由诱导性多能干细胞（iPSC-EPs）衍生的内皮祖细胞有望彻底改变心血管疾病的治疗方法，并可用于构建更贴近真实情况的心血管疾病模型。本文介绍了将iPSC-EPs包封于三维（3D）胶原微环境中的方法，以及对这些细胞血管生成潜能的定量分析。
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本文内容
摘要
摘要
诱导性多能干细胞（iPSCs）是一种患者特异性的、具有增殖能力的细胞来源，可分化为任何类型的体细胞。双潜能内皮祖细胞（EPs）能够分化为组装成熟且具有功能的脉管系统所需的细胞类型，已从胚胎干细胞和诱导性多能干细胞中成功获得。然而，这些细胞在三维环境中的表现尚未得到系统评估，其血管生成潜能也缺乏定量衡量方法。本文首先概述了通过荧光激活细胞分选技术生成和分离iPSC-EPs的方法，随后描述了将iPSC-EPs包封于胶原蛋白水凝胶中进行培养的过程。这种模拟细胞外基质（ECM）的微环境可有效促进强烈的血管生成反应；在培养一周后即可形成血管网络。文中还详细阐述了一种利用开源软件构建的计算分析流程，用于定量评估该血管生成反应。该分析流程专门设计用于保持毛细血管网的三维结构完整性，可在最少人工干预的情况下，准确识别分支数量、分支点数量以及网络总长度。
引言
人脐静脉内皮细胞（HUVECs）及其他原代内皮细胞类型已被用于体外模拟血管出芽和发育过程长达二十年1。此类血管模型有望揭示心血管疾病的分子和组织水平机制，并可能为原始血管网络的发育提供生理学见解2,3。尽管血管建模领域已取得显著进展，但仍缺乏一种能够定量模拟并评估生理性血管发育的“金标准”检测方法。大多数已发表的实验方案未能充分重建血管微环境以促进成熟、功能性血管的形成，或缺乏在三维（3D）条件下对所评估细胞类型血管生成潜能进行定量比较的方法。
目前许多血管模型在模拟生理性血管微环境方面存在局限性。最常用的体外平台之一是基于明胶状蛋白质混合物的管状结构形成实验。简而言之，将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）以单细胞形式接种于一层薄凝胶上，该凝胶由小鼠肉瘤细胞外基质（ECM）中提取的蛋白质构成；在1至2天内，HUVECs会自组装形成原始管状结构4。然而，该过程发生在二维（2D）环境中，且该实验所用的内皮细胞（ECs）无法形成封闭的中空管腔，从而限制了这些研究的生理相关性。近年来，研究人员已将内皮细胞与支持性细胞（如间充质干细胞（MSCs）和周细胞）共培养于三维（3D）微环境，以模拟天然ECM的纤维结构，例如胶原蛋白或纤维蛋白水凝胶5<....
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方案
1. 培养基和包被溶液的制备
- 配制玻连蛋白包被溶液时，将玻连蛋白以1:100的比例用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）稀释。
注意：稀释后不建议将此溶液保存以供后续使用。 - 从生产商处收到无酚红、生长因子减少的胶状蛋白混合物（见材料表）后，在4 °C冰上解冻，直至混合物变为透明且呈流动状态。在超净台中保持该混合物处于冰上，用移液器将75 μL混合物转移至1.8 mL微量离心管中，并立即在-20 °C下冷冻。这些分装样品可保存长达一年。
注意：该胶状蛋白混合物在室温下会变得非常黏稠，并在较高温度下凝固。请始终保持该溶液处于冰冻状态。 - 为包被准备该混合物时，将75 μL分装样品在冰上解冻，并用6 mL冰冻的杜氏改良伊格尔培养基：营养混合物F-12（DMEM/F12）稀释。此体积足以包被一块12孔板。
- 配制100 mg/mL的抗坏血酸镁-2-磷酸（一种白色冻干粉末）储备液：在10 mL玻璃闪烁瓶中，将500 mg粉末加入5 mL超纯水中，用磁力搅拌器搅拌至溶液完全透明（可能需要长达一小时）。该溶液可在-20 °C下保存长达一年。
- 配制CHIR99021（CHIR）的10 mM储备液：在15 mL锥形离心管中，将10 mg冻干粉末溶于1.9928 mL二甲基亚砜（DMSO）中，并在37 °C金属珠（或水浴）中加热至溶液透明。分装至1.8 mL微量离心管中，在-20 °C下可保存长达一....
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结果
分化后（图1），将iPSC-EPs通过FACS分选并包埋于胶原水凝胶中，细胞通常在24小时内保持圆形，随后开始迁移并形成初始管腔。培养约6天后，在明场显微镜下可观察到水凝胶中出现原始毛细血管网络（图2）。对固定并染色的负载细胞的水凝胶进行共聚焦显微镜成像后（视频1，附加视频1），将预处理后的图像转化为骨架结构，从而分析整个网络的总长度和连通性。这些定量指标可用于确定哪组条件最有利于形成稳定的血管网络。
本方案可用于构建一个对局部物理和化学信号具有响应性的稳定三维毛细血管网络。在先前的研究中，该网络的形成已被证实对基质密度、基质刚度、基质金属蛋白酶抑制作用以及多种促血管生成有丝分裂原的类型和浓度具有敏感性20,
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讨论
本方案涉及在三种细胞培养基——E8、LaSR 基础培养基和 EGM-2 中进行细胞的长期培养。因此，必须格外注意对所有材料进行适当灭菌。此外，在实验室超净工作台内操作时，应始终穿戴实验服并佩戴经乙醇清洁的手套。建议定期检测支原体污染；若在诱导多能干细胞（iPSC）培养过程中观察到大量碎片，或分化效率突然下降，则支原体污染可能是主要原因。采用本方案生成的诱导多能干细胞来源的内皮前体细胞（iPSC-EPs）倾向于沉积大量细胞外基质（ECM），这会延长解离时间，并导致单细胞悬液形成小团块。请勿使用胰蛋白酶-EDTA（0.25%），因为该溶液可能破坏 iPSC-EPs 上的 CD34 表位。然而，使用胶原酶/分散酶溶液处理可能有助于去除沉积的 ECM，从而促进标准细胞解离溶液的解离效果。在充分解离后，仍可能残留少量细胞团块和 ECM；应使用 P100 移液器吸头去除这些团块，因其可能堵塞细胞滤网或干扰流式细胞分选（FACS）。
多能干细胞对解离作用敏感，在单细胞悬液中会经历凋亡，除非在培养基中添加ROCK抑制剂（通常为Y-27632）24。i.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国心脏协会（资助号 15SDG25740035，授予 J.Z.）、美国国立卫生研究院生物医学影像与生物工程研究所（NIBIB，资助号 EB007507，授予 C.C.）以及再生康复研究联盟资助 & 培训（AR3T，资助号 1 P2C HD086843-01，授予 J.Z.）。我们感谢德克萨斯大学奥斯汀分校的 Jeanne Stachowiak 教授在共聚焦显微镜技术方面提供的专业建议。我们还感谢德克萨斯大学奥斯汀分校的 Samuel Mihelic、德克萨斯大学奥斯汀分校的 Alicia Allen 博士、Adaptive Biotech 的 Julie Rytlewski 博士以及范德堡大学的 Leon Bellan 博士，他们在三维网络的计算分析方面提供了宝贵的见解。最后，我们感谢加州大学伯克利分校的 Xiaoping Bao 博士在将诱导多能干细胞分化为诱导多能干细胞来源的内皮前体细胞（iPSC-EPs）方面给予的指导。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| µ-Slide 血管生成 | Ibidi | N/A | 一种带侧壁的平底玻璃底组织培养板，便于进行共聚焦成像 |
| 96孔圆底超低吸附无菌微孔板 | Corning | 7007 | 防止含细胞的胶原水凝胶与细胞培养皿结合 |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | 温和的细胞解离溶液；不会降解对流式细胞术至关重要的细胞外表位 |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Scientific | 12634010 | iPSC-EP 分化的基础培养基。 |
| Barnstead GenPure xCAD Plus | Thermo Fisher Scientific | 50136165 | 水纯化系统；其他同类系统也可替代使用 |
| 牛血清白蛋白溶液，7.5% 溶于 DPBS，经无菌过滤，BioXtra 级，适用于细胞培养 | Fisher Scientific | A8412 | 用于流式细胞术分选时维持细胞活力 |
| CD34-PE，人源（克隆号：AC136） | Miltenyi Biotec | 130-098-140 | 用于 iPSC-EP 流式细胞术分选的抗体 |
| CHIR99021 | LC Laboratories | C-6556 | 诱导多能干细胞形成中胚层 |
| 大鼠尾胶原 I 型 高蛋白 100 mg | VWR | 354249 | 三维微环境的主要成分 |
| 锥形离心管（15/50 mL） | Fisher Scientific | 14-959-49D/A | 用于储存和混合较大量试剂及细胞培养基 |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐） | Thermo Fisher Scientific | D1306 | 用于细胞核复染和可视化观察 |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | 用于稀释 Matrigel 及解冻多能干细胞 |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | ThermoFisher | 14190-250 | 用于洗涤单层培养细胞 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E8008 | 用于多能干细胞集落传代，以及在流式细胞术分选时防止细胞聚集 |
| 内皮细胞生长培养基 2 | PromoCell | C-22011 | 促进内皮细胞存活和增殖 |
| Essential 8 培养基 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | 用于多能干细胞的维持培养 |
| 甘氨酸，BioUltra 级，分子生物学用，>=99.0%（NT） | Sigma-Aldrich | 50046 | 中和残留的去垢剂 |
| L-抗坏血酸-2-磷酸三镁盐水合物，>=95% | Sigma-Aldrich | A8960 | iPSC-EP 分化培养基的组分 |
| MATLAB | MathWorks | 1.8.0_152 | 多范式数值计算环境（大多数学术机构可免费获取） |
| Matrigel 基质 GFR 无酚红 小鼠 10 mL（明胶状蛋白混合物） | Fisher Scientific | 356231 | 用 DMEM/F12 稀释后用于包被培养板以进行 iPSC-EP 分化 |
| Medium-199 10X | Thermo Fisher Scientific | 1825015 | 用于调节最终水凝胶的渗透压和 pH 值 |
| 微量离心管（1.7 mL） | VWR | 87003-294 | 用于储存小体积试剂 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | P3813 | 免疫染色溶液的主要成分 |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 分选后使用的抗生素，用于清除流式细胞仪可能带来的污染 |
| 重组人 VEGF 165 蛋白 | R&D Systems | 293-VE | 刺激内皮细胞增殖和管状结构形成的有丝分裂原 |
| 罗丹明鬼笔环肽 | Thermo Fisher Scientific | R415 | 用于识别 F-肌动蛋白沉积，从而勾勒出血管网络的边界 |
| Triton X-100（非离子型表面活性剂） | Sigma-Aldrich | X-100 | 用于温和地透化细胞的去垢剂 |
| Tween-20（乳化试剂） | Fisher Scientific | BP337 | 提高所加抗体的结合特异性 |
| VE-钙黏蛋白（F-8） | Santa Cruz Biotechnology | sc-9989 | 用于识别胶原水凝胶中的三维内皮管腔 |
| 纤连蛋白 | ThermoFisher | A14700 | 用于多能干细胞的维持培养 |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | 在细胞解离和重新接种时维持多能干细胞和 iPSC-EP 的存活率 |
参考文献
- Wang, K., Lin, R. -Z., Melero-Martin, J. M. Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).
- Kant, R. J., Coulombe, K. L. K.
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重印与许可
