方法文章

用于量化 iPSC 衍生内皮孕激素的血管生成潜力的体外 3D 模型和计算管道

DOI：

10.3791/59342

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2019年5月13日

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1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin

本文内容

摘要

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来自诱导多能干细胞(iPSC-EP)的内皮祖子有可能彻底改变心血管疾病的治疗,并能够创建更忠实的心血管疾病模型。本文介绍了iPSC-EP在三维(3D)胶原蛋白微环境中的封装,并对这些细胞的血管生成电位进行了定量分析。

摘要

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诱导多能干细胞(iPSCs)是一种患者特异性增殖细胞源,可分化成任何体细胞类型。双能内皮祖细胞(EP),可以分化成组装成熟、功能性血管所必需的细胞类型,从胚胎和诱导多能干细胞中提取。然而,这些细胞在三维环境中尚未得到严格评估,其血管生成潜力的定量测量仍然难以实现。在这里,首先概述了通过荧光激活细胞分类生成和分离 iPSC-EP,然后介绍了 iPSC-EP 在胶原蛋白水凝胶中的封装和培养。这种细胞外基质(ECM)模拟微环境鼓励强健的血管反应;血管网络形成后一个星期的文化。使用开源软件量化此血管反应的计算管道的创建进行了划定。此管道专为保留毛细管丛的 3D 体系结构而设计,以以最少的用户输入可靠地识别分支数、分支点和总网络长度。

引言

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人类脐带静脉内皮细胞(HUVECs)和其他原发内皮细胞类型已经使用了20年,以模型血管发芽和在体外发育1。这种血管平台有望阐明心血管疾病的分子和组织级机制,并可能为原始血管网络2、3的发展提供生理见解。尽管血管建模领域取得了显著进展,但能够定量建模和评估生理血管发育的"金本位"测定仍然遥遥无期。大多数已公布的协议没有充分重述血管利基,以鼓励成熟、功能性血管的形成,或者没有方法在三维上定量比较评估细胞类型的血管生成电位(3D)。

许多目前的血管模型是有限的,他们的能力,模仿生理血管利基。最常用的体外平台之一是胶状蛋白混合物的管形成测定。简单地说,HUVECs被播种为单细胞,在薄薄的凝胶层上,由从肉瘤细胞外基质(ECM)中采集的蛋白质组成;在一至两天内,HUVECs自组装成原始管4。然而,这个过程发生在双维(2D)和内皮细胞(ECs)用于这个测定不形成封闭的,空心流明,从而限制了这些研究的生理意义。最近,EC和支持细胞(例如,中生干细胞(MSCs)和围细胞)在模拟原生ECM纤维结构的3D微环境中共同培养,如胶原蛋白或纤维蛋白水凝胶5。为了模拟这种微环境下的血管发育,通常采用涂有EC的聚合物珠

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方案

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1. 培养介质和涂层解决方案的准备

  1. 要制备体外内丁涂层溶液,在Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中稀释体外奈丁1:100。
    注意:一旦稀释,不建议存储此解决方案供将来使用。
  2. 从制造商处收到无苯酚红、生长因子减少的胶状蛋白混合物(见材料表)后,在4°C的冰上解冻,直到混合物透明且流畅。将混合物放在冰上,放在层流罩中,将混合物75 μL移液器放入1.8 mL微离心管中,并立即在-20°C冷冻。这些等分可以存储长达一年。
    注意:这种胶状蛋白质混合物在室温下保持时变得非常粘稠,并在较高温度下凝固。保持此解决方案冷。
  3. 要准备这种混合物进行涂层,在冰上解冻 75 μL 等分,用 6 mL 的冰冷 Dulbeco 的改性鹰介质:营养混合物 F-12 (DMEM/F12) 稀释。这个准备好的体积足以涂覆12孔板。
  4. 在超纯水中制备抗坏血酸镁-2-磷酸盐(一种白色冻干粉)的100mg/mL库存溶液,在10 mL玻璃闪烁小瓶中加入500毫克粉末至5mL水中。用搅拌棒搅拌,直到溶液完全透明(这可能需要一个小时)。此溶液可在-20°C下储存长达一年。
  5. 在15mL锥形离心管中溶解1.9928 ml二甲基亚硫酸盐(DMSO)中的10mg冷冻粉,在37°C珠(或水)浴中加热,直到溶液透明。创建CHIR99021(CHIR)10 mM库存。与1.8 mL微离心管中的无二分,在-20°C下储存长达一年。
    6. ....

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结果

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分化(图1),FACS和iPSC-EP封装在胶原蛋白水凝胶中,细胞通常会保持四舍五入24小时,然后开始迁移并形成初始流明。经过大约6天的培养后,当用明场显微镜观察时,水凝胶中可以看到一个原始的毛细管丛(图2)。在共聚焦显微镜(电影1,补充电影1)上成像固定、染色的含细胞水凝胶后,预先处理的图像将转换为骨架,从而能够分析网络的整体长度和连通性。然后,这些定量测量可用于确定哪些条件最适合产生强大的血管网络。

该协议允许开发一个强大的三维毛细管丛,对局部物理和化学线索作出反应。在以往的工作中,这种网络形成已被证明对基质密度、基质刚度、基质金属洛氏素抑制以及各种血管原性线粒体的类型和浓度20、23敏感。<.......

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讨论

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该协议涉及三种细胞培养基基中细胞的长期培养:E8、LaSR巴塞尔和EGM-2。因此,应非常小心,适当地消毒所有材料。此外,在实验室的层流罩中工作时,应始终佩戴实验室外套和乙醇清洁手套。建议经常检测支原体污染;如果在 iPSC 培养期间观察到大量碎屑或观察到分化效率突然下降,则支原体污染是可能的原因。使用该协议生成的 iPSC-EP 往往会沉积大量的 ECM,从而延长分离时间,并导致单个细胞悬浮液分离成小团块。不要使用胰蛋白酶-EDTA (0.25%),因为溶液可能会破坏 iPSC-EP 上的 CD34 表位。然而,使用胶原酶/消血液进行治疗可以去除沉积的ECM,并借助标准细胞分离溶液缓解分离。在广泛分离后,一些小团细胞和ECM可能仍然存在;用 P100 移液器尖端清除这些块块,因为它们可能会堵塞细胞滤网或干扰 FACS。

多能干细胞对分离敏感,在单细胞悬浮液中会经历凋亡,除非在培养基24中加入ROCK抑制剂(通常为Y-27632)。iPSC-EP 对分离也敏感;包括Y-27632在10μM前24小时的培养是增加细胞生存和增殖的必要条件.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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这项工作得到了美国心脏协会(授予J.Z.的15SDG25740035号)、美国国家卫生研究院国家生物医学成像和生物工程研究所(NIBIB)的支持(授予C.C.的赠款号EB007507),以及再生康复研究与培训联盟(AR3T,授予编号1 P2C HD086843-01,授予J.Z.)。我们要感谢Jeanne Stachowiak教授(德克萨斯大学奥斯汀分校)就共聚焦显微镜提供的技术建议。我们还感谢与塞缪尔·米赫利奇(德克萨斯大学奥斯汀分校)、艾丽西亚·艾伦博士(德克萨斯大学奥斯汀分校)、朱莉·雷特莱夫斯基博士(适应性生物技术)和莱昂·贝兰博士(范德比尔特大学)的讨论,以表达他们对三维网络的计算分析。最后,我们感谢鲍小平博士(加州大学伯克利分校)关于将iPSC区分为iPSC-EP的建议。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
µ-玻片血管生成IbidiN/A带侧壁的扁平玻璃底组织培养板可实现轻松的共聚焦成像
96 孔、圆底、超低附着度微孔板，无菌Corning7007防止载有细胞的胶原蛋白水凝胶与细胞培养皿结合
AccutaseSTEMCELL Technologies7920温和的细胞分离溶液;不降解对 FACS
Advanced DMEM/F12Thermo Scientific12634010iPSC-EP 分化的基础培养基。
巴恩斯特德 GenPure xCAD Plus Thermo Fisher Scientific50136165水净化系统;其他可以很容易地替代
血清白蛋白溶液，7.5% 的 DPBS 溶液，无菌过滤，BioXtra，适用于细胞培养Fisher ScientificA8412当 FAC 分选
CD34-PE 时保持细胞活力，人（克隆：AC136）Miltenyi Biotec130-098-140抗体用于 FAC 分离 iPSC-EPs
CHIR99021LC LaboratoriesC-6556诱导多能干细胞形成中胚层
I型胶原 大鼠尾巴 高蛋白 100 mgVWR3542493D微环境的主要成分
锥形离心管 （15/50 mL）Fisher Scientific14-959-49D/A用于储存和混合相对大体积的试剂和细胞培养基
DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）Thermo Fisher ScientificD1306复染和观察细胞核
DMEM/F12Thermo Fisher Scientific11320-082用于基质胶的稀释和多能干细胞的解冻
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS）ThermoFisher14190-250洗涤单层培养物
EDTASigma-AldrichE8008用于多能干细胞集落的传代和防止FAC分选时的细胞聚集
内皮细胞生长培养基 2PromoCellC-22011促进内皮细胞活力和增殖
Essential 8 培养基Thermo Fisher ScientificA1517001  用于维持多能干细胞
甘氨酸，BioUltra，用于分子生物学，>=99.0% （NT）Sigma-Aldrich50046中和剩余的去污剂
L-抗坏血酸 2-磷酸倍半镁盐水合物，>=95%Sigma-AldrichA8960iPSC-EP 分化培养基的成分
MATLABMathWorks1.8.0_152多范式数值计算环境（大多数学术机构免费提供）
基质胶基质 GFR 酚射频小鼠 10 mL（凝胶状蛋白质混合物）Fisher Scientific356231用 DMEM/F12 稀释，包被板以进行 iPSC-EP 分化
培养基-199 10XThermo Fisher Scientific1825015用于平衡最终水凝胶渗透压和 pH 值
离心管 （1.7 mL）VWR87003-294储存少量试剂
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）Sigma-AldrichP3813免疫染色液的主要成分
青霉素-链霉素 （10,000 U/mL）Thermo Fisher Scientific15140122分选后使用的抗生素，以去除 FACS 仪器中可能的污染
重组人 VEGF 165 蛋白R&D Systems293-VE刺激内皮细胞增殖和肾小管生成的有丝分裂原
罗丹明鬼笔环肽Themo Fisher ScientificR415鉴定 F-肌动蛋白沉积，从而勾勒出血管网络的边界
Triton X-100（非离子表面活性剂）Sigma-AldrichX-100用于温和透化细胞的去污剂
Tween-20（乳化试剂）Fisher ScientificBP337增加添加抗体的结合特异性
VE-钙粘蛋白 （F-8）Santa Cruz Biotechnologysc-9989 鉴定胶原水凝胶中的 3D 内皮腔
玻连蛋白ThermoFisherA14700用于维持多能干细胞
Y-27632SelleckS1049在解离和重新接种时保持多能干细胞和 iPSC-EP 的活力
至关重要的细胞外表位 牛微量™

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, K., Lin, R. -Z., Melero-Martin, J. M. Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).
  2. Kant, R. J., Coulombe, K. L. K.

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2 ROCK Y 27632

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