一种用于量化iPSC来源内皮祖细胞成血管潜能的体外三维模型及计算分析流程

摘要

由诱导性多能干细胞（iPSC-EPs）衍生的内皮祖细胞有望彻底改变心血管疾病的治疗方法，并可用于构建更贴近真实情况的心血管疾病模型。本文介绍了将iPSC-EPs包封于三维（3D）胶原微环境中的方法，以及对这些细胞血管生成潜能的定量分析。

摘要

诱导性多能干细胞（iPSCs）是一种患者特异性的、具有增殖能力的细胞来源，可分化为任何类型的体细胞。双潜能内皮祖细胞（EPs）能够分化为组装成熟且具有功能的脉管系统所需的细胞类型，已从胚胎干细胞和诱导性多能干细胞中成功获得。然而，这些细胞在三维环境中的表现尚未得到系统评估，其血管生成潜能也缺乏定量衡量方法。本文首先概述了通过荧光激活细胞分选技术生成和分离iPSC-EPs的方法，随后描述了将iPSC-EPs包封于胶原蛋白水凝胶中进行培养的过程。这种模拟细胞外基质（ECM）的微环境可有效促进强烈的血管生成反应；在培养一周后即可形成血管网络。文中还详细阐述了一种利用开源软件构建的计算分析流程，用于定量评估该血管生成反应。该分析流程专门设计用于保持毛细血管网的三维结构完整性，可在最少人工干预的情况下，准确识别分支数量、分支点数量以及网络总长度。

引言

人脐静脉内皮细胞（HUVECs）及其他原代内皮细胞类型已被用于体外模拟血管出芽和发育过程长达二十年¹。此类血管模型有望揭示心血管疾病的分子和组织水平机制，并可能为原始血管网络的发育提供生理学见解^2,3。尽管血管建模领域已取得显著进展，但仍缺乏一种能够定量模拟并评估生理性血管发育的“金标准”检测方法。大多数已发表的实验方案未能充分重建血管微环境以促进成熟、功能性血管的形成，或缺乏在三维（3D）条件下对所评估细胞类型血管生成潜能进行定量比较的方法。

目前许多血管模型在模拟生理性血管微环境方面存在局限性。最常用的体外平台之一是基于明胶状蛋白质混合物的管状结构形成实验。简而言之，将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）以单细胞形式接种于一层薄凝胶上，该凝胶由小鼠肉瘤细胞外基质（ECM）中提取的蛋白质构成；在1至2天内，HUVECs会自组装形成原始管状结构⁴。然而，该过程发生在二维（2D）环境中，且该实验所用的内皮细胞（ECs）无法形成封闭的中空管腔，从而限制了这些研究的生理相关性。近年来，研究人员已将内皮细胞与支持性细胞（如间充质干细胞（MSCs）和周细胞）共培养于三维（3D）微环境，以模拟天然ECM的纤维结构，例如胶原蛋白或纤维蛋白水凝胶⁵。为在该微环境中模拟血管发育过程，通常使用表面包被内皮细胞的聚合物微球⁶。通过添加外源性生长因子，或由嵌入水凝胶中的其他细胞分泌的生长因子，可诱导包被在聚合物微球表面的内皮细胞出芽并形成单个管腔；随后可计算出芽和血管的数量及直径。然而，这些出芽结构为单一生长，无法形成生理条件下所见的封闭且相互连接的网络结构，因此更类似于肿瘤血管模型。微流控装置也被用于模拟血管微环境，并促进含内皮细胞的水凝胶中血管结构的形成^7,8。通常通过在循环培养基中建立促血管生成因子浓度梯度，以诱导内皮细胞迁移和出芽。发育血管管腔中的内皮细胞对微流控装置中流体流动所产生的剪切应力敏感；因此，这类微流控装置能够模拟静态模型无法实现的关键生理参数。然而，这些装置需要昂贵的微加工技术。

最重要的是，所有三种血管模型（二维、三维、微流控）几乎都使用原代内皮细胞（ECs）以及原代支持性细胞类型。原代细胞无法被开发为有效的心血管治疗手段，因为这些细胞在植入后会引发免疫反应；此外，人脐静脉内皮细胞（HUVECs）及其他类似的原代细胞类型并不具有患者特异性，也无法反映具有遗传倾向或已有健康状况（如糖尿病）的患者体内出现的血管异常。诱导多能干细胞（iPSCs）在过去十年中作为一种具有患者特异性且可增殖的细胞来源崭露头角，可分化为人体内所有体细胞⁹。特别是已有研究发表详细方案，描述了由iPSCs衍生的内皮祖细胞（iPSC-EPs）的生成与分离方法^10,11；iPSC-EPs具有双潜能性，因此可进一步分化为内皮细胞和血管平滑肌细胞/周细胞，而这正是成熟且功能性血管系统的基本组成单元。目前仅有一项研究令人信服地阐述了在三维微环境中由iPSC-EPs形成初级毛细血管网的过程¹²；尽管该研究对于理解iPSC-EPs在天然和合成水凝胶中的组装与分化至关重要，但并未对所形成血管网络的拓扑结构进行定量比较。另一项近期研究则利用聚合物微珠模型比较了HUVECs与iPSC来源的内皮细胞的出芽能力⁵。因此，迫切需要进一步阐明调控iPSC-EPs在三维微环境中血管发生的物理与化学信号机制，并明确这些细胞是否适用于缺血性疾病的治疗及心血管疾病建模。

在过去十年中，已开发出多种开源计算流程和骨架化算法，用于量化和比较血管网络的长度与连通性。例如，Charwat 等人开发了一种基于 Photoshop 的分析流程，用于提取来源于脂肪源性干细胞与血管外生长的内皮细胞在纤维蛋白基质中共培养所形成的血管网络的滤波后二值化图像^13,14。目前应用最广泛的拓扑比较工具可能是 AngioTool，该程序由美国国家癌症研究所在线发布¹⁵；尽管该程序被广泛采用且具有良好的记录保真度，但其仅限于对二维层面的类血管结构进行分析，其他程序如 AngioSys 和 Wimasis 也存在相同的维度限制¹⁶。诸如 Imaris、Lucis 和 Metamorph 等功能强大的软件套件已被开发用于分析工程化微血管网络的拓扑结构；然而，这些软件套件对大多数学术实验室而言成本过高，且其源代码不公开，可能限制最终用户根据特定应用需求对算法进行自定义。3D Slicer 是一款开源的磁共振成像/计算机断层扫描软件包，包含一个血管建模工具包，可有效分析三维血管网络的拓扑结构¹⁷；然而，该分析依赖于用户手动设定网络的端点，在处理大规模数据集时可能变得繁琐，并可能受到用户潜意识偏倚的影响。本文详细描述了一种可量化三维血管网络的计算流程。为克服上述局限性，该开源计算流程利用 ImageJ 对获取的共聚焦图像进行预处理，将三维体积数据导入骨架分析器中。该骨架分析器采用并行中轴细化算法，最初由 Kerschnitzki 等人开发，用于分析骨细胞网络的长度与连通性¹⁸；该算法可有效应用于表征工程化微血管网络的长度与连通性。

总体而言，本方案概述了在三维微环境中构建微血管网络的方法，并提供了一个开源且无用户偏差的计算流程，可便捷地比较iPSC-EPs的血管生成潜能。

方案

1. 培养基和包被溶液的制备

1. 配制玻连蛋白包被溶液时，将玻连蛋白以1:100的比例用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）稀释。
   注意：稀释后不建议将此溶液保存以供后续使用。
2. 从生产商处收到无酚红、生长因子减少的胶状蛋白混合物（见材料表）后，在4 °C冰上解冻，直至混合物变为透明且呈流动状态。在超净台中保持该混合物处于冰上，用移液器将75 μL混合物转移至1.8 mL微量离心管中，并立即在-20 °C下冷冻。这些分装样品可保存长达一年。
   注意：该胶状蛋白混合物在室温下会变得非常黏稠，并在较高温度下凝固。请始终保持该溶液处于冰冻状态。
3. 为包被准备该混合物时，将75 μL分装样品在冰上解冻，并用6 mL冰冻的杜氏改良伊格尔培养基：营养混合物F-12（DMEM/F12）稀释。此体积足以包被一块12孔板。
4. 配制100 mg/mL的抗坏血酸镁-2-磷酸（一种白色冻干粉末）储备液：在10 mL玻璃闪烁瓶中，将500 mg粉末加入5 mL超纯水中，用磁力搅拌器搅拌至溶液完全透明（可能需要长达一小时）。该溶液可在-20 °C下保存长达一年。
5. 配制CHIR99021（CHIR）的10 mM储备液：在15 mL锥形离心管中，将10 mg冻干粉末溶于1.9928 mL二甲基亚砜（DMSO）中，并在37 °C金属珠（或水浴）中加热至溶液透明。分装至1.8 mL微量离心管中，在-20 °C下可保存长达一年。
6. 配制ROCK抑制剂（ROCKi）Y-27632的10 mM储备液：在15 mL锥形离心管中，将10 mg冻干粉末溶于3.1225 mL二甲基亚砜（DMSO）中，并在37 °C金属珠（或水浴）中加热至溶液透明。分装至1.8 mL微量离心管中，在-20 °C下可保存长达一年。
7. 配制Essential 8（E8）培养基时，解冻冻存的添加剂，加入500 mL基础培养基瓶中，过滤除菌。该溶液可在4 °C下保存长达两周。
   注意：切勿将此培养基在37 °C下预热，因为培养基配方中的蛋白质在长期使用后可能降解。使用前应将培养基在室温下放置15至30分钟。
8. 配制分选缓冲液：将1.33 mL的7.5%牛血清白蛋白（BSA）DPBS溶液和200 μL的0.5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）加入48.5 mL DPBS中，最终得到含0.5% BSA和2 mM EDTA的溶液。
9. 配制LaSR基础培养基：将300 μL的100 mg/mL抗坏血酸镁-2-磷酸和5 mL GlutaMAX加入500 mL Advanced DMEM/F12中。该溶液可在4 °C下保存长达一个月。
10. 配制内皮细胞生长培养基-2（EGM-2）：解冻添加剂并加入500 mL基础培养基瓶中。该溶液可在4 °C下保存长达一个月。
11. 配制封闭缓冲液：将500 mg冻干牛血清白蛋白（BSA）和50 μL乳化试剂（见材料表）加入48 mL DPBS中。在37 °C下孵育至少15分钟，以确保BSA不会聚集并从溶液中析出。

2. iPSC的解冻、培养与传代

1. 在解冻冻存的iPSC冻存管之前，用1 mL按步骤1.1所述配制的玻连蛋白溶液包被6孔板中的一个孔。室温孵育1小时。在加入E8培养基前，切勿让包被液干燥。
2. 解冻iPSC时，从液氮储存容器中取出一支冻存的iPSC冻存管，在37 °C水浴中解冻至仅剩少量冰晶。小心地（逐滴）将解冻后的管内容物转移至含有8 mL预冷的DMEM/F12培养基的15 mL锥形离心管中。再用1 mL预冷的DMEM/F12培养基冲洗冻存管，以尽量减少细胞损失。在300 × g条件下离心5分钟。
3. 离心过程中，吸除玻连蛋白溶液，并向孔中加入1 mL按步骤1.6所述配制的E8培养基。随后，移除离心管中的DMEM/F12上清液，将沉淀用1 mL E8培养基重悬。将细胞转移至新包被的孔板中，接种时务必轻轻振荡悬液，防止细胞集落聚集。
4. 解冻后通常会出现大量细胞死亡。次日早晨更换培养基，弃去旧液并加入新鲜E8培养基。
   注意：即使在最佳条件下，iPSC在冻存复苏后也往往恢复不佳。建议将接近汇合的6孔板细胞冻存，以备将来接种单个6孔板使用。细胞恢复的前2–3天内出现细胞碎片属于正常现象。
5. 每日更换E8培养基，直至细胞达到传代所需状态（70%–80%汇合度）。
6. 进行传代时，首先准备玻连蛋白包被的孔（如步骤2.1所述）。
   1. 当玻连蛋白包被的孔准备就绪（约1小时后），吸除待传代孔中的E8培养基，用1 mL DPBS洗涤两次。加入1 mL 0.5 mM EDTA，在37 °C孵育5–7分钟。孵育期间，吸除新包被孔中的玻连蛋白溶液，并加入1–2 mL E8培养基。
   2. 移除待传代孔中的EDTA溶液，通过加入1 mL E8培养基轻柔冲洗1–2次使细胞集落脱落。将75–200 μL细胞悬液转移至新包被并含有E8培养基的孔中，轻轻振荡培养板以确保细胞均匀分布，立即放入培养箱中。
      注意：iPSC集落脱落的孵育时间因细胞系而异；建议使用本方案的研究人员在获得或建立新的iPSC细胞系并充分扩增后，测试不同孵育时间。通常，接种75 μL细胞悬液可使传代间隔约为4天；接种150 μL或更多则传代间隔缩短至2–3天。

3. 诱导多能干细胞来源的内皮祖细胞的生成（图1）。

1. 在维持iPSCs培养时，应确保细胞集落结构紧密，且培养物中分化细胞数量较少。若集落开始相互接触，则细胞可能已过于密集，需立即进行传代。
2. 当诱导多能干细胞（iPSCs）融合度达到70%–80%时，用凝胶状蛋白混合物（按1.2/1.3步骤制备）包被24孔板。每孔加入250 μL该混合物，室温孵育1小时。
3. 在上述1小时孵育期间，从冰箱和冷冻柜中分别取出E8培养基和Y-27632。待E8培养基和Y-27632恢复至室温后，在15 mL圆锥形离心管中，将13 μL的10 μM Y-27632加入13 mL E8培养基中，配制E8 + ROCKi。
4. 从iPSC孔中移除E8培养基，用1 mL DPBS洗涤两次，然后在37 °C下用0.5 mM EDTA孵育5–7分钟。孵育结束后，移除EDTA，并用含ROCKi的1 mL E8培养基配合P1000移液器枪头快速吹打细胞，使其解离为单细胞悬液。
5. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。对于可能含有数百万个iPSC的悬液，取20 μL细胞悬液加入180 μL台盼蓝溶液中。确定单细胞悬液中的总细胞数量。
6. 转移 0.432 x 10⁶ 至 1.296 × 10⁶ 细胞（10⁴ 至 3 × 10⁴ 细胞/厘米²²将细胞悬液加入剩余的 E8 + ROCKi 培养基中。去除新包被的12孔板上的凝胶状混合物涂层，每孔加入 500 μL 细胞悬液，确保细胞分布均匀，无小团块形成。
   注意：该密度范围最适合CD34阳性细胞的分化；然而，这些接种密度依赖于细胞系，可能需要本方案使用者根据具体情况进行优化。
7. 培养24小时后，弃去原培养基，加入500 μL新鲜E8培养基。在相同条件下继续孵育24小时。
8. 移除E8培养基，更换为添加了6-12 μM CHIR99021的LaSR基础培养基。此时间点定义为分化第0天（D0）。培养24小时后，更换为相同的细胞培养基。
   注意：如前所述，该培养基中添加的 CHIR99021 用量取决于所使用的 iPSC 细胞系。请测试一系列 CHIR99021 浓度以确保获得最佳结果。
9. 孵育 CHIR99021 48 小时后，更换为 1 mL LaSR 基础培养基。
10. 每天更换培养基，加入 2 mL LaSR 基础培养基，持续额外 2-3 天。在此时间点（分化第 5 天），这些细胞中有相当比例将表达 CD34，可被鉴定为内皮祖细胞。该方案的示意图及代表性结果如下所示 图1 并由首次发表该方法的研究人员进行了完整描述 ^11,19.
    注意：这些内皮祖细胞可进一步沿内皮细胞系分化（35%–99%），或沿平滑肌细胞系分化（1%–65%）。分化效率因分化过程中所使用的细胞外基质（ECM）包被类型及细胞培养基的不同而有所差异。 ²⁰.

4. 内皮祖细胞的流式细胞术分析

1. 在解离 D5/D6 分化细胞之前，按照步骤 1.8 所述配制分选缓冲液，并置于冰上保存。
2. 将分化后的细胞在每孔 250 μL 细胞解离液中（见材料表）于 37 °C 孵育 10 分钟。
3. 使用 P1000 移液器枪头将细胞在解离液中吹打成单细胞悬液。将细胞与解离液的混合物收集至 15 mL 圆锥形离心管中，以 300 × g 离心 5 分钟。
4. 弃去上清液，加入 200 μL 冰冷的分选缓冲液（按步骤 1.7 所述配制），重悬细胞。向细胞悬液中加入 5 μL 浓缩的 CD34-PE 抗体，于 4 °C 孵育 10 分钟。
5. 用 5 mL 冰冷的分选缓冲液重悬细胞，通过带有 40 μm 滤帽的细胞筛过滤后，置于分选仪上进行分选。
6. 在相应的荧光通道中，对未标记荧光抗体的 10,000 个细胞进行分选。设定一个高荧光强度的门控区域，确保该区域内不包含这 10,000 个细胞（图 1D），作为阴性对照。
7. 运行含有经荧光标记的 iPSC-EPs 的样品并开始分选。CD34 在这些内皮祖细胞中高表达，可轻松与主细胞群分离。分选完成后，将收集液转移至 15 mL 圆锥形离心管中，以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
   注意：如果收集管体积大于微量离心管（例如许多流式细胞术方案中常用的 5 mL 聚苯乙烯管），则将分选后的细胞沉淀用 1 mL 分选缓冲液重悬，转移至微量离心管中，以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
   1. 可选步骤：如需进一步表征 iPSC-EPs，可在加入 CD34-PE 的同时加入其他一抗（例如 CD31-APC），并确保不同荧光通道之间的串扰最小化。

5. 含iPSC-EP的胶原蛋白水凝胶的包封与长期培养

1. 在1.8 mL微量离心管中，加入40 μL的10倍浓缩的Medium 199和400 μL内皮细胞生长培养基（EGM-2），并添加10 μM Y-27632，配制接种培养基，然后将离心管置于冰上。
   注意：尽管在干细胞培养及分化细胞维持过程中不建议使用抗生素，但在分选后建议添加青霉素/链霉素（Pen/Strep），因为在分选环境中难以保证无菌性（如果多间实验室共用同一台分选仪，则此操作更为重要）。
2. 完全移除细胞悬液中的上清液，加入200 μL添加了10 μM Y-27632的EGM-2培养基。将细胞悬液转移至接种培养基中，并剧烈混匀。
3. 向步骤5.2中配制的溶液中加入350 μL胶原蛋白，充分混匀。溶液将变为淡黄色。
   注意：胶原蛋白的终浓度对毛细血管丛的形成具有显著影响。本方案假设所用胶原蛋白浓度为10 mg/mL，水凝胶的终浓度为3.5 mg/mL。请根据实际情况调整体积以达到目标终浓度；建议将胶原蛋白终浓度控制在2 mg/mL至4 mg/mL之间。
4. 向5.3步骤中配制的溶液中加入5 μL的1 M NaOH，充分混匀，避免引入气泡。溶液将变为亮粉色。
5. 用移液器将5.4步骤中中和后的胶原-细胞混合液56 μL加入96孔超低吸附U型底细胞培养板的各个孔中。于37 °C孵育30分钟。在添加培养基前，使用明场显微镜观察样本，确认细胞分布均匀。
6. 在微量离心管中加入每种储存液各1 μL，配制1 mL含EGM-2、10 μM Y-27632和50 ng/mL血管内皮生长因子（VEGF）的培养基。充分混匀后，向含细胞的水凝胶上加入100 μL该细胞培养基。将培养板转移至37 °C进行长期培养。
7. 每日更换培养基，根据研究目的添加额外的促血管生成生长因子或小分子抑制剂。为最佳去除旧培养基，可倾斜培养板，使用P100吸头轻轻抽吸培养基，避免扰动水凝胶。

6. 基于EP的血管网络的固定、免疫染色与可视化

1. 培养一周后，向48孔板中每孔加入250 µL的4%多聚甲醛（PFA）溶液。根据水凝胶的数量加入相应数量的孔。吸除水凝胶中的培养基（PFA），用尖头镊子将水凝胶转移至含PFA的孔中。室温孵育10分钟，随后用PBS快速洗涤以去除PFA。
2. 加入250 µL浓度为0.5%的非离子型表面活性剂（见材料表），室温孵育5分钟以进行透化处理。用含300 mM甘氨酸的PBS溶液洗涤两次，每次250 μL。每次洗涤步骤均在室温下孵育5分钟，以确保充分去除多余的去污剂。将水凝胶浸入250 μL封闭缓冲液中，室温封闭30分钟。
3. 加入用封闭缓冲液稀释的一抗溶液，4 °C孵育过夜。例如，若使用鬼笔环肽（phalloidin）和VE-钙黏蛋白（VE-cadherin）进行免疫染色，则分别按1:40和1:200的比例用封闭缓冲液稀释。
4. 次日，吸除一抗溶液，用含0.5%乳化试剂的DPBS洗涤两次。用铝箔包裹后，加入种属特异性的二抗溶液（例如，PBS中1:200稀释的Alexa Fluor 488），室温孵育2小时。
5. 吸除二抗溶液，用含0.5%乳化试剂的DPBS洗涤两次。每次洗涤步骤均在室温下孵育5分钟，以确保去除未结合的荧光染料。
6. 为观察细胞核，将4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）用PBS按1:10000稀释后加入样品。
   1. 室温孵育2分钟，随后用PBS洗涤两次。每次洗涤步骤均在室温下孵育5分钟，以确保去除未结合的荧光染料。
7. 用尖头镊子将样品转移至血管生成μ载玻片或玻璃底培养皿中，确保水凝胶下方无气泡残留。
8. 使用共聚焦显微镜采集从样品底部到顶部的z轴层扫图像。确保探测器未饱和，并使用最低可用放大倍数（建议获得较大的视野）。
   注意：为便于后续图像处理，应以最小压缩方式保存z轴层扫数据（例如，.czi格式）。

7. 使用计算流程分析和比较血管网络拓扑结构

1. 检查每个z-stack，确保切片仅包含血管。在ImageJ中打开z-stack，通过点击 图像 > 调整 > 亮度/对比度 来增强对比度。此时血管边界清晰可辨，背景信号被最小化。 通常情况下，z轴维度与x/y轴维度不一致。为纠正此问题，点击 图像 > 调整 > 大小，调整z切片数量，使每层切片之间的距离等于x/y方向上的一个像素。ImageJ将自动进行插值。若此步骤未正确执行，最终的3D体积图像将出现压缩变形。
   警告：内皮细胞（ECs）会向凝胶边缘迁移，并形成小的鹅卵石样集落。尽管这些集落可用于估计水凝胶的边界，但它们会干扰最终的图像分析，应予以删除。
   注：ImageJ是一款基于Java的开源图像分析软件，由美国国立卫生研究院（NIH）与光学与计算仪器实验室共同开发。建议下载Fiji，其为集成了多种实用插件的ImageJ版本（https://fiji.sc/）。
2. 在ImageJ中，点击 处理 > 滤波器 > 三维高斯模糊，对图像进行三维模糊处理，并将三个维度的sigma值均设为2.0（该值可能需要用户根据实际情况调整）。
3. 在ImageJ中，点击 处理 > 二值化 > 转换为二值图像，然后选择合适的阈值分割算法。Li等人开发的交叉熵阈值算法在分离血管与背景方面效果良好²¹。为每幅图像计算阈值，并将背景设为“默认”。
4. 在ImageJ中，点击 处理 > 降噪 > 去除异常值，以消除伪影噪声并填充管腔中的“空洞”。
   注：去除“亮”异常值可填充连接血管中的小孔洞；去除“暗”异常值可消除死细胞信号。去除半径的大小取决于成像放大倍数和血管尺寸。对于使用宽场物镜采集的512 × 512像素图像，半径通常在4–6像素之间。
5. 在进入步骤7.6之前，处理所有原始文件（例如czi扩展名），并将其转换为.tif格式。为便于此处理过程，本文附带了一个ImageJ脚本“Binarize and Filter.ijm”。
6. 将处理后的.tif文件保存在与文件“BatchProcessSkeleton.m”相同的文件夹中，该文件可在本文中下载。此脚本由作者开发，调用了Phillip Kollmannsberger发布的函数²²，并执行了一些额外的文件操作。
7. 下载并解压与两个主要函数“Skel2Graph3D”（https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43527-skel2graph-3d）和“Skeleton3D”（https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43400-skeleton3d）相关的所有文件。将所有函数保存至与已打开的处理后z-stack相同的文件夹中。
8. 打开一个多范式数值计算环境（参见材料表），并导航至保存上述所有文件的文件夹。
9. 通过在命令窗口中输入 BatchProcessSkeleton，或在编辑器中打开脚本并点击运行按钮（向右的绿色箭头），运行“BatchProcessSkeleton.m”脚本。
   注：若需使用单条命令分析大型数据集，请确保第6行中dir函数内的字符串包含星号（例如‘*.tif’）。若仅需分析单个文件，则将星号替换为具体文件名。
10. 该脚本的执行时间将根据可用计算能力有显著差异。建议在至少配备8 GB内存的计算机上进行此分析，以便在脚本运行期间用户仍可使用其他程序。
    警告：虽然非必需，但将原始共聚焦图像（灰色）与骨架矩阵图像（红色）叠加绘制，有助于评估骨架化算法的性能。此外，读者可参考Kollmannsberger等人实现的方法，构建节点图以评估网络分析的准确性。尽管生成这两种图形有助于分析，但会显著增加脚本运行时间并占用更多内存；若用户仅需最终的拓扑分析结果而无需可视化数据集，可直接注释掉第44 至61 行（骨架图）和第104 至143 行（拓扑图）。
11. 完成后，工作区中可见的数据矩阵现在包含处理后的数据。双击数据，在变量编辑器中打开该单元格。
    1. 请注意，该矩阵从左至右依次包含：1）文件名，2）节点数量（分支点 + 终端点），3）分支点数量，4）连接数（即血管），5）网络总长度（包括孤立血管），6）z-stack中包含的切片数量。将此数据保存为.csv文件，并导出至任意所需软件进行进一步分析。

结果

分化后（图1），将iPSC-EPs通过FACS分选并包埋于胶原水凝胶中，细胞通常在24小时内保持圆形，随后开始迁移并形成初始管腔。培养约6天后，在明场显微镜下可观察到水凝胶中出现原始毛细血管网络（图2）。对固定并染色的负载细胞的水凝胶进行共聚焦显微镜成像后（视频1，附加视频1），将预处理后的图像转化为骨架结构，从而可分析整个网络的总长度和连通性。这些定量指标可用于确定哪组条件最有利于形成稳定的血管网络。

本方案可用于构建一个对局部物理和化学信号具有响应性的稳定三维毛细血管网络。在先前的研究中，该网络的形成已被证实对基质密度、基质刚度、基质金属蛋白酶抑制作用以及多种促血管生成有丝分裂原的类型和浓度具有敏感性^20,

讨论

本方案涉及在三种细胞培养基——E8、LaSR 基础培养基和 EGM-2 中进行细胞的长期培养。因此，必须格外注意对所有材料进行适当灭菌。此外，在实验室超净工作台内操作时，应始终穿戴实验服并佩戴经乙醇清洁的手套。建议定期检测支原体污染；若在诱导多能干细胞（iPSC）培养过程中观察到大量碎片，或分化效率突然下降，则支原体污染可能是主要原因。采用本方案生成的诱导多能干细胞来源的内皮前体细胞（iPSC-EPs）倾向于沉积大量细胞外基质（ECM），这会延长解离时间，并导致单细胞悬液形成小团块。请勿使用胰蛋白酶-EDTA（0.25%），因为该溶液可能破坏 iPSC-EPs 上的 CD34 表位。然而，使用胶原酶/分散酶溶液处理可能有助于去除沉积的 ECM，从而促进标准细胞解离溶液的解离效果。在充分解离后，仍可能残留少量细胞团块和 ECM；应使用 P100 移液器吸头去除这些团块，因其可能堵塞细胞滤网或干扰流式细胞分选（FACS）。

多能干细胞对解离作用敏感，在单细胞悬液中会经历凋亡，除非在培养基中添加ROCK抑制剂（通常为Y-27632）²⁴。i...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
µ-Slide 血管生成	Ibidi	N/A	一种带侧壁的平底玻璃底组织培养板，便于进行共聚焦成像
96孔圆底超低吸附无菌微孔板	Corning	7007	防止含细胞的胶原水凝胶与细胞培养皿结合
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	温和的细胞解离溶液；不会降解对流式细胞术至关重要的细胞外表位
Advanced DMEM/F12	Thermo Scientific	12634010	iPSC-EP 分化的基础培养基。
Barnstead GenPure xCAD Plus	Thermo Fisher Scientific	50136165	水纯化系统；其他同类系统也可替代使用
牛血清白蛋白溶液，7.5% 溶于 DPBS，经无菌过滤，BioXtra 级，适用于细胞培养	Fisher Scientific	A8412	用于流式细胞术分选时维持细胞活力
CD34-PE，人源（克隆号：AC136）	Miltenyi Biotec	130-098-140	用于 iPSC-EP 流式细胞术分选的抗体
CHIR99021	LC Laboratories	C-6556	诱导多能干细胞形成中胚层
大鼠尾胶原 I 型 高蛋白 100 mg	VWR	354249	三维微环境的主要成分
锥形离心管（15/50 mL）	Fisher Scientific	14-959-49D/A	用于储存和混合较大量试剂及细胞培养基
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）	Thermo Fisher Scientific	D1306	用于细胞核复染和可视化观察
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11320-082	用于稀释 Matrigel 及解冻多能干细胞
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）	ThermoFisher	14190-250	用于洗涤单层培养细胞
EDTA	Sigma-Aldrich	E8008	用于多能干细胞集落传代，以及在流式细胞术分选时防止细胞聚集
内皮细胞生长培养基 2	PromoCell	C-22011	促进内皮细胞存活和增殖
Essential 8 培养基	Thermo Fisher Scientific	A1517001	用于多能干细胞的维持培养
甘氨酸，BioUltra 级，分子生物学用，>=99.0%（NT）	Sigma-Aldrich	50046	中和残留的去垢剂
L-抗坏血酸-2-磷酸三镁盐水合物，>=95%	Sigma-Aldrich	A8960	iPSC-EP 分化培养基的组分
MATLAB	MathWorks	1.8.0_152	多范式数值计算环境（大多数学术机构可免费获取）
Matrigel 基质 GFR 无酚红 小鼠 10 mL（明胶状蛋白混合物）	Fisher Scientific	356231	用 DMEM/F12 稀释后用于包被培养板以进行 iPSC-EP 分化
Medium-199 10X	Thermo Fisher Scientific	1825015	用于调节最终水凝胶的渗透压和 pH 值
微量离心管（1.7 mL）	VWR	87003-294	用于储存小体积试剂
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich	P3813	免疫染色溶液的主要成分
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Thermo Fisher Scientific	15140122	分选后使用的抗生素，用于清除流式细胞仪可能带来的污染
重组人 VEGF 165 蛋白	R&D Systems	293-VE	刺激内皮细胞增殖和管状结构形成的有丝分裂原
罗丹明鬼笔环肽	Thermo Fisher Scientific	R415	用于识别 F-肌动蛋白沉积，从而勾勒出血管网络的边界
Triton X-100（非离子型表面活性剂）	Sigma-Aldrich	X-100	用于温和地透化细胞的去垢剂
Tween-20（乳化试剂）	Fisher Scientific	BP337	提高所加抗体的结合特异性
VE-钙黏蛋白（F-8）	Santa Cruz Biotechnology	sc-9989	用于识别胶原水凝胶中的三维内皮管腔
纤连蛋白	ThermoFisher	A14700	用于多能干细胞的维持培养
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	在细胞解离和重新接种时维持多能干细胞和 iPSC-EP 的存活率