或微宇宙系统的摆放位置。
  2. 每周测量植物生长情况，例如株高或最长叶片长度（针对禾本科植物），以监测生长速度何时开始减缓，因为在植物根系受限之前进行收获至关重要。

8. 实验收获

  1. 剪下所有地上部分组织，并将单株植物放入已标记的信封中，信封上注明其处理方式、花盆或微环境系统编号及位置。
  2. 将地上部分组织在60 °C下烘干至恒重，测定每株植物组织的干重。
  3. 在取出容器并收获根系之前，让土壤自然风干。
  4. 小心地从根系上刷去尽可能多的土壤，并在盛水的容器中或使用孔径为250微米的筛子在缓流水流下冲洗根系。
  5. 让根系空气干燥后称量整个根系的重量。
  6. 随机剪取部分根系，将根段保存于50%乙醇中。染色33后，采用网格线交叉法34对这些根段进行根系定殖程度的定量分析。
  7. 重新称量剩余的根系，将其放入标记好的纸质信封中，在60 °C下烘干以测定干重。使用以下公式计算整个根系的重量：

干重计算公式；生物量分析和植物研究结果的方程。

9. 矿质营养元素与稳定同位素分析

  1. 如果组织量过低，无法满足消化以测定矿质养分浓度的最低要求，则根据重量对幼苗进行排序后，按生物量将其分为“十分位数”（10组）、“八分位数”（8组）、“四分位数”（4组）等组别。
  2. 将叶片样品送至合作实验室进行矿质养分和稳定同位素分析（材料表）。
    1. 使用以下常规表达式描述同位素丰度：
      氮同位素比公式，δ15N计算，同位素分析方程。
      其中 R 代表样品或标准物质（大气氮）的 15N/14N 比值。
    2. 在量化目标植物在切断或完整菌根网络（CMN）处理中吸收的 15N 量时，使用未修改的固体容器处理作为背景 15N 比值的对照，代入以下质量平衡方程：
      氮同位素方程；静态平衡；公式；研究分析；δ15N；环境研究。
      其中 δ15N 表示目标植物、邻近植物以及无菌根网络（CMN）处理中目标植物的同位素丰度，x 表示目标植物从添加了标记的邻近容器中获得的氮所占百分比（以小数形式表示）。δ15NNeighbors 的数值由每个目标植物对应的邻近植物混合样品测得。

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结果

为了确定菌根网络（CMNs）如何通过养分分配影响植物生长表现，我们开展了目标植物实验，种植了占优势地位的草原草本植物Andropogon gerardii Vitman，并设置6个等距邻体，分别具有完整、切断或无菌根网络的条件。我们发现，切断或阻止菌根网络会降低目标植物的地上部分干重（图2），表明完整的菌根网络促进了植物生长。在切断菌根网络和阻止菌根网络的处理中，植物对处理的响应表现相似，说明每周旋转容器一次成功减轻了菌根网络的影响。然而，切断菌根网络的处理可能更适合作为对照，因为在完整和切断菌根网络处理中使用的尼龙网（本实验中其上覆盖了一层疏水膜）可能会影响水分动态，例如带槽容器（无论是否旋转）的土壤比未改造容器的土壤干燥得更快。

在完整的菌根网络（CMN）处理中检测到了竞争作用，即一个个体的生长抑制了附近另一个个体的生长，但在切断CMN或无CMN的处理中未检测到该现象。我...

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讨论

我们的结果证实，采用旋转核心方法能够清晰聚焦于菌根网络（CMNs）在植物地下相互作用中的作用。然而，该实验方案中有几个关键步骤，若被改动，可能会影响检测CMN效应的能力。至关重要的是，容器周围的间隙区域必须填充贫营养的介质。在我们此前一次未成功的旋转核心目标植物实验中，使用番石榴树幼苗时，尽管在存在任意数量邻近植物的情况下，目标植物的生长均显著受到抑制，但并未检测到CMNs对地下竞争的影响，原因可能是整个花盆中矿物质养分的可利用性较高。相比之下，在旋转核心之间使用贫营养介质可确保菌丝必须延伸至相邻容器中——这些容器通常同时含有菌丝和根系（尤其是在使用根系密集的禾草类植物时）。因此，邻近容器中的胞外菌丝与根系直接竞争，并必须将从这些“养分斑块”中获取的矿物质养分在通过CMN相连的植物间进行分配。另一个使地下相互作用可被检测的关键因素是避免地上部分的竞争。我们的番石榴实验表明，当目标植物无邻近植物时，其可利用土壤体积增加所带来的生长优势，在目标幼苗被邻近植物遮荫时几乎完全消失。使用主要垂直生长的禾草类植物，或限制幼苗叶冠的扩展以防止重叠，将有助于减轻地上部分的相互作用。

使用相对刚性的...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢两位匿名审稿人提出的建议。同时感谢众多本科生在制作花盆、微宇宙系统和带槽容器，以及在实验的维护和收获过程中提供的帮助。我们还感谢北中央学院提供的启动资金（资助JW）和现有设施，以及Ashley Wojciechowski为获得北中央学院Richter基金资助本方法相关实验所付出的努力。本研究的部分工作得到了美国国家科学基金会博士论文改进资助（DEB-1401677）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
商用管状幼苗容器（文稿中称为“容器”）Stuewe and Sons, IncRay Leach Cone-tainer ™RLC3U
粗玻璃珠Industrial Supply, Inc.12/20 筛网规格 #1
粗石英砂Florida Silica Sand6/20 50磅袋装无
细玻璃珠Black BeautyBlack Beauty 细磨碎玻璃磨料（50 磅）BB-Glass-Fine
疏水性膜Gore-tex无无
大型商用管状幼苗容器Stuewe and Sons, Inc.Deepot ™D16L
中等粒径石英砂Florida Silica Sand30/65 50磅袋装无
尼龙网筛Tube Lite Company, Inc.丝网印刷网布LE7-380-34d PW YEL 60/62 SEFAR LE PECAP POLYESTER
土壤与叶片养分分析机构堪萨斯州立大学土壤检测实验室无无
稳定同位素核心设施迈阿密大学无无

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