本方案展示了在早期斑马鱼胚胎冷冻切片上进行连续免疫荧光和免疫组织化学染色的方法，从而实现对特定细胞群体中蛋白共定位的精确分析。
本文内容
摘要
摘要
研究细胞间相互作用通常需要对特定细胞群体进行明确标记，并实现蛋白质的精确定位。斑马鱼胚胎是利用活体模型研究此类相互作用的优良工具。整体免疫组织化学和免疫荧光检测方法常被应用于斑马鱼胚胎中以评估蛋白质表达。然而，在三维空间中准确描绘共定位蛋白质仍具有挑战性。此外，某些研究可能需要使用两种不适用于同一技术的抗体（例如，抗体1仅适用于免疫组织化学，而抗体2仅适用于免疫荧光）。本文所述方法的目的是对来自早期斑马鱼胚胎的单个冷冻切片进行连续的免疫荧光和/或免疫组织化学检测。本文详细描述了在同一冷冻切片上依次进行多轮免疫荧光、成像、免疫组织化学及再次成像的操作流程，以实现单细胞水平上蛋白质表达的精确定位。该方法适用于所有需要在单个细胞中准确识别多种蛋白质靶标的早期斑马鱼胚胎研究。
引言
斑马鱼是一种极为可靠的模式生物，目前被广泛应用于生物医学研究的多个领域。特别是斑马鱼胚胎快速的体外发育和透明特性，为体内研究提供了极佳的工具。本文介绍一种对冷冻切片的斑马鱼胚胎进行连续免疫荧光（IF）和免疫组织化学（IHC）分析的方法。该新方法在同一张载玻片上依次应用两种抗体，能够在细胞水平上准确鉴定共定位的蛋白质，同时节约组织切片。该实验方案对于斑马鱼模型研究尤为有用，因为与小鼠模型相比，目前经验证可用于斑马鱼IF和/或IHC应用的抗体数量相对较少。
观察细胞间相互作用是许多研究中的关键环节，可为理解在细胞水平上运作并导致个体表型的分子机制提供重要见解。此外，蛋白质表达情况能够反映细胞功能信息，尤其是在同时检测细胞内多种蛋白质表达（共定位）时尤为重要。尽管整体免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）是分析斑马鱼胚胎中蛋白质表达的常用技术1,2,3,4,5，但整体染色方法在获取精确共定位数据方面可能存在困难。根据我们的经验，在整体标本中难以区分不同组织层次，也无法在单细胞水平上清晰观察蛋白质的表达。成像软件通常难以区分表面染色与深层染色信号，深层蛋白质表达可能被表面更强的信号掩盖，从而导致定量分析不准确。此外，大多数传统的斑马鱼组织透明化方法毒性较强6，因此在实际应用中并不理想。
基于抗体的技术，如免疫荧光（IF）和免疫组织化学（IHC），常用于检测切片样本中的蛋白质表达，有助于在复杂组织中识别表达特定蛋白质的特定细胞群体。IHC 常用于共定位分析，最常见的方式是使用来自不同宿主物种的两种不同抗体，并通过不同颜色的显色剂进行可视化4,7,8,9,10。然而，使用多种显色剂可能导致非特异性背景染色或颜色之间的不兼容11,12。
我们开发了一种新方案，可在冷冻切片的早期斑马鱼胚胎上通过连续进行免疫荧光（IF）和免疫组织化学（IHC）来检测多种蛋白质。冷冻切片特别适用于斑马鱼胚胎等脆弱组织，且与石蜡包埋切片相比，冷冻切片在基于荧光的检测中具有更优性能13,14。我们选择优化IF与IHC的联合使用，而非双色IF或双色IHC，以避免同一检测类型中抗体不兼容的问题。这一问题在斑马鱼研究中尤为突出，原因是经验证可用于斑马鱼的商业化抗体数量极为有限。事实上，一项针对四家大型公司的研究显示，可用于小鼠的商业化抗体约有112,000种，而可用于斑马鱼的仅约5,300种15。最后，我们选择开发一种可在单张冷冻切片上完成的实验流程，这对于处理来自斑马鱼胚胎等体积小或数量有限的组织样本至关重要。
本方案旨在评估通过囊胚到囊胚移植所构建的受精后48小时嵌合体斑马鱼胚胎中供体细胞的增殖行为，该移植方法由 Carmany-Rampey 和 Moens16 描述。在将供体细胞移植至受体胚胎之前，于单细胞阶段向供体胚胎注射荧光标记的葡聚糖偶联物。我们采用免疫荧光法检测组蛋白 H3 第10位丝氨酸磷酸化（pH3）以标记增殖细胞，随后通过免疫组织化学法检测标记的葡聚糖以识别嵌合体斑马鱼胚胎中的供体细胞。在同一冷冻切片中依次检测 pH3 和标记的葡聚糖，使我们能够鉴定并定量表达这两种标记物的单个细胞。
本针对冷冻切片斑马鱼样本的连续免疫荧光/免疫组化（IF/IHC）方案，将为希望研究蛋白质表达共定位的斑马鱼研究人员提供一种实用工具。该方案旨在解决的问题，例如组织样本较小和抗体供应有限等，并非斑马鱼模型所独有。因此，该方法也可适用于任何希望进行连续免疫荧光/免疫组化（IF/IHC）实验的研究人员。
伦理声明：
所有动物实验均经美国北卡罗来纳州罗利市北卡罗来纳州立大学机构动物护理和使用委员会批准。
方案
1. 胚胎制备
- 在4 °C条件下，将囊胚期移植产生的48小时受精后（hpf）AB野生型斑马鱼嵌合胚胎置于4%多聚甲醛（PFA）中固定过夜，并持续振荡。使用含0.1%非离子去污剂的1×磷酸盐缓冲液（1× PBSt；参见材料表）在室温下振荡清洗两次，每次5分钟，每次使用500 μL。
注意：多聚甲醛具有毒性且为致癌物，必须根据机构规定妥善处理。操作多聚甲醛时应在化学通风橱中进行，并始终佩戴适当的个人防护装备（手套、实验服和护目镜）。 - 依次使用500 μL经1× PBSt稀释的30%、50%和70%甲醇（MeOH）在室温下振荡清洗胚胎，每次10分钟，以进行脱水处理。随后将胚胎置于500 μL 100%甲醇中，在-20 °C下孵育至少14小时。
注意：甲醇具有毒性，必须根据机构规定妥善处理。操作甲醇时应在化学通风橱中进行，并始终佩戴适当的个人防护装备（手套、实验服和护目镜）。 - 依次使用500 μL经1× PBSt稀释的70%、50%和30%甲醇在室温下振荡清洗胚胎，每次10分钟，以进行再水化处理。随后在室温下用500 μL 1× PBSt振荡清洗两次，每次5分钟。
- 移除1× PBSt，加入500 μL用去离子水稀释的30%蔗糖溶液，在室温下振荡孵育，直至胚胎沉降至管底（约1小时）。随后用500 μL 15%鱼明胶/25%蔗糖溶液（15/25；参见材料表）替换蔗糖溶液，在室温下振荡孵育过夜。
- 用适量OCT包埋介质（最佳切削温度介质）替换约一半体积的15/25溶液，在室温下振荡孵育，直至胚胎沉降至管底（约1小时）。
- 再次用OCT包埋介质替换约一半体积的溶液，在室温下振荡孵育1小时。重复此步骤一次。
- 在15/25溶液和OCT介质孵育过程中，根据需要倒置或轻弹管子，以充分混匀试剂。
2. 胚胎包埋与冷冻切片制备
- 用镊子将胚胎转移至塑料模具（参见材料表），尽量减少15/25-OCT混合物的带入。向模具中加入约一半体积的OCT包埋剂，并轻轻混匀胚胎与OCT包埋剂。
- 准备已标记的塑料模具，将所需胚胎（通常为1‒3个胚胎）转移至空的、已标记的塑料模具中，尽量避免带入OCT包埋剂。待所需胚胎放入塑料模具后，轻轻加满OCT包埋剂至模具顶部。
- 使用镊子或25 G针头，在体视显微镜下观察，将胚胎调整至所需方向（图1A，B）。
- 将准备好的模具置于带有金属平台的隔热容器中，并在干冰上速冻。将冰桶或泡沫保温箱轻轻覆盖在金属平台上，以形成低温环境（图1C，D）。
- 使用设定为-20 °C的冷冻切片机制备10‒12 μm厚的冷冻切片。
- 每次安装一个组织块，用OCT包埋剂将组织块底部朝向刀片固定在圆盘/夹头（disc/chuck）上（图2A）。在开始切片前，确保组织块已完全冻结在夹头上（OCT包埋剂变为白色）（图2B）。
- 将冷冻切片贴附于带电荷的玻璃载片上（图2C，D），并在室温下自然干燥过夜。
3. pH3免疫荧光染色
- 在适当的容器（如考普林瓶）中，用1× PBS对载玻片进行三次、每次5分钟的洗涤。如果组织贴附不牢固，可将载玻片平放于水平表面，轻轻用移液器将500 μL的1× PBS滴加至表面。每次洗涤之间，轻轻倾斜载玻片以倒出1× PBS。
- 使用疏水屏障笔或蜡笔在组织周围划线，以防止液体在载玻片上扩散（图3）。
- 将载玻片平放于加湿室内的水平表面上，每张组织切片上滴加200 μL封闭缓冲液。室温孵育2小时，或4 °C过夜。
- 在封闭缓冲液中配制一抗稀释液（兔抗pH3抗体，1:200；见材料表），并通过移液充分混匀。轻轻倾斜载玻片以去除封闭缓冲液，将载玻片放回加湿室，每张切片上滴加200 μL一抗溶液。对于仅使用二抗的对照组，在相应切片上滴加200 μL封闭缓冲液。
- 将载玻片置于充满去离子水的加湿室中，4 °C过夜孵育。密封加湿室边缘以保持湿度。
- 在适当的容器（如考普林瓶）中，用1× PBS对载玻片进行三次、每次5分钟的洗涤。在洗涤过程中，于封闭缓冲液中配制二抗稀释液（抗兔荧光标记二抗，1:2,000；见材料表），并通过移液充分混匀。
- 将载玻片平放于加湿室内，每张组织切片上滴加200 μL二抗溶液。在室温下避光孵育30分钟。
- 在适当的容器（如考普林瓶）中，用1× PBS对载玻片进行三次、每次5分钟的洗涤，并保持避光。在洗涤过程中，配制核染色液（见材料表）。
- 将载玻片平放，根据样本大小在每张切片上滴加200‒500 μL核染色液。避光孵育10分钟。
- 去除核染色液，使用非硬化型荧光封片剂和盖玻片封片。将载玻片避光保存于4 °C，直至进行成像。
注意：载玻片在当天或次日成像时可获得最佳结果。 - 免疫荧光染色完成后，使用共聚焦荧光显微镜和数字相机，在100倍放大倍数（10倍目镜与10倍物镜）下，结合555 nm（红色）和645 nm（远红）发射滤光片进行观察与成像。成像过程中保持激光功率一致。
- 成像后，将载玻片分别放入盛有1× PBS的独立容器中，平放于4 °C保存过夜，以准备去除盖玻片。将载玻片放入1× PBS时，轻轻振荡以帮助盖玻片脱落。
注意：切勿按压盖玻片或尝试手动剥离，以免破坏组织切片质量。盖玻片必须水平移除，尽量减少外力作用。
4. 标记右旋糖酐的免疫组织化学
- 取出盖玻片后，将载玻片轻轻转移至适当容器（如考普林瓶）中的新鲜 1x PBS 中。弃去 1x PBS，并在室温下用含 0.1% 非离子去污剂的 1x Tris-缓冲盐水（1x TBSt）对载玻片进行三次、每次 5 分钟的孵育。
- 在合适大小的容器中，用去离子水稀释配制 250 mL 的 3% 过氧化氢（H2O2）溶液。将载玻片在 3% H2O2 溶液中室温孵育 15 分钟。
注意：过氧化氢具有腐蚀性，必须按照机构规定妥善处理。操作时应始终佩戴适当的个人防护装备（手套、实验服和护目镜）。 - 用去离子水快速冲洗载玻片。在 1x TBSt 中对载玻片进行三次、每次 5 分钟的洗涤。小心擦干组织周围区域，并将载玻片平放于湿盒中。如有需要，可用疏水笔或蜡笔在组织周围划线，以防止液体扩散。
- 将随二抗标记试剂盒提供的即用型 2.5% 血清封闭液（见材料表）逐滴加至每个组织切片上。在湿盒中室温孵育 20 分钟。
- 将一抗用抗体稀释液稀释（兔抗标记葡聚糖抗体，1:7,500；见材料表），并通过轻柔吹打混匀。轻轻倾斜载玻片以去除封闭液，擦干切片周围区域，并将载玻片平放于湿盒中。
- 在加一抗溶液前无需洗涤。每张切片上加 200 μL 一抗溶液，于湿盒中 4 °C 过夜孵育。对于仅加二抗的对照组，在相应切片上加 200 μL 抗体稀释液。
- 轻轻倾斜载玻片以去除一抗溶液，然后将其放入适当容器（如考普林瓶）中的 1x TBSt 内。在 1x TBSt 中洗涤两次，每次 5 分钟。擦干切片周围区域，并将载玻片平放于湿盒中。
- 将即用型背景减少封闭试剂（见材料表）逐滴加至每个切片上。在湿盒中室温孵育 20 分钟。
- 轻轻倾斜载玻片以去除封闭液，小心擦干切片周围区域，并将载玻片平放于湿盒中。在加二抗溶液前无需洗涤。
- 将即用型二抗溶液（抗兔辣根过氧化物酶（HRP）聚合物二抗；见材料表）逐滴加至每个切片上，在湿盒中室温孵育 30 分钟。
- 轻轻倾斜载玻片以去除二抗溶液，然后将其放入适当容器（如考普林瓶）中的 1x TBSt 内。在 1x TBSt 中洗涤两次，每次 5 分钟。
- 根据生产商说明书，在使用前立即配制 HRP 显色底物（见材料表）。
- 擦干切片周围区域，将载玻片平放，每张切片加 200 μL HRP 显色底物。室温孵育 3 分钟，从向第一张载玻片加底物时开始计时（图 4）。
- 倾去底物溶液，将载玻片在含 1x PBS 的考普林瓶中短暂冲洗。将载玻片转移至含去离子水的适当容器（如考普林瓶）中，在轻微振荡条件下用去离子水洗涤两次，每次 5 分钟。
- 将载玻片浸入苏木精染色液中进行复染，时间最长不超过 30 秒。
注意：苏木精有毒，必须按照机构规定妥善处理。操作时应始终佩戴适当的个人防护装备（手套、实验服和护目镜）。 - 将载玻片放入含去离子水的适当容器（如考普林瓶）中，用去离子水洗涤三次，每次 5 分钟。将载玻片转移至含 Scott 水（见材料表）的容器中，孵育 1 分钟。
- 将载玻片放入含去离子水的适当容器（如考普林瓶）中，用去离子水洗涤三次，每次 5 分钟。
- 在通风橱中，依次通过一系列乙醇（EtOH，用去离子水配制）和二甲苯进行脱水。在 70% EtOH 中孵育 2 分钟一次，在 95% EtOH 中孵育 1 分钟两次，在 100% EtOH 中孵育 1 分钟两次，在二甲苯中孵育 1 分钟三次。从二甲苯中取出载玻片后，在通风橱中用含甲苯的封片介质趁湿加盖玻片。
注意：二甲苯和甲苯具有毒性和易燃性，必须按照机构规定妥善处理。操作应在通风橱中进行，并始终佩戴适当的个人防护装备（手套、实验服和护目镜）。 - 免疫组化染色完成后，使用复合光学显微镜和数码相机在 100 倍放大倍数下（10 倍目镜与 10 倍物镜）观察并拍摄载玻片图像（图 5）。
结果
我们开发本方案旨在鉴定和分析受精后48小时嵌合体斑马鱼胚胎中单个供体细胞的蛋白表达，这些嵌合体胚胎是通过AB野生型斑马鱼胚胎之间的囊胚到囊胚移植而获得的。要在单细胞水平上成功分析蛋白表达，必须制备具有适当方向的胚胎冷冻切片（图1 和 图2），并对这些冷冻切片依次谨慎地应用免疫荧光（IF）和免疫组织化学（IHC）技术（图3 和 图4）。利用特异性抗体可同时检测增殖细胞（抗pH3抗体，图5A、B）和供体细胞（抗标记葡聚糖抗体，图5D），从而识别并定量正在活跃增殖的供体细胞（图5E）。为了准确识别单个细胞，必须在免疫荧光（图2A、B）和免疫组织化学（图2D）后均获得高质量图像。应使用图像分析软件进行图像叠加（图5E）。根据所使用的图像分析软件，若需定量分析，可能可实现对标记细胞的自动计数。
图 1： 冷冻OCT包埋块的制备。（A）在冷冻用低温模具中，胚胎在OCT中的50倍显微图像。红色箭头指示斑马鱼胚胎头部相对于模具底面的位置；黑色箭头指示尾部朝上指向操作者。（B）装有胚胎和OCT的塑料模具置于冷却的金属平台上。（C）将泡沫冰桶覆盖在塑料模具上以形成冷冻室。（D）OCT块完全冻结后由透明变为白色。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2： OCT 冷冻包埋块的冰冻切片。（A），将新鲜 OCT 包埋剂涂抹至冰冻切片机载物盘，并将冷冻组织块放置于 OCT 上，其方向相对于组织块冷冻时的方向旋转 180°。（B）组织块冻结在切片载物盘上的侧面示意图。（C）切片过程中组织块与滚轮压板就位状态的视图。（D）使用带电荷的载玻片从冰冻切片机金属平台拾取切片。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3： 组织切片放置于载玻片后制备完成的视图。 箭头指示疏水屏障，虚线勾画出屏障范围内包含切片的区域。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 4：免疫组化中显色底物应用前的准备。 将载玻片置于覆盖有塑料膜的平坦表面上，以便均匀施加显色底物，同时防止有害物质溢出。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 5： 通过囊胚到囊胚移植生成的48小时斑马鱼嵌合胚胎冰冻切片的代表性免疫荧光（IF）和免疫组化（IHC）标记结果，供体和受体均为AB野生型斑马鱼胚胎。（A）免疫荧光检测48小时嵌合斑马鱼胚胎中组蛋白H3第10位丝氨酸磷酸化（抗-pH3，1:200）的表达。红色 = pH3阳性细胞；蓝色 = 细胞核。黄色箭头指示阳性细胞的示例。（B）在数字图像中去除蓝色细胞核染色（使用ImageJ软件），以增强pH3阳性细胞的可视化效果，便于定量分析和图像叠加。（C）冰冻切片48小时嵌合斑马鱼胚胎免疫荧光实验的阴性对照（仅二抗）。比例尺为50 µm（适用于所有图示）。（D）免疫组化检测通过囊胚到囊胚移植生成的48小时嵌合斑马鱼胚胎中标记的葡聚糖（抗标记葡聚糖，1:7,500）。供体胚胎在单细胞期注射了荧光标记的葡聚糖偶联物，随后用于囊胚到囊胚移植。红色表示被葡聚糖偶联物标记的细胞；蓝色表示细胞核。黄色箭头指示阳性细胞的示例。（E）图B（pH3免疫荧光）与图D（标记葡聚糖免疫组化）的叠加图像，显示单个细胞中pH3表达与葡聚糖标记的共定位。黄色箭头指示双阳性细胞的示例。（F）冰冻切片48小时嵌合斑马鱼胚胎免疫组化实验的阴性对照（仅二抗）。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
我们提出了一种联合免疫荧光与免疫组织化学的新方法，该方法在对冷冻切片的斑马鱼胚胎进行共定位实验方面具有重要意义。目前尚缺乏针对小型胚胎及冷冻切片样本优化的共定位实验方案17,18，而这两类样本在分子生物学研究中却广泛使用14。现有的共定位方案主要集中在两种荧光染料的同时可视化17,18。尽管这些方案在某些情况下效果良好，但其应用受限于抗体的可获得性：（i）可在斑马鱼中使用的抗体；（ii）适用于免疫荧光（IF）的抗体。
我们认为，对斑马鱼胚胎使用冷冻切片技术在组织形态保存方面具有显著优势。由于免疫组化（IHC）更常在石蜡切片而非冷冻切片上进行7,8，因此有必要进一步探索基于冷冻切片的免疫组化方法以检测蛋白质表达。整体免疫荧光（whole mount IF）是可视化斑马鱼胚胎中蛋白表达水平的常用方法，在文献中描述的频率也高于使用冷冻切片的免疫荧光技术1,2,3,4,19。然而，整体染色方案存在局限性，包括无法准确定位深部组织中表达的蛋白质，以及表面蛋白表达可能掩盖深层组织中蛋白信号的问题。我们始终观察到，在冷冻保存、切片以及连续进行免疫荧光和免疫组化处理后，细胞形态均得到了极好的保留。对于需要在单细胞水平精确定位蛋白表达的应用而言，本实验方案所描述的基于切片的方法具有显著优势。树脂包埋为早期斑马鱼胚胎切片进行免疫荧光或免疫组化检测提供了另一种选择20。与冷冻切片相比，树脂切片能更优地保存组织形态，并可制备相对更薄的组织切片。然而，制造商通常不建议将树脂切片用于基于免疫的检测，因为树脂中的某些成分无法从切片中完全去除，可能会遮蔽抗体结合位点21。
尽管整个实验方案对于准确且成功地分析表达模式至关重要，但其中一些特定步骤对实验成功尤为关键。第一个关键步骤是在OCT包埋过程中对胚胎的处理13,14。要将每个胚胎精确地定向于相同的横断面平面具有挑战性，因为需要确保所有胚胎的切片均来自大致相同的解剖区域。我们发现，使用细规格针头在黏稠的OCT介质中进行微小而精准的调整以实现胚胎定位，效果优于使用镊子；后者体积过大，容易扰动大量OCT介质。第二个关键步骤发生在冷冻组织块切片过程中，若缺乏足够的训练和经验，很难获得高质量且包含目标组织的切片。因此，我们建议使用测试样本进行练习，直至熟练掌握该技术。第三个关键步骤是盖玻片的移除，此操作可能扰动或剥离组织样本。我们发现，结合轻柔振荡以松动盖玻片，并缓慢将载玻片从PBS容器中取出，是移除盖玻片最有效的方法。操作时应保持手法轻柔且稳定；研究人员可能需要经过若干次尝试与调整，才能掌握有效移除盖玻片的技巧。
本方案中的其他重要步骤包括抗体优化（免疫荧光和免疫组化实验中的一抗和二抗）、组织切片与显色底物及复染剂的孵育。必须充分调研一抗的特异性及其靶标表达水平；通常建议收集足够量的非珍贵样本，至少进行两次独立实验，用于在开展免疫荧光/免疫组化联合检测前优化一抗浓度。每次实验均须设置已知阳性和阴性对照，以确保免疫荧光和免疫组化实验结果可靠。二抗浓度也可能需要调整。免疫组化实验中，组织切片与显色底物及复染剂的孵育时间需进行优化，因为试剂生产商提供的操作指南通常给出较宽的孵育时间范围。并非所有显色剂均与复染剂及组织内源性色素相容，因此在显色剂选择时需仔细规划。
该方案存在多种可能的修改方式，我们已成功使用其他抗体组合实施过本方案，这些抗体无法同时用于免疫荧光染色。如上所述，不同的显色物质与特定的复染剂具有不同的兼容性。我们发现这些组分在方案中很容易进行调整。此外，抗体孵育的参数具有较大的灵活性，可根据所需的染色强度进行相应增加或减少。包埋过程也可进行修改。尽管我们主要采用横切面，但胚胎可轻易地以任意方向进行定向，以针对特定感兴趣组织。最后，本方案中存在多个可能的暂停节点：脱水后的胚胎可在-20 °C条件下保存于100%甲醇中数月；冷冻组织块可在-80 °C条件下保存长达三个月；制备好的载玻片可在-80 °C条件下于载片盒中保存长达九个月。
由于该联合免疫荧光（IF）与免疫组化（IHC）方案相对复杂，可能存在多种导致变异或错误的因素，需要进行问题排查，这些因素包括组织质量、研究人员经验以及样本处理等。上述描述的大多数关键步骤之所以被视为关键，是因为它们要么需要在个体用户层面进行优化，要么需要特定的灵巧性、技能和经验。然而，我们发现非特异性背景染色和信号强度低是需要优化的最主要问题。与任何IF或IHC方案一样，解决这些问题可能耗时且劳动强度大，而由于本方法结合了两种技术，问题可能更为复杂。因此，我们强烈建议在进行联合方案之前，先分别对IF和IHC进行单独优化。
尽管我们预测该方法将适用于多种实验，但仍存在一些潜在的局限性。该实验的成功实施依赖于在包含多个洗涤步骤的两个连续实验过程中保持组织样本的完整性。因此，在切片或组织处理过程中出现的任何问题（包括使用可能因存放过久而导致质量下降的旧切片），都将显著影响研究人员成功执行本方案的能力。尽管切片在-80 °C条件下可保存长达九个月，但组织与载玻片之间的黏附性会随时间推移而下降；我们发现，在制备后一个月内使用切片可获得最佳效果，理想情况下应在制备后的次日即使用。第二个局限性在于斑马鱼胚胎体积较小。虽然我们发现该实验方法在可视化早期胚胎中相对高表达的蛋白质方面具有实用价值，但对于表达不一致或表达水平较低的蛋白质，可能很难在切片中被检测到。最后，由于本方案采用10‒12 µm的冷冻切片，因此更适合用于评估较大结构（如细胞核）中的蛋白质表达，而不适用于较小的亚细胞组分。
总之，我们结合的免疫荧光/免疫组化（IF/IHC）方案将对多种早期斑马鱼胚胎研究具有显著优势，并在此类样本的精确蛋白表达分析中代表了一项重要创新。我们的方法已在图5中成功展示，可使研究人员在使用目前适用于斑马鱼物种免疫荧光或免疫组化检测、但种类有限的经验证一抗时，仍能保持早期斑马鱼胚胎冰冻切片中精细的形态结构。该方案可能也适用于其他鱼类和两栖类物种（例如Medaka和Xenopus spp.）的研究，这些物种同样受限于可用抗体的种类不足，甚至也可能适用于传统的哺乳动物模型。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院资助项目5K01OD021419-02和北卡罗来纳州立大学兽医学院资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15/25 | N/A | N/A | 15% 鱼明胶/25% 蔗糖（w/v），用 dH2O 配制 |
| Alexa 555 二抗 | Invitrogen | A21429 | 免疫荧光实验中以 1:2,000 比例稀释于封闭缓冲液中使用 |
| 抗体稀释液 | Dako | S3022 | |
| 背景阻断剂（Background Buster） | Innovex | NB306 | |
| 封闭缓冲液（IF） | N/A | N/A | 含 5% 正常山羊血清和 0.1% Triton X-100 的 1x PBS 溶液 |
| cellSens 成像软件 | Olympus | cellSens | 与复合光学显微镜联用的成像软件 |
| 嵌合斑马鱼胚胎 | N/A | N/A | 在 48 hpf 时分析的 AB 野生型嵌合斑马鱼胚胎 |
| 复合光学显微镜 | Olympus | BX51 | 与数码相机及 cellSens 成像软件联用，用于免疫组化后的图像采集 |
| 共聚焦荧光显微镜 | Leica | DM 2500 | 与数码相机及 Leica Application Suite Advanced Fluorescence 成像软件联用，用于免疫荧光后的图像采集 |
| 一次性塑料模具，15 mm × 15 mm × 5 mm | Ted Pella | 27147-2 | |
| 光学显微镜用数码相机 | Olympus | DP27 | |
| 荧光显微镜用数码相机 | Leica | TCS SPE | |
| 乙醇 | Koptec | V1001 | |
| 鱼明胶 | Sigma | G7041 | |
| 载玻片 | Fisher | 12-550-15 | |
| 过氧化氢，30% | Fisher | H325-100 | |
| ImmPRESS HRP 聚合物检测试剂盒 | Vector | MP-7401 | 兔源二抗，HRP 聚合物 |
| Leica Application Suite Advanced Fluorescence 成像软件 | Leica | LAS AF 2.3.6 | 与共聚焦荧光显微镜联用的成像软件 |
| 甲醇 | Fisher | A452-4 | |
| 改良 Meyer 苏木精染液 | Thermo | 72804 | |
| 正常山羊血清 | MP Biomedical | 191356 | |
| OCT 包埋介质 | Tissue-Tek/Fisher | 4583/4585 | |
| 抗俄勒冈绿抗体（anti-Oregon Green antibody） | Molecular Probes/Life Technologies | A889 | 免疫组化中以 1:7500 比例稀释使用 |
| 俄勒冈绿葡聚糖（Oregon Green Dextran） | Invitrogen | P7171 | 以 2.5% 溶于 0.2 M KCl 中使用 |
| 4% 多聚甲醛 | Acros Organics | 416780030 | 在实验室中用 1x PBS 配制 |
| Permount 封片剂 | Fisher | SP15 | |
| 1x 磷酸盐缓冲液（PBS） | 实验室自配 | N/A | 50 mL 10x PBS，加 dH2O 定容至 500 mL |
| 10x 磷酸盐缓冲液（PBS） | 实验室自配 | N/A | 参照冷泉港实验室方案配制 |
| 1x PBSt | 实验室自配 | N/A | 50 mL 10x PBS，1 mL 10% Tween 20，加 dH2O 定容至 500 mL |
| 抗组蛋白 H3（Ser10 磷酸化）抗体 | Santa Cruz | sc-8656-R | 免疫荧光中以 1:500 比例稀释使用 |
| Scott's 自来水替代液 | Electron Microscopy Sciences | 26070-06 | 除 EMS 外，其他品牌亦可成功使用 |
| 蔗糖 | Amresco | 335 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | |
| TO-PRO3 | Invitrogen | T3605 | 免疫荧光中以 1:1,000 比例溶于 1x PBS 使用 |
| 1x Tris 缓冲盐水（TBS） | 实验室自配 | N/A | 50 mL 10x TBS，加 dH2O 定容至 500 mL |
| 10x Tris 缓冲盐水（TBS） | 实验室自配 | N/A | 85 g NaCl，61 g Tris 碱，加 dH2O 定容至 1 L |
| 1x TBSt | 实验室自配 | N/A | 50 mL 10x TBS，1 mL 10% Tween 20，加 dH2O 定容至 500 mL |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Vectashield 封片剂 | Vector | H-1000 | 非硬化型封片介质 |
| Vector NovaRed 底物 | Vector | SK-4800 | HRP 底物 |
| 二甲苯 | Fisher | X3P-1GAL |
参考文献
- Whole-mount IHC protocol for zebrafish embryos [Internet]. GeneTex. , Irvine. Available from: http://www.genetex.com/uploaddata/Protocol/Document/IHC-WM.pdf (2013).
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- Kogata, N., Howard, B. A. A whole-mount immunofluorescence protocol for three-dimensional imaging of the embryonic mammary primordium. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 18 (2), 227-231 (2013).
- Santos, D., Monteiro, S., Luzio, A. General Whole-Mount Immunohistochemistry of Zebrafish (Danio rerio) Embryos and Larvae Protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Sexton, J. M., Hickstein, D. D. Expression of KRASG12V in Zebrafish Gills Induces Hyperplasia and CXCL8-Associated Inflammation. Zebrafish. 12 (3), 221-229 (2015).
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