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CRISPR/Cas12a 对 Saccharomyces cerevisiae 的多重基因组编辑及酵母像素艺术的创建

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DOI：

10.3791/59350

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2019年5月28日

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1DSM Biotechnology Center, 2Biochemistry and Molecular Biology, Department of Chemistry, University of Hamburg, 3BrisSynBio, University of Bristol, Life Sciences Building, 4School of Biological Sciences, University of Bristol, Life Sciences Building

本文内容

摘要

CRISPR/Cas12a 系统结合单个 crRNA 阵列，可在多个位点同时实现对 S. cerevisiae 基因组的高效多重编辑。通过构建能够产生类胡萝卜素的酵母菌株，并进一步用于制作酵母像素艺术，验证了该方法的有效性。

摘要

高效率、易用性以及多重适应性使得成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9（CRISPR/Cas9）系统在高级基因修饰中得到广泛应用 Saccharomyces cerevisiae，一种工业生物技术中的模式生物和常用工作平台。本研究应用了CRISPR相关蛋白12a（Cas12a），这是一种RNA引导的内切酶，其特性与Cas9有明显区别，进一步拓展了基因组编辑的分子工具箱。CRISPR/Cas12a系统的一个优势在于，它可通过单一转录单元（单个CRISPR RNA（crRNA）阵列）表达多个引导RNA，实现多重基因组编辑。本文提供了一种将多个异源基因同时整合到 S. cerevisiae 利用CRISPR/Cas12a系统，通过单一crRNA阵列构建体表达多个crRNA，对基因组进行编辑。该方法利用了 S. cerevisiae 执行 体内 将DNA片段重组，以将单个crRNA阵列组装到可用于转化子筛选的质粒中，同时组装可整合至基因组预定位置的供体DNA序列。Cas12a被组成型预先表达，以促进对靶位点的切割 S. cerevisiae 在表达单个crRNA阵列后，可在基因组的预定位置实现编辑。本方案包括单个crRNA阵列和供体DNA表达盒的设计与构建，并采用一种基于独特50 bp DNA连接序列和独立整合侧翼DNA序列的整合策略，通过标准化和模块化简化实验设计，同时拓展应用范围。最后，我们展示了一种利用声波液体处理仪和构建的不同颜色类胡萝卜素产生型酵母菌株创建酵母像素艺术的简便技术。

引言

CRISPR/Cas 酶无疑彻底改变了分子生物学，并作为基因组编辑工具被广泛采用，其编辑速度是此前无法实现的1。DiCarlo 等2首次报道了利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统对 Saccharomyces cerevisiae基因组进行修饰，成功实现了基因敲除，并利用外源引入的寡核苷酸完成定点突变。后续酵母CRISPR工具箱的发展包括：将无催化活性的“死亡”Cas9（dCas9）与转录效应结构域融合，实现转录的激活与沉默3；在代谢通路工程中同时应用基因组编辑与调控功能，实现基因的同步激活、抑制和删除4；从S. cerevisiae基因组中删除大片段序列5；以及多条染色体的融合6。

CRISPR/Cas基因组编辑系统起源于细菌和古菌的适应性免疫系统，分子生物学家已将这些系统改造用于基因组编辑。其功能基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）DNA区域，该区域编码可识别外源DNA或RNA的RNA，以及CRISPR相关基因（Cas），后者编码RNA引导的内切核酸酶。1,7,8,9根据最近对CRISPR/Cas系统的基因组分析，建议将CRISPR/Cas系统分为两类、五种类型和16个亚型10这两类系统根据参与靶标切割的效应复合物的结构特征加以区分。通常，具有多亚基结构的CRISPR/Cas系统被归类为1类，而具有单亚基效应复合物的系统则属于2类。10,11在本文中，我们探讨了第二类V型Cas12a，此前称为Cpf110,12，是II型Class 2 Cas9的一种替代工具。尽管Cas9在研究中已被充分表征并广泛应用，Cas12a仍具备额外的优势特性12首先，Cas12a 形成一个 与42至44个核苷酸长度的CRISPR RNA（crRNA）形成复合物，无需额外的反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）。因此，在CRISPR/Cas12a系统介导的基因组编辑中，可使用比CRISPR/Cas9更短的引导RNA。其次，Cas12a独特的内切核酸酶和内切核糖核酸酶活性使其能够对前体crRNA进行成熟加工。13这种RNase活性使得多个crRNA可以在单个CRISPR crRNA阵列上进行编码，而Cas9则需要分别表达每一个所谓的单导向RNA （sgRNA），或者例如表达额外的内切核酸酶（例如，Csy4）与围绕每个sgRNA的Csy4识别基序联用14,15第三，Cas12a识别靶位点需要在靶序列5’端存在原间隔序列邻近基序（PAM），并在PAM下游+18至+23位点后进行切割，产生具有黏性末端的DNA片段；而Cas9则需要PAM位于靶序列的3’端，并在PAM上游-3位点后切割，产生平末端的DNA断裂12第四，Cas12a 的 PAM 共识核苷酸序列为 (T)TTV，而 Cas9 为 NGG，这使得 Cas12a 成为靶向富含 T 的启动子和终止子序列的有力候选工具。16最后，最近一项研究报道，Cas12a相较于天然Cas9具有更高的靶向特异性17.

我们提出了一种利用CRISPR/Cas12a系统进行基因组编辑的实验方案 S. cerevisiae 特别关注使用单个crRNA阵列同时将多个DNA表达盒引入独立基因组位点（多重基因组编辑）。该方案的关键步骤如图所示 图1作为概念验证，CRISPR/Cas12a 系统被用于将三个表达盒导入基因组中 S. cerevisiae 可实现β-胡萝卜素的生产18 如示意图所示 图2β-胡萝卜素的产生影响表型 S. cerevisiae: 即在成功导入类胡萝卜素生物合成所需的全部三种异源基因后，原本白色的 S. cerevisiae 细胞会根据各基因启动子的表达强度呈现黄色或橙色。由于该通路具有简单的可视化读出特性，已被用于开发先进的基于CRISPR的基因组编辑系统与方法。19,20. 在本研究中，表达盒编码类胡萝卜素基因 crtE, crtYB 和 crtI 已采用黄金门克隆（Golden Gate cloning, GGC）方法构建21 使用异源启动子和同源终止子驱动基因表达。表达盒两侧被称为连接子（connectors）的特异性50个碱基对（bp）序列所包围，这些序列可用于 体内 通过使用含有相同50 bp序列的整合侧翼DNA序列（侧翼区域），将目标片段组装并整合到酵母基因组DNA中由侧翼区域指定的位置。通过采用不同强度的启动子，获得了类胡萝卜素产量水平不同的菌株，从而导致细胞颜色产生差异。这些菌株——灵感来自“Yeast Art Project”22 - 采用声波液体处理器点样系统，利用四种颜色的酵母菌株创建了一幅高分辨率的罗莎琳德·富兰克林“酵母照片”。富兰克林（1920–1958）是英国化学家和X射线晶体学家，因通过“照片51号”对DNA结构的发现作出重要贡献而闻名23,24,25.

方案

1. Cas12a 质粒的制备

注意：含有质粒的 毛螺菌科 为在细菌 ND2006 中表达而密码子优化的 Cas12a（LbCpf1，pCSN067） S. cerevisiae此前已构建19，储存于质粒储存库（参见 材料清单）。这是一种单拷贝附加体 S. cerevisiae/E. coli 含有 KanMX 抗性标记基因的穿梭质粒，用于筛选 S. cerevisiae 遗传霉素（G418）上的转化子

  1. 获取 pCSN067 质粒（参见材料表）。
  2. 扩增 pCSN067 质粒以获得大量产物。
    1. 根据生产商说明书，将 25 µL 购买的化学感受态 E. coli 细胞用 pCSN067 质粒进行转化。将转化混合物用 2x 蛋白胨-酵母（PY）培养基分别稀释 10 倍和 50 倍。将 10 倍和 50 倍稀释液涂布于含氨苄青霉素（0.1 g/L）的 2x PY 琼脂平板上，37 °C 过夜培养。
    2. 挑取 2 至 3 个单菌落，分别接种于 3 mL 的 2x PY 培养基中，于 37 °C、180 rpm 摇床中过夜培养。
    3. 根据生产商说明书，使用质粒提取试剂盒纯化质粒。

2. 单一crRNA阵列表达盒的制备

  1. 制备单条crRNA阵列。
    注意：单个crRNA阵列包含一个 SNR52 来自RNA聚合酶III的启动子 S. cerevisiae2，LbCas12a特异的直接重复序列以及间隔序列（基因组靶标序列），每个靶标均重复上述结构19 并以一个 SUP4 终止子来自 S. cerevisiae2单个crRNA阵列通过组装而成 体内 重组至线性化质粒 pRN1120 中以生成环状质粒，因此单 crRNA 阵列的起始和终止位置必须包含与质粒 pRN1120 同源的区域（参见 图2A建议预先分别评估设计的若干条 crRNA 的功能。19随后利用该信息筛选出功能最强的crRNA，将其整合到直接重复序列和间隔序列中，构建用于多重检测的单个crRNA阵列。
    1. 为多重基因组编辑实验订购合成DNA形式的单个crRNA阵列（参见单个crRNA阵列的DNA序列于 补充表 1).
    2. 扩增订购的单个crRNA阵列（例如，使用引物 KC-101 和 KC-102（补充表 2)). 准备包含以下组分的PCR扩增混合液： 0.5 µL DNA聚合酶 10 µL DNA聚合酶所需的5倍缓冲液用量 1 µL 10 mM dNTPs 2.5 µL 的 10 µM 上游引物， 2.5 µL 的 10 µM 反向引物， 2 µL 5 ng/μL 的 DNA 模板µL 和超纯H2O 加至总体积为 50 µL.
      1. 在热循环仪中进行反应，程序如下：(i) 98 °C 3 分钟，（ii） 98 °C 10 秒，（iii） 60 °C 20 秒，（iv） 72 °C 15秒——重复步骤（ii）至（iv）30次，（v） 72 °C 5 分钟（vi）保持 12 °C 直至进一步分析。
    3. 使用含100至10,000 bp DNA片段的DNA标记物和DNA上样染料，将样品在0.8%琼脂糖凝胶上以5 V/cm的电压电泳40分钟，对PCR产物进行分析。
    4. 使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化PCR产物。
  2. 制备单个crRNA阵列受体质粒。
    注意：单个crRNA阵列由 S. cerevisiae/E. coli 穿梭质粒 pRN112019 （参见 材料清单）。该多拷贝质粒含有 NatMX 抗性标记基因，可用于筛选 S. cerevisiae 在诺尔斯霉素（NTC）上的转化子
    1. 获取 pRN1120 质粒。
    2. 扩增 pRN1120 质粒以获得大量产物。
      1. 转化 25 µL 市售化学感受态 E. coli 根据制造商的说明，用质粒 pRN1120 转化细胞。用 2x PY 培养基将转化混合物稀释 10 倍和 50 倍。取 10 倍和 50 倍稀释液分别涂布于含氨苄青霉素（0.1 g/L）的 2x PY 琼脂平板上，37 °C 过夜培养。 37 °C.
      2. 挑选2至3个菌落，分别接种于3 mL 2x PY培养基中，过夜培养，培养温度为 37 °C 在180 rpm的摇床培养箱中。
      3. 使用质粒纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化质粒。
    3. 用线性化质粒 pRN1120 生态RI-HF 和 XhoI. 为此，准备一种消化混合液，其成分为 1 µg pRN1120的 5 µL 10x 缓冲液（1x 缓冲液含有 50 mM 醋酸钾、20 mM Tris-醋酸盐、10 mM 醋酸镁， 100 µg/mL 牛血清白蛋白 [BSA]；pH 7.9 1 µL 的 生态RI-HF（20 U）， 1 µL 的 XhoI (20 U) 和超纯 H2O 加至总体积为 50 µL. 将消化混合液在 37 °C 2小时并灭活 65 °C 20 分钟。
    4. 使用DNA上样染料和含100至10,000 bp DNA片段的DNA Ladder，通过琼脂糖凝胶电泳（0.8%，40分钟，5 V/cm）分析线性化质粒。作为对照，在分析中加入环状质粒。
    5. 使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化线性化质粒。

3. 启动子-开放阅读框-终止子（POT）供体DNA构建体的制备

  1. 订购一组具有不同强度的启动子（P）、开放阅读框（O）和终止子（T）序列的合成DNA，使每个元件包含标准化的4 bp识别序列，该序列两侧带有BsaI酶切位点，以便进行Golden Gate克隆（GGC）组装26（详见补充表3中的详细设计及补充表4中的序列）。
  2. 通过四片段组装，利用GGC反应将包含启动子、开放阅读框、终止子及连接序列的POT表达盒组装至已含有预设50 bp连接序列的目的载体中21（参见补充表4及文献26,27）。
    1. 使用分光光度计测定DNA元件的浓度。将各DNA元件用超纯H2O稀释至终浓度为15 fmol/µL。
    2. 准备反应混合物，包含以下DNA片段：启动子2 µL、开放阅读框2 µL、终止子2 µL、骨架（如文献26所述的1级目的载体）2 µL、5×T4 DNA连接酶缓冲液4 µL、1 U/µL T4 DNA连接酶2.5 µL、20 U/µL BsaI-HF 1.5 µL，并用超纯H2O补足至总体积20 µL。
    3. 在PCR仪中进行GGC反应，程序如下：(i) 37 °C 2分钟，(ii) 16 °C 5分钟——重复步骤(i)和(ii)共50次，(iii) 50 °C 60分钟，(iv) 80 °C 45分钟，(v) 12 °C保存直至后续分析。
  3. 按照生产商说明书，将3 µL GGC反应混合物转化至25 µL购得的化学感受态E. coli28细胞中。用2x PY培养基将转化混合物分别稀释10倍和50倍，取10倍和50倍稀释液涂布于含氨苄青霉素（0.1 g/L）的2x PY琼脂平板，37 °C过夜培养。
  4. 挑选2至3个单菌落，分别接种于3 mL 2x PY培养基中，37 °C、180 rpm振荡培养过夜。
  5. 根据生产商说明书，使用质粒提取试剂盒纯化质粒。
  6. 通过PCR检测POT表达盒是否在GGC反应中正确组装。
    1. 设计引物，使其与每个表达盒起始和末端存在的连接序列互补（见图2B）。本方案中所选连接序列对应的引物为KC-103至KC-108（见补充表2）。
    2. 为每个质粒准备PCR扩增体系：高保真DNA聚合酶0.5 µL、适用于该DNA聚合酶的5×缓冲液10 µL、10 mM dNTPs 1 µL、10 µM正向引物2.5 µL、10 µM反向引物2.5 µL、浓度为5 ng/µL的DNA模板2 µL，并用超纯H2O补足至总体积50 µL。
    3. 在PCR仪中进行PCR扩增，程序如下：(i) 98 °C 3分钟，(ii) 98 °C 10秒，(iii) 60 °C 20秒，(iv) 72 °C 2分30秒——重复步骤(ii)至(iv)共30次，(v) 72 °C 5分钟，(vi) 12 °C保存直至后续分析。
      注：所得PCR产物包含5’端50 bp连接序列、启动子、开放阅读框、终止子及3’端50 bp连接序列。
  7. 通过电泳分析PCR产物：使用DNA上样染料和100–10,000 bp范围的DNA Marker，在0.8%琼脂糖凝胶中以5 V/cm电压电泳40分钟。

4. 含接头序列的整合侧翼DNA序列的制备

  1. 从野生型中纯化基因组DNA S. cerevisiae CEN.PK113-7D29.
    1. 在装有100 mL酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YEPD，2%葡萄糖）培养基的500 mL摇瓶中培养该菌株，于 30 °C 并在250 rpm条件下振荡培养48小时。
    2. 通过离心 2 mL 培养液（16,000 x g 1 分钟后弃去上清液。
    3. 将细胞重悬于生理盐水中（200 µL；0.85% NaCl 溶液）与 RNase（10 µL，10 mg/mL）和酵母裂解酶（4 µL）。将细胞悬液置于培养箱中孵育 37 °C 15 分钟。
    4. 添加 300 µL 细胞裂解液（参见 材料清单）并短暂涡旋振荡。
    5. 添加 168 µL 蛋白质沉淀溶液（参见 材料表）并剧烈涡旋震荡20秒。
    6. 通过16,000 x g离心分离蛋白质组分 g 和 4 °C 10分钟。收集 600 µL 新管中上清液的体积，并与 600 µL 加入异丙醇并短暂涡旋。
    7. 通过在 16,000 x g 下离心回收 DNA g 室温下孵育10分钟。弃去上清液，保留沉淀。
    8. 用……洗涤沉淀物 200 µL 70%乙醇。在16,000 x g 室温孵育10分钟，离心并弃去上清液。打开管盖，室温孵育10分钟以蒸发乙醇。
      注意：若管中液体仍可见，请重复步骤 4.1.8。切勿将沉淀干燥超过 10 min，以免降低 DNA 的溶解度。
    9. 将 DNA 溶解于 50 µL TE 缓冲液中。将纯化的 DNA 储存在 4 °C.
  2. 针对每个整合位点，设计整合侧翼DNA序列（约500 bp），使得在引入供体DNA后，约1000 bp的基因组DNA被移除（参见示意图设计） 图2B 以及序列在 补充表4).
  3. 设计引物以通过 PCR 扩增生成侧翼区域。
    1. 对于 左侧侧翼区设计上下游引物以扩增目标整合位点5'（左侧）约500 bp的基因组DNA区域。
      注意：正向引物包含与目标侧翼区域同源的20 bp序列。反向引物包含与目标侧翼区域同源的20 bp序列，并含有预期的50 bp连接序列，以实现后续操作 体内 Cas12a对基因组编辑中的后续组装。
    2. 对于 右侧侧翼区设计上下游引物，扩增位于目标整合位点3’（右侧）约500 bp的基因组DNA区域。
      注意：上游引物包含与目标侧翼区域同源的20 bp序列，并含有预期的50 bp连接序列，以实现 在体 在后续的基因组Cas12a编辑中进行组装。反向引物包含20 bp与目标侧翼区域同源的序列。
  4. 使用设计的引物扩增侧翼区域（例如，引物 KC-109 至 KC-120 包含在内 补充表 2).
    1. 测定将作为 PCR 模板使用的纯化基因组 DNA 的浓度。将 DNA 浓度调整至 50 ng/μL。µL.
    2. 准备包含基因组 DNA（1 – 4 µL 50 ng/µL 基因组DNA稀释液）在步骤4.1中纯化，正向引物和反向引物（10 µM 每个）， 1 µL 10 mM dNTPs 10 µL DNA聚合酶所需的5倍缓冲液用量 0.5 µL DNA聚合酶（1.0 U）和超纯H2O 至总体积 50 µL.
    3. 使用以下程序在热循环仪中进行PCR反应：（i） 98 °C 3 分钟，（ii） 98 °C 20秒，（iii） 60 °C 20秒，（iv） 72 °C 15秒，重复步骤(ii)至(iv)30次，(v) 72 °C 5 分钟，（vi）保持于 12 °C 直至进一步分析。
  5. 使用含有100至10,000 bp DNA片段的DNA上样染料和DNA Ladder，在0.8%琼脂糖凝胶中以5 V/cm的电压电泳40分钟，分析PCR产物。
  6. 使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化正确的PCR产物。

5. 转化至 S. cerevisiae

注意：采用基于 Gietz et al. (1995)30 和 Hill et al.31 所建立的方法的转化方案，该方案适用于多种 S. cerevisiae 菌株。以下所述方案适用于一次转化实验。

  1. 准备转化所需的溶液。
    1. 配制以下储存液并进行过滤除菌：含有 100 mM Tris-HCl (pH 7.5)、10 mM EDTA 的 10x TE 缓冲液，总体积 50 mL；pH 7.5 的 1 M LiAc，总体积 50 mL；50% PEG 4000，总体积 100 mL。
      注意：务必检查 PEG 4000 储存液的 pH 值是否为 5。该储存液保存时间不应超过一个月。
    2. 使用上述储存液配制以下溶液：配制含 0.1 M LiAc、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA 的 LiAc-TE 溶液，总体积 0.5 mL。配制含 40% PEG 4000、0.1 M LiAc、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA 的 PEG-LiAc-TE 溶液，总体积 1 mL。
      注意：PEG-LiAc-TE 和 LiAc-TE 溶液必须新鲜配制，这对转化成功至关重要。
  2. 第一轮转化（构建预表达 Cas12a 的菌株）。
    注意：在所有转化步骤中，应使用 pH 高于 5 的水。建议在转化的所有步骤中使用去离子水。
    1. 通过在含有 20 mL YEPD（2% 葡萄糖）培养基的 100 mL 摇瓶中培养菌株 CEN.PK113-7D，制备预培养物，并在 30 °C、250 rpm 条件下振荡培养过夜。
    2. 测定预培养物的 OD600（ODpc）。根据预培养物体积与用于转化（转化培养物）的 Cas12a 预表达细胞所需新鲜培养基体积之间的稀释倍数（df）进行计算。在计算中，假设转化培养物的光密度（ODtc）在步骤 5.2.3（ti）所述的培养步骤后为 1.0。
      用于数据分析的静态平衡方程 \(df=\frac{OD_{pc}}{OD_{tc}}\cdot2^{\frac{ti}{\tau}}\)。
      其中 ti 和 τ 分别为培养时间和倍增时间。
      1. 根据稀释倍数计算接种转化培养物（Vtc）所需的预培养物体积（Vi）。
        体积计算公式 Vi=Vtc/df；教育用公式，简洁分析概念。
    3. 用上一步确定的预培养物体积（Vi）接种 20 mL YEPD（2% 葡萄糖）培养基（Vtc），制备转化培养物。在 30 °C、250 rpm 条件下振荡培养。
    4. 测定转化培养物的 OD600，直至达到 OD600 为 1.0。
    5. 通过在 2,500 x g 条件下离心 20 mL 培养液 5 分钟收集细胞。弃去上清液，用 20 mL 室温去离子水洗涤细胞。重复离心步骤，并保留细胞沉淀。
    6. 将细胞重悬于 100 µL LiAc-TE 溶液中，并转移至微量离心管中。
    7. 加入 5 µL 单链载体 DNA（10 mg/mL 鲑鱼精 DNA），并通过移液混匀。
    8. 向微量离心管中加入 1 µg 质粒 pCSN067。
      注意：DNA 混合物的总体积不应超过 100 µL，以避免转化效率降低。
    9. 加入 600 µL PEG-LiAc-TE 溶液，并通过移液混匀。在台式加热块中于 30 °C、450 rpm 条件下孵育 30 分钟。
    10. 向转化混合物中加入 70 µL DMSO（100%），并通过移液混匀。在水浴中于 42 °C 孵育 15 分钟进行热激处理。
    11. 将混合物转移至 15 mL 圆底管中以回收细胞，并向管中加入 10 mL YEPD（2% 葡萄糖）。在 30 °C、250 rpm 条件下振荡培养过夜。
    12. 在 2,500 x g 条件下离心转化混合物 5 分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于约 200 µL 剩余溶液中。
    13. 取 150 µL 转化混合物及其在 YEPD（2% 葡萄糖）中的 20 倍稀释液，涂布于添加了 0.2 g/L G418 的 YEPD（2% 葡萄糖）琼脂平板上。在 30 °C 培养 48–72 小时。
    14. 挑取单个转化子，并在添加了 0.2 g/L G418 的 YEPD（2% 葡萄糖）琼脂平板上重新划线，以获得单菌落。
  3. 第二轮转化（利用 CRISPR/Cas12a 进行多重基因组编辑）。
    1. 在含有 20 mL YEPD（2% 葡萄糖）培养基并添加了 0.2 g/L G418 的 100 mL 摇瓶中培养第一轮转化（步骤 5.2）构建的预表达 Cas12a 的菌株，制备预培养物。在 30 °C、250 rpm 条件下振荡培养过夜。
      注意：对于多次转化，需调整预培养物的体积。
    2. 按照第一轮转化的步骤 5.2.2 至 5.2.7 操作。
      注意：对于多次转化，需调整所需溶液的体积以及预表达 Cas12a 菌株的培养量。
    3. 向微量离心管中加入 1 µg 单 crRNA 阵列、1 µg 用于 crRNA 阵列的线性化受体质粒、1 µg 供体 DNA 以及各 1 µg 的侧翼区域（步骤 4.3）。
      注意：DNA 混合物的总体积不应超过 100 µL，以避免转化效率降低。
    4. 为转化准备以下对照：阴性对照（超纯 H2O）；用于测定转化效率的阳性对照（1 µg 环状 pRN1120）；验证供体 DNA 是否通过 CRISPR 编辑引入的对照（1 µg 环状 pRN1120、1 µg 所有供体 DNA 表达盒和 1 µg 侧翼区域，但无单 crRNA 阵列）；验证供体 DNA 是否可在靶点外整合的对照（1 µg 线性化 pRN1120、1 µg 供体 DNA 表达盒和 1 µg 单 crRNA 阵列，但无侧翼区域）；验证 pRN1120 完全线性化的对照（1 µg 线性化 pRN1120）。
    5. 按照第一轮转化的步骤 5.2.9 至 5.2.12 操作。
    6. 取 150 µL 转化混合物及其在 YEPD（2% 葡萄糖）中的 20 倍稀释液，涂布于添加了 0.2 g/L G418 和 0.2 g/L NTC 的 YEPD（2% 葡萄糖）琼脂平板上。将对照涂布于添加了相应选择剂（G418 和/或 NTC 或无选择剂）的 YEPD（2% 葡萄糖）琼脂平板上。在 30 °C 培养 48–72 小时。
    7. 挑取单个有色转化子，并在 YEPD（2% 葡萄糖）琼脂平板上重新划线，以获得单个有色菌落。

6. 基因组编辑效率的评估

  1. 计数转化平板上着色菌落和白色菌落的数量。
  2. 通过将着色菌落数除以菌落总数（包括白色和着色菌落）来计算基因组编辑效率，如Table 1所示。

7. 确认供体 DNA 在目标位点的整合

  1. 从转化平板上选取一个带有颜色的单菌落，在不含 G418 和 NTC 选择剂的 YEPD（2% 葡萄糖）琼脂平板上重新划线，并于 30 °C 培养 48 小时。
  2. 挑取单菌落接种至装有 100 mL YEPD（2% 葡萄糖）培养基的 500 mL 摇瓶中，在 30 °C、250 rpm 振荡条件下培养 48 小时。
  3. 按照第 4.1 节所述方法提取基因组 DNA。
    注意：也可选用 Looke et al.32 之前提出的用于酵母菌落 PCR 的制备方案。若采用此方法，可省略液体培养基中的培养步骤（第 7.2 节）。
  4. 通过扩增每个整合表达盒的两个片段来验证正确整合。
    1. 设计引物，使其与转化片段侧翼区以外的基因组 DNA 及目的基因结合（参见补充表 2中的示例，KC-121 至 KC-132）。使用引物 KC-121 至 KC-132 时，PCR 程序中的退火温度应设为 62 °C。
    2. 按照第 4.4.2 节所述方法扩增目标区域。根据模板长度及 DNA 聚合酶生产商的建议，调整 PCR 程序中的延伸步骤时间。
  5. 使用 DNA 上样染料和含有 100 至 10,000 bp DNA 片段的 DNA Marker，在琼脂糖凝胶（0.8%，40 分钟，5 V/cm）上通过电泳检测 PCR 产物的大小。

8. 使用声学液体处理器创建酵母像素艺术

  1. 准备酵母菌像素画的图片模板。
    1. 调整原始RGB图像的大小（220 × 280像素，参见代表性结果） 例如 使用 ImageJ 生成最终的 64 × 96 像素（宽 × 高）灰度图像，并以预期颜色呈现（代表性结果）。
    2. 使用以下公式将 RGB 图像转换为灰度图像：
      灰度强度公式，\(I_{gr} = (I_r + I_g + I_b) / 3\)，方程，颜色处理
      其中 I克, Ir, Ig, Ib 分别为灰色、红色、绿色和蓝色的强度。
    3. 为了对像素进行分类，开发一个 ImageJ 插件并应用以下规则：（a）如果 I克 ≤ 64 时，使用深橙色酵母（菌株 1， 补充表3）作为该像素的值。（b）如果64 < I克 ≤ 128，使用橙色酵母（菌株2， 补充表格 3）作为该像素的值。（c）如果128 < Igr ≤ 192，使用黄色酵母（菌株3， 补充表格 3）作为该像素的值。(d) 如果 I克 > 192，使用白色酵母（CEN.PK113-7D）作为此像素。
  2. 点样酵母细胞以创建酵母像素艺术。
    1. 接种500 mL摇瓶，内含100 mL YEPD（2%葡萄糖）培养基，分别接种三种不同颜色的类胡萝卜素生产菌株 S. cerevisiae 菌株与野生型 CEN.PK113-7D。将培养物在 30 °C 下过夜培养 30 °C 以250 rpm的转速振荡。
    2. 将0.5 mL的过夜培养物转移至装有0.5 mL无菌非离子密度梯度介质的离心管中（参见 材料清单）。短暂涡旋振荡混匀。
    3. 将细胞悬液转移至经认证的储液槽，2 × 3 孔。使用声波液体处理仪从经认证的储液槽源板向微孔板进行点样（参见 材料清单) 加入 50 mL YEPD（2% 葡萄糖）琼脂。为简化涂布操作，可在平板上划定区域。 例如使用微孔板作为6144孔板（64 × 96）。
    4. 点样 25 nL 的每种样品 S. cerevisiae 使用带有流体校准设置的 .csv 文件，从 2x 3 孔储液板中移取菌株 6RES_AQ_GPSA2 转移到目标微孔板上。将每个25 nL液滴定义为64 × 96网格中的一个像素，该网格对应于微孔板的孔位（A01、B01、C01） 等等.).
    5. 将微孔板置于培养箱中孵育 30 °C 48 小时。为增强菌株的颜色，将琼脂平板置于 4 °C 至少 72 小时。

结果

通过构建三种表达 crtE、crtYB 和 crtI 基因的类胡萝卜素合成型 S. cerevisiae 菌株，展示了利用 CRISPR/Cas12a 进行多重基因组编辑的实验方案，这些菌株分别使用了强、中、弱三种不同强度的异源启动子：分别为菌株1、菌株2和菌株3（补充表3）。构建这些菌株需要为每个菌株生成三个供体DNA表达盒以及六段侧翼区域，以靶向基因组DNA中的三个不同位点（见图2B）。如本文所述，启动子、开放阅读框、终止子以及两个连续的50 bp连接序列通过Golden Gate克隆反应组装成一个表达盒，并通过PCR验证组装结果（图3A）。单个crRNA阵列以合成DNA片段形式订购，并通过PCR扩增获得（图3B）。用于插入单个crRNA阵列的受体质粒（质粒pRN1120）使用EcoRI-HF和XhoI进行线性化处理，并通过电泳确认线性化效果（图3C）。所引入的供体DNA表达盒及侧翼区域的设计与核苷酸序列详见补充表3和补充表4。单个crRNA阵列表达盒的序列见补充表1。单个crRNA阵列中包含的间隔序列（spacer）的功能此前已通过单重基因组编辑实验结合单个crRNA进行了验证19。

使用Cas12a进行基因组编辑的效率首先根据转化后获得的有色菌落数量进行评估（表1，图4）。所构建的三种菌株的编辑效率在50%至94%之间。值得注意的是，用于构建菌株1的表达盒引入后表现出最低的编辑效率，这可能与供体DNA的性质有关（即，这些表达盒在三个强启动子控制下分别编码crtE、crtYB和crtI）。其次，通过PCR验证了三个供体DNA表达盒在基因组DNA目标位点的正确整合（图5）。引物设计的原则是仅在供体DNA正确整合至目标位点时才能扩增出PCR产物。在每次转化实验中，从转化平板上挑选8个菌落进行检测（注意：图5中仅展示了其中3个）。总体而言，每种供体DNA检测的8个菌落中，>90%的转化子在INT1位点实现了crtE供体DNA的正确整合，在INT2位点实现了crtYB的正确整合，以及在INT3位点实现了crtI的正确整合。这些结果表明，CRISPR/Cas12a系统结合单个crRNA阵列能够实现对S. cerevisiae基因组多个位点的高效多重编辑。

此外，我们利用构建的三种产类胡萝卜素的酵母菌株以及一种无色的野生型菌株，展示了“酵母像素艺术”的创建过程。以罗莎琳德·富兰克林的黑白图像（图6A）为起点，生成了一幅四色图像（图6B）及相应的点样列表，并使用声波液体处理仪将四种不同的酵母菌株点样到琼脂微孔板上，最终形成了一幅高分辨率的罗莎琳德·富兰克林“酵母画像”（图6C,D,E）。

Cas12a编辑用单个crRNA阵列制备流程图；PCR方法及酵母像素艺术结果。
图1：CRISPR/Cas12a 多重基因组编辑实验方案的工作流程 S. cerevisiae. 该流程包含本方法的关键步骤。详细信息请参见实验方案。 请点击此处以查看此图的放大版本。

CRISPR-Cas12a 基因编辑示意图；含 crRNA 的线性化载体，展示切割位点
图2CRISPR/Cas12a 多重基因组编辑使用单个 crRNA 阵列的示意图 (A单个crRNA阵列由三个成熟形式的crRNA单元组成，每个单元包含一个针对LbCas12a的20 bp直接重复序列（灰色方块）和一个23 bp的引导序列（彩色菱形）。crRNA阵列的表达由 SNR52 启动子和 SUP4 终止子。转化 S. cerevisiae 使用线性化的pRN1120以及含有与pRN1120同源序列的单个crRNA阵列表达盒（斜线纹）可实现 体内 在预先表达 LbCas12a 的细胞中重组为环状质粒。随后由 Cas12a 对单个 crRNA 阵列进行加工。BCas12a 被引导至预期的基因组靶位点 INT1、INT2 和 INT3，并产生双链断裂。在转化体系中加入了包含侧翼区域和类胡萝卜素基因表达盒的供体 DNA。供体 DNA 组装体被靶向至基因组 DNA 中 INT1 位点附近的连续 DNA 区域crtE），INT2（crtYB) 和 INT3 (crtI位点通过 体内 由于存在50 bp的同源连接序列（标记为5、A、B、C、D或E）而发生重组。P1–P3，不同的启动子；T1–T3，不同的终止子。该图已根据Verwaal的资料修改 等 201819. 使用合成生物学开放语言（SBOL）视觉符号表示的遗传构建体40. 请点击此处以查看此图的放大版本。

凝胶电泳分析；DNA分离；ladder；bp标记；结果；分子生物学实验。
图3：PCR验证基因组编辑实验。（A）组装的供体DNA片段的Golden Gate克隆反应验证。获得的结果与预期长度一致。（B）单个crRNA阵列的PCR。（C）质粒pRN1120的线性化。请点击此处查看该图的放大版本。

琼脂平板上细菌菌落生长、对比图、实验结果、微生物分析。
图 4：S. cerevisiae 利用多重基因组编辑方法进行转化的平板图。 （A）菌株 1 在三个强启动子驱动下表达 crtE、crtYB 和 crtI（深橙色菌落）。（B）菌株 2 在三个中等强度启动子驱动下表达 crtE、crtYB 和 crtI（橙色菌落）。（C）菌株 3 在三个弱启动子驱动下表达 crtE、crtYB 和 crtI（黄色菌落）。请点击此处查看此图的放大版本。

显示DNA片段分离和基因编辑菌落鉴定的凝胶电泳结果
图 5：通过PCR验证供体DNA表达盒在基因组DNA目标位点的整合情况。（A）菌株1的三个菌落的验证结果。（B）菌株2的三个菌落的验证结果。（C）菌株3的三个菌落的验证结果。请点击此处查看该图的高清版本。

罗莎琳德·富兰克林照片转化为3D图像；实验室中的分光光度计装置；彩色像素化效果。
图6：罗莎琳德·富兰克林的酵母像素艺术图。（A）用作模板的220 × 280像素罗莎琳德·富兰克林黑白RGB照片。（B）将罗莎琳德·富兰克林的黑白照片通过计算机转换为4色、64 × 96像素的列表。（C）酵母像素艺术图，包含64 × 96个酵母菌落，图中附带局部放大区域。（D）声学液体处理仪的照片，旁边放置两个完全培养的平板。（E）完全培养的微孔板照片，其上含有64 × 96个酵母菌落。请点击此处查看该图的高清版本。

菌株 1菌株 2菌株 3
有色菌落16279220
白色菌落161818
总菌落数32297238
转化效率50%94%92%

表1：多重基因组编辑方法的编辑效率。

crRNA 阵列序列a,b,c,d,e,f
CATGTTTGACAGCTTATCATCGATAATCCGGAGCTAGCATGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGTCTTTGAAAA
GATAATGTATGATTATGCTTTCACTCATATTTATACAGAAACTTGATGTTTTCTTTCGAGTATATACAAGG
TGATTACATGTACGTTTGAAGTACAACTCTAGATTTTGTAGTGCCCTCTTGGGCTAGCGGTAAAGGTGCGCA
TTTTTTCACACCCTACAATGTTCTGTTCAAAAGATTTTGGTCAAACGCTGTAGAAGTGAAAGTTGGTGCGC
ATGTTTCGGCGTTCGAAACTTCTCCGCAGTGAAAGATAAATGATCAATTTCTACTAAGTGTAGAT
CTGGTGGGAGAGAAAGCTTATGAAATTTCTACTAAGTGTAGATGTGCCGTAC
GCCGGAGCCGACGGAATTTCTACTAAGTGTAGATTGCCCCTCTTATACGATTATATTTT
TTTTTGTTTTTTATGTCTGGGGGGCCCGGTACCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGG
GTTAATTCCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG
a. 与 pRN1120 同源（粗体）。
b. SNR52 启动子（斜体）。
c. 基因组靶序列（下划线）。
d. 针对 LbCas12a 的向导直接重复序列（斜体，粗体）。
e. SUP4 终止子（斜体）。
f. 与 pRN1120 同源（粗体）。

补充表 1：与质粒 pRN1120 具有同源性的 LbCas12a 单 crRNA 阵列。

名称序列a描述b使用步骤
KC-101CATGTTTGACAGCTTATCATC用于扩增单个crRNA阵列的正向引物2.1.4
KC-102CACACAGGAAACAGCTATGAC用于扩增单个crRNA阵列的反向引物2.1.4
KC-103AAGCGACTTCCAATCGCTTTGC用于扩增含连接子5的供体DNA的正向引物3.6.1
KC-104AAAGCAAAGGAAGGAGAGAAC用于扩增含连接子A的供体DNA的反向引物3.6.1
KC-105CGGATCGATGTACACAACCG用于扩增含连接子B的供体DNA的正向引物3.6.1
KC-106CAACAGGAGGCGGATGGATATAC用于扩增含连接子C的供体DNA的反向引物3.6.1
KC-107AACGTTGTCCAGGTTTGTATCC用于扩增含连接子D的供体DNA的正向引物3.6.1
KC-108AGGTACAACAAGCACGACCG用于扩增含连接子E的供体DNA的反向引物3.6.1
KC-109CACTATAGCAATCTGGCTATATG用于扩增含连接子5的INT1 5'端的正向引物4.4
KC-110AAACGCCTGTGGGTGTGGTAC
TGGATATGCAAAGCGATTGGAA
GTCGCTTGACTCCTCTGCCGTC
ATTCC		用于扩增含连接子5的INT1 5'端的反向引物4.4
KC-111TTGCCCATCGAACGTACAAG
TACTCCTCTGTTCTCTCCTTCCTT
TGCTTTAAGCGTTGAAGTTTCCTC
TTTG		用于扩增含连接子A的INT1 3'端的正向引物4.4
KC-112TGTCAACTGGAGAGCTATCG用于扩增含连接子A的INT1 3'端的反向引物4.4
KC-113AGAAGATTTCTCTTCAATCTC用于扩增含连接子B的INT2 5'端的正向引物4.4
KC-114TGCTAAGATTTGTGTTCGTT
TGGGTGCAGTCGGTTGTGTACAT
CGATCCGCCCTTATCAAGGATACC
TGGTTG		用于扩增含连接子B的INT2 5'端的反向引物4.4
KC-115ACGCTTTCCGGCATCTTCCA
GACCACAGTATATCCATCCGCCT
CCTGTTGGGCGATTACACAAGCG
GTGG		用于扩增含连接子C的INT2 3'端的正向引物4.4
KC-116TCTCCTCTTCGATGACCGGG用于扩增含连接子C的INT2 3'端的反向引物4.4
KC-117GGTCGTTTTTGTGCAGCATATTG用于扩增含连接子D的INT3 5'端的正向引物4.4
KC-118GCGGAATATTGGCGGAACGG
ACACACGTGGATACAAACCTG
GACAACGTTTTCCAAGGAGGTG
AAGAACG		用于扩增含连接子D的INT3 5'端的反向引物4.4
KC-119AAATAACCACAAACATCCTT
CCCATATGCTCGGTCGTGCTTGTT
GTACCTGATGGGACGTCAGCACT
GTAC		用于扩增含连接子E的INT3 3'端的正向引物4.4
KC-120GAGCTTACTCTATATATTCATTC用于扩增含连接子E的INT3 3'端的反向引物4.4
KC-121GTTACTAAACTGGAACTGTCCG用于验证con5-crtE-conA整合至INT1 5'端的正向引物7.4.1
KC-122CACTGCTAACTACGTTTACTTC用于验证con5-crtE-conA整合至INT1 3'端的正向引物7.4.1
KC-123CACTGGAACTTGAGCTTGAG用于验证conB-crtYB-conC整合至INT2 5'端的正向引物7.4.1
KC-124GTCTCCAGCTGAATTGGTCC用于验证conB-crtYB-conC整合至INT2 3'端的正向引物7.4.1
KC-125CTCTCATGAAGCAGTCAAGTC用于验证conD-crtI-conE整合至INT3 5'端的正向引物7.4.1
KC-126GATCGGTCAATTAGGTGAAG用于验证conD-crtI-conE整合至INT3 3'端的正向引物7.4.1
KC-127CCTTGTCCAAGTAGGTGTCC用于验证con5-crtE-conA整合至INT1 5'端的反向引物7.4.1
KC-128GCTGTCATGATCTGTGATAAC用于验证con5-crtE-conA整合至INT1 3'端的反向引物7.4.1
KC-129CTGGCAATGTTGACCAATTGC用于验证conB-crtYB-conC整合至INT2 5'端的反向引物7.4.1
KC-130CCAACGTGCCTTAAAGTCTG用于验证conB-crtYB-conC整合至INT2 3'端的反向引物7.4.1
KC-131CCTTACCTTCTGGAGCAGCAG用于验证conD-crtI-conE整合至INT3 5'端的反向引物7.4.1
KC-132CTGGTTACTTCCCTAAGACTG用于验证conD-crtI-conE整合至INT3 3'端的反向引物7.4.1
a. 加粗序列表示连接子序列。
b. 正向引物和反向引物分别标记为FW和RV。

补充表 2：引物序列。

基因整合表，显示不同菌株中基因编辑的启动子、ORF和终止子细节
补充表3：构建菌株的设计。

用于研究分析的整合侧翼DNA序列的DNA测序图谱，多重阵列。
补充表4：供体DNA表达盒及其侧翼区域的序列。 请点击此处下载该文件。

讨论

本方案描述了利用来自 Lachnospiraceae bacterium ND2006 的 Cas12a 蛋白，结合单个 crRNA 阵列和供体 DNA，对 S. cerevisiae 进行多重基因组编辑的方法。文中详细说明了单个 crRNA 阵列和供体 DNA 的设计过程。与已广泛应用的 CRISPR/Cas9 系统相比，CRISPR/Cas12a 具有一项独特的附加功能，即能够加工由单个 crRNA 阵列表达的多个 crRNA13,33。由于这一特性，可更简便地实现多个靶点的同时编辑，并可通过一次转化完成。Zetsche et al.34 此前已证实该单 crRNA 阵列策略，利用 AsCas12a 在哺乳动物细胞中同时编辑了多达四个基因；Swiat et al.35 则利用 FnCas12a 将四个 DNA 片段插入酵母基因组。据我们所知，目前尚未有报道使用 Cas12a 系统实现更高数量的同步基因组修饰，且 Cas12a 单阵列所能容纳的靶点最大数量仍有待确定。近年来，结合 Cas12a 与单个 crRNA 阵列的进一步研究还包括在多种生物中实现多重转录调控33,36,37。

在本方案中有一些关键步骤。应仔细设计 Cas12a 基因组编辑实验中涉及的所有 DNA 序列，特别是当引入新的 DNA 序列时。在将新的 crRNA 间隔序列组合成单个 crRNA 阵列之前，应通过单重基因组编辑实验（如 Verwaal et al.19 所述）确定其功能。遵循 Cas12a 编辑实验中所用转化缓冲液溶液的制备建议，以实现酵母的高效转化。

该技术存在一些可选的优化方案。建议在转化过程中使用1 µg的每种供体DNA，即线性化的pRN1120质粒或单个crRNA阵列表达盒，尽管使用较低量的DNA也可能获得满意的转化效率。可通过预实验转化来确定是否可使用较低的DNA用量。酿酒酵母（S. cerevisiae）的转化也可采用本方案未描述的其他方法，例如Gietz et al.（2007）38所述的方法。引导RNA受体质粒pRN1120适用于表达单个crRNA以及不同Cas12a变体（例如，来自Acidaminococcus spp. BV3L6或Francisella novicida U112）的单个crRNA阵列，同时也可用于与Cas9联用表达sgRNA19。供体DNA不仅限于类胡萝卜素基因表达盒以及靶向基因组DNA中所述INT1、INT2和INT3位点的侧翼区域。根据本方案所述的设计原则，任何感兴趣的DNA均可通过多重方式导入宿主基因组；或者，也可利用供体DNA实现宿主基因组中特定DNA片段的删除。单个crRNA阵列的模块化结构便于对间隔序列和直接重复序列进行便捷调整。通过修改间隔序列，可改变预期的整合位点，其设计可借助基因组靶位点识别工具完成，例如 GuideScan软件1.039。除了使用包含连接序列的较长侧翼序列外，还可通过在PCR引物中引入50 bp的侧翼区域序列，将该50 bp侧翼序列直接包含在供体DNA序列中。在此情况下，成功的多重基因组编辑实验仅需总共三个供体DNA片段，而非九个。

综上所述，本方案提供了利用Cas12a结合单个crRNA阵列方法在S. cerevisiae中进行多重基因组编辑的逐步操作指南。该方案通过使用9个供体DNA片段和编码三个gRNA的单个crRNA阵列实现了多重基因组编辑。我们展示了本研究中报告的三种菌株设计的整体编辑效率较高，介于50%至94%之间。总之，Cas12a的独特之处在于其能够在细胞内将单个crRNA阵列加工成独立的crRNA，这使得Cas12a成为实现多重基因组编辑以及一次性构建靶向多个表达盒的转录调控模块的优秀工具。最终获得了三种产生类胡萝卜素的菌株，其产量不同，颜色呈现从黄色到橙色的多种色调。利用这些菌株及野生型菌株，我们展示了如何直接使用声波液体处理系统制作酵母像素艺术——以此纪念罗莎琳德·富兰克林（Rosalind Franklin），她65年前通过著名的“照片51”为DNA结构的发现作出了重要贡献23。

披露

作者声明存在利益冲突。作者已就所介绍的方法申请了相关知识产权。

致谢

本项目获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划的资助，资助协议编号为686070（DD-DeCaf）和764591（SynCrop），以及荷兰科学研究组织（NWO）“生命构建模块”研究计划（项目编号737.016.005）的资助。T.E.G. 获得了英国皇家学会（资助号UF160357）和BrisSynBio的资助，一个 英国生物技术和生物科学研究理事会/工程与物理科学研究理事会合成生物学研究中心（资助号：BB/L01386X/1）。我们感谢 Zi Di 和 Jeffrey van Wijk 在酵母点种实验及酵母像素艺术创作中的贡献。 

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
实验方案专用化学品
1 Kb Plus DNA LadderThermo Fisher Scientific10787018电泳
氨苄青霉素钠盐Sigma AldrichA9518大肠杆菌转化子筛选
BsaI-HF (20 U/µl)New England BioLabsR353L黄金门克隆
细胞裂解液（来自 Puregene Yeast/Bact. Kit B 试剂盒）QIAGEN854016酿酒酵母基因组DNA提取
CutSmart BufferNew England BioLabsB7204SpRN1120线性化
鲑鱼精DNA钠盐Sigma AldrichD1626
酿酒酵母转化（载体DNA）
dNTPsInvitrogen10297018PCR
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101SpRN1120线性化
分析纯无水乙醇Merck100983酿酒酵母基因组DNA提取
乙二胺四乙酸Sigma AldrichED
酿酒酵母转化
G418硫酸二盐Sigma AldrichA1720酿酒酵母转化子筛选
HistodenzSigma AldrichD2158 酵母像素艺术
异丙醇Merck100993酿酒酵母基因组DNA提取
乙酸锂二水合物Sigma AldrichL6883
酿酒酵母转化
Nancy-520 DNA凝胶染料Sigma Aldrich1494电泳
NEB10感受态大肠杆菌细胞New England BioLabsC3019H大肠杆菌转化：dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6
诺尔斯曲菌素Jena BioscienceAB102酿酒酵母转化子筛选
Phusion缓冲液New England BioLabsM0530LPCR
Phusion高保真DNA聚合酶New England BioLabsM0530LPCR
聚乙二醇4000Merck7490
酿酒酵母转化
蛋白沉淀溶液（10 M NH4AC）（来自 Puregene Yeast/Bact. Kit B 试剂盒）QIAGEN854016酿酒酵母基因组DNA提取
紫色上样染料New England BioLabsB7024S电泳
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒QIAGEN27106质粒纯化
RNase混合酶Thermo Fisher ScientificAM2286酿酒酵母基因组DNA提取
T4 DNA连接酶缓冲液Invitrogen46300-018黄金门克隆
T4 DNA连接酶 (1 U/µl)Invitrogen1705218黄金门克隆
UltraPure琼脂糖Invitrogen16500500电泳
Wizard SV凝胶及PCR产物纯化系统试剂盒PromegaA9282PCR产物及线性化pRN1120的纯化
XholNew England BioLabsR0146SpRN1120线性化
Zymolyase 50 mg/ml (5 units/µL)Zymo ResearchE1006酿酒酵母基因组DNA提取（酵母裂解酶）
Zymolyase储存缓冲液Zymo ResearchE1004-B酿酒酵母基因组DNA提取（酵母裂解酶配制所需）
通用化学品
2*蛋白胨-酵母提取物（PY）琼脂大肠杆菌平板培养
2*PY培养基大肠杆菌培养
去矿物质水
酿酒酵母转化
ELFO缓冲液电泳
MQ多个步骤
生理盐水溶液
酿酒酵母转化
TE缓冲液DNA储存，酿酒酵母转化
酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YEPD；2%葡萄糖）培养基酿酒酵母培养
YEPD（2%葡萄糖）琼脂
酿酒酵母平板培养
耗材
Eppendorf管
Falcon管（50 mL）
96孔微孔板
培养皿
移液器吸头 0.5 - 10 µL
移液器吸头 10 - 200 µL
移液器吸头 100 - 1000 µL
摇瓶（500 mL）
无菌滤器
设备
离心机（Falcon管）
Echo 525声波液体处理系统
培养箱
NanoDrop
电泳装置
分光光度计
台式离心机（Eppendorf管）
PCR仪
质粒
pCSN067AddgeneID 101748https://www.addgene.org/
pRN1120AddgeneID 101750https://www.addgene.org/
菌株
S. cerevisiae 菌株
CEN.PK113-7D		EUROSCARF 菌种库http://www.euroscarf.de

参考文献

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CRISPR/Cas12a 对 Saccharomyces cerevisiae 的多重基因组编辑及酵母像素艺术的创建
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