本方案介绍了一种标准化的体外培养VX2细胞的方法，并建立了在兔体内具有腹膜后淋巴结转移的子宫内膜癌原位VX2模型。原位子宫内膜癌模型对于研究新型影像学技术在淋巴结转移诊断中的临床前应用具有重要意义。
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摘要
摘要
子宫内膜癌是北美最常见的妇科恶性肿瘤，其全球发病率正在上升。治疗方案包括手术，是否联合辅助治疗则取决于通过淋巴结切除术确定的淋巴结受累情况。淋巴结切除术是一种并发症较多的手术，且在许多患者中并未显示出治疗获益，因此需要一种新的方法来诊断淋巴结转移。为了测试新型成像剂，亟需建立一种可靠的伴有腹膜后淋巴结转移的子宫内膜癌模型。文献中已多次报道VX2子宫内膜癌模型，但在模型建立方法上存在显著差异。此外，此前仅使用体内传代的VX2细胞构建该模型，尚无研究报道使用体外培养的VX2细胞构建此模型。本文介绍了一种标准化的手术方法和术后监测方法，用于建立VX2子宫内膜癌模型，并首次报道了使用体外培养的VX2细胞成功构建该模型。
引言
子宫内膜癌，即子宫内膜的癌症，是全球第二常见的妇科恶性肿瘤，在发达国家则是最常见的恶性肿瘤1。子宫内膜癌的发病率持续上升，2005年至2013年间每年增长2.3%，同期死亡率也相应增加了2.2%1,2,3。淋巴结转移的诊断至关重要，因为阳性淋巴结的存在是生存率的强烈负向预测因子4,5,6,7，并可指导辅助治疗的实施8,9,10,11,12,13。目前，淋巴结转移通过手术切除盆腔和腹腔主要血管表面的淋巴组织进行诊断。该手术称为淋巴结清扫术，由于两项大型临床试....
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方案
深部腹壁缝合：确定腹膜切口的顶端，用组织镊夹住腹膜、腹直肌和筋膜。所有动物实验均在大学健康网络（University Health Network）动物资源中心（ARC）批准的设施中进行，并遵循经批准的动物使用与护理方案（AUP #3994/#4299）。VX2细胞系由大学健康网络Dr. Aken实验室提供。
1. 体外VX2细胞系的建立
- 从兔股四头肌中收获VX2肿瘤，并移植至小鼠 flank 部位生长。
- 解冻冷冻的 VX2 肿瘤组织块（1 cm × 1 cm），在培养皿中用手术刀片切碎，分次加入少量 Hanks 平衡盐溶液（HBSS），通过 70 µm 滤网过滤，确保所有细胞均被滤过，最终体积为 1 mL。
- 计数细胞，并用0.9%磷酸盐缓冲液稀释至浓度为1 × 107/mL，并置于无菌管中冰上保存。
注意：肿瘤组织块由实验室合作者提供，来源于此前在兔股四头肌中传代培养的VX2肿瘤。 - 使用2-5%吸入式异氟烷对一只雌性新西兰白兔（体重2.5–3.5 kg）进行麻醉，去除注射部位的毛发，并用聚维酮碘溶液清洁注射部位。注射500 µL制备好的VX2细胞悬液（5 × 10⁶细胞/500 µL）6 细胞/mL）注入兔的股四头肌中。从第10天开始，临床上监测兔的肿瘤生长情况。
- 在肿瘤直径达到1-1.5 cm（使用游....
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结果
使用28只兔子建立子宫内膜癌模型。实验时兔子的平均体重为2.83 kg（2.71–3.58 kg）。其中21只兔子成功长出子宫肿瘤，模型总体成功率为75%。在将子宫缝合步骤纳入实验方案之前，成功率为57%，而加入子宫缝合后成功率提升至81%。子宫缝合是在第7只兔子之后加入实验方案的。th 兔模型因初始建模成功率较低而进行了优化。采用培养的VX2细胞建模尝试8只兔，成功5例（成功率63%）；采用体内传代扩增的VX2细胞建模尝试22只兔，成功16例（成功率73%）。在使用体内传代VX2细胞建立的模型中，细胞接种剂量为5 × 106 每只动物每个子宫角均进行了操作，接种至实验的平均天数为29天（范围24–31天）。在由培养的VX2细胞建立的模型中，采用递增剂量方案确定合适的接种剂量。接种剂量为2.5 x 106 细胞和 5 x 106 每子宫角细胞数的尝试未获成功，且剂量为 10 x 106 每子宫角细胞数在一只兔子中接种成功，然而从接种到实验期间的57天内，肿瘤生长缓.......
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讨论
本文报道了一种建立VX2子宫内膜癌模型的标准化手术方法，并首次报道了使用培养的VX2细胞构建该模型。75%的成瘤率低于文献中先前报道的100%35,37,53,56；然而，病理证实的淋巴结转移率达到90%，与该模型既往研究结果一致35,53。
加入子宫缝合步骤后，模型的成功率从57%显著提高至81%，我们认为该步骤是手术方案中不可或缺的一部分。最初未进行子宫缝合，是由于文献中关于缝合应用的报道存在矛盾，且存在双侧子宫动脉结扎可能导致子宫角去血管化的担忧。鉴于增加子宫缝合后移植成功率显著提高，我们推测细胞悬液从注射部位泄漏可能是早期成功率较低的原因之一。将细胞悬液在解剖结构上限制于子宫角的一小部分区域，可确保高浓度.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由特里·福克斯研究所（PPG#1075）、加拿大卫生研究院（基础项目资助 #154326）、加拿大癌症协会研究所（704718）、加拿大自然科学与工程研究理事会、加拿大创新基金会以及玛格丽特公主癌症基金会资助。
我要感谢Marguerite Akens博士提供了建立初始VX2模型所需的原始VX2细胞以及冻存的VX2肿瘤组织块。感谢Marco DiGrappa协助开展初始的VX2细胞培养实验，感谢Lili Ding在VX2细胞培养方面的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 11刃手术刀，无菌，一次性 | Aspen Surgical (VWR) | 80094-086 | |
| 22号耳静脉导管 | CDMV | 14332 | |
| 3-0 可吸收多股缝合线（Polysorb） | Covidien | 356718 | |
| 3-0 编织可吸收缝合线（Polysorb） | Covidien | 356718 | |
| 70 µm 细胞筛，独立包装，尼龙材质 | Falcon | 352350 | |
| 乙酰丙嗪（Atravet） | CDMV | 1047 | |
| 聚维酮碘皂液（聚维酮碘 7.5%） | CDMV | 4363 | |
| 聚维酮碘溶液（聚维酮碘 10%） | UHN Stores | 457955 | |
| 丁丙诺啡 | McGill University | ||
| 头孢唑林 | UHN 住院药房 | 无需货号 | |
| 氯己定溶液 | CDMV | 119872 | |
| Corning BioCoatCellware，I型胶原蛋白，100 mm 培养皿 | Corning | 354450 | 品牌不重要 |
| Corning BioCoatCellware，I型胶原蛋白，24孔板 | Corning | 354408 | 品牌不重要 |
| Corning BioCoatCellware，I型胶原蛋白，6孔板 | Corning | 354400 | 品牌不重要 |
| Corning Matrigel 基底膜基质，*无LDEV，10 mL | Corning | 354234 | |
| DMEM/HAM F12 1:1 | Life Technologies | 11320 | 品牌不重要 |
| DMSO | Caledon Lab Chem | 1/10/4100 | |
| 恩诺沙星（Baytril 注射剂） | CDMV | 11242 | |
| Falcon 管 | Corning Centri-Star | 430828 | |
| 胎牛血清，经鉴定，加拿大来源，500 mL | Life Technologies | 12483020 | 品牌/来源不重要 |
| 异氟烷 | UHN 住院药房 | 无需货号 | |
| 碘海醇造影剂 | GE Healthcare | 407141210 | |
| 美洛昔康（Metacam 0.5%） | CDMV | 104674 | |
| 生理盐水 | 本院品牌（UofT 医药库） | 1011 | |
| PBS | Multicell 或 Sigma | 331-010-CL 或 D8537-500mL | |
| 青霉素/链霉素（100 mL；10000 U 青霉素，10000 µg 链霉素） | Corning-Cellgro | CA45000-652 | |
| 无菌Hanks平衡盐溶液（无Ca++，无Mg++，无酚红） | T.C.M.F（Bristow博士） | 2011年1月28日 | |
| 外科胶（组织粘合剂） | 3M Vetbond | 14695B | |
| 胰蛋白酶（0.25%），蛋白质组学级 | Sigma | T-6567-5X20UG | |
| 胰蛋白酶-EDTA，0.05%，100 mL | Wisent Inc | 325-542-EL | 品牌不重要 |
参考文献
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136, E359-E386 (2015).
- Canada, S. Canadian Cancer Statistics Special topic: Pancreatic canc....
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重印与许可
