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用于质谱流式细胞术进行细胞周期特异性细胞蛋白表达分析的小鼠皮肤角质形成细胞的分离与染色

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DOI：

10.3791/59353

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2019年5月9日

 , 
1Department of Dermatology and Charles C. Gates Center for Regenerative Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

本文内容

摘要

本方案描述了如何从小鼠模型中分离皮肤角质形成细胞，使用金属标记抗体进行染色，并通过质谱流式细胞术分析染色后的细胞，以表征目标蛋白在不同细胞周期阶段中的表达模式。

摘要

本实验方案的目标是通过分离小鼠皮肤表皮的单个细胞，以依赖细胞周期的方式检测和定量蛋白质表达的变化。该方案包含七个关键步骤：将表皮与真皮分离、表皮组织的消化、使用顺铂对表皮细胞群体进行染色、样本条形码标记、使用金属标记抗体对细胞周期标志物及目标蛋白进行染色、通过质谱流式细胞术检测金属标记抗体，以及在不同细胞周期阶段分析蛋白表达水平。与组织学方法相比，该方法的优势在于能够同时在单个细胞中检测超过>40种不同标志物的表达模式，并且可进行多变量相关性分析，其定量能力优于传统的组织学/成像方法。该方案的局限性在于需要制备单细胞悬液，从而导致组织切片染色所提供的空间定位信息丢失。此外，该方法可能需要引入额外的标志物以在粗制细胞悬液中区分不同细胞类型。本方案适用于增生性皮肤病模型的分析。此外，通过加入谱系特异性抗体，该方案还可用于特定细胞亚群（例如干细胞）的分析。该方案也可根据需要调整，用于其他实验物种皮肤细胞的研究。

引言

相关性 在分析癌症等增生性疾病动物模型时，基因表达与细胞周期阶段之间的关联仍是一项挑战。部分挑战在于目标蛋白（POI）与增殖标志物的共检测。增殖期细胞可处于不同的细胞周期时相，包括 G1、S、G2 和 M 期。Ki67 是最常用的增殖标志物之一，在细胞周期的所有时相中均有表达，已被广泛应用于人和小鼠组织的分析中1,2,3然而，与其他一般的增殖标志物一样，Ki67 无法区分细胞周期的各个具体时相。一种更为精确的方法是利用胸苷核苷酸类似物（如溴脱氧尿嘧啶，BrdU）掺入正在活跃复制基因组的细胞中（即处于S期的细胞）。4,5使用核苷酸类似物的一个缺点是需要在分析前数小时对活体动物进行给药。Ki67 和 BrdU 通常通过抗体在固定组织切片上进行检测。该方法的一个优势在于可以确定目标蛋白（POIs）在组织结构中的定位（例如皮肤表皮的基底层）。此外，该方法无需对组织进行解离，从而避免了可能引起的基因表达变化。一个缺点是组织固定或用于 OCT 冷冻包埋或石蜡包埋的处理过程可能遮蔽抗体识别位点（即抗原）。抗原修复通常需要加热或组织消化处理。染色强度的定量也具有挑战性，原因包括染色差异、切片厚度不均、信号检测差异以及实验人员的主观偏差。此外，在大多数常规实验室条件下，能够同时检测的标记物数量有限。然而，新兴的多重染色技术有望克服这些局限性，例如成像质谱流式细胞术（imaging mass cytometry）和酪胺信号放大技术（Tyramide signal amplification）。6,7.

流式细胞术是检测增殖细胞的另一种强大技术。它能够在同一细胞中进行多种标志物的多重检测，但对于大多数非造血细胞类型，需要先进行组织解离。对增殖细胞的分析通常使用能够结合DNA的染料（例如碘化丙啶（PI））来完成8。当与BrdU掺入检测相结合时，流式细胞术还可更精确地确定细胞周期各时相9。尽管该方法功能强大，BrdU/PI流式细胞术仍存在一些缺点。若无时相特异性抗体的参与，该方法无法区分G2/M期与G0/G1期。然而，可使用的抗体数量受限于细胞自发荧光、荧光团发射光谱的溢出效应以及补偿对照的使用。这一限制使得细胞周期标志物与目的蛋白（POIs）的共检测变得更加困难且耗时。一种更为简便的方法是使用质谱流式细胞术10,11。该技术采用金属标记的抗体，其检测光谱更窄。细胞经金属标记抗体染色后会被汽化，随后通过飞行时间质谱（CyTOF）检测其中的金属信号。由于这些特性，利用现有平台，质谱流式细胞术可实现超过>40种不同标志物的多重检测10,11。此外，还可利用金属对样本进行条形码标记，在减少样本间染色差异的同时节省珍贵的抗体。然而，质谱流式细胞术也存在若干缺点。目前 commercially available 的适用于非血液来源细胞的金属标记抗体种类有限。其DNA含量定量的灵敏度低于荧光DNA染料，且信号检测的动态范围较荧光流式细胞术更窄。

本文所述方案旨在分析从小鼠皮肤新分离的角质形成细胞（KCs）的细胞周期动态，并利用质谱流式细胞技术表征这些细胞中细胞周期特异性蛋白的表达。该方案也可用于培养细胞，或经调整后适用于其他细胞类型。

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方案

本方案中所述的动物实验已获得科罗拉多大学安舒茨医学校区机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 准备工作

  1. 设计金属标记抗体组合。使用免费的在线组合设计软件12，并包含127碘代脱氧尿苷（IdU）、164镝（Dy）标记的抗CCNB1（CYCLIN B1）抗体、175镥（Lu）标记的磷酸化 （p）-HISTONEH3Ser28（pHH3）以及150钕（Nd）标记的磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白Ser807/811（pRB）13。添加其他通道信号无重叠的金属标记抗体14。
  2. 制备IdU储备液。将IdU粉末在60 °C条件下以10 mg/mL浓度溶于0.1 N NaOH中。将IdU储备液分装至微量离心管中，并于-20 °C冷冻保存以长期储存。
    1. 使用前立即用12 N HCl将IdU溶液pH调节至7.5。取一份弃用分装样品，用pH试纸检测以确认溶液pH为7.5。
      注意：IdU在pH 7.5条件下长时间（>5分钟）会导致沉淀，此时需使用新鲜分装的IdU。
    2. 操作NaOH或HCl溶液时，应佩戴适当的个人防护装备（如手套、实验服和护目镜），并在生物安全柜中操作。
  3. 制备2x多聚甲醛（PFA）固定液。将5 mL 10x PBS（pH 7.5）与1 mL 16% PFA及44 mL高纯度分子级dH2O混合（终浓度为3.2%）。
    注意：PFA储备液可按先前发表的方法制备15，或直接购买无金属污染的16% PFA储备液。
    1. 操作PFA粉末及溶液时，应佩戴适当的个人防护装备，并在生物安全柜中操作。
  4. 通过将5 mL无金属10x PBS（pH 7.5）与45 mL高纯度分子级dH2O混合，制备无钡（Ba2+）的1x PBS。
    注意：PBS及其他试剂的质量至关重要，需避免引入可能在质谱流式数据分析中产生背景噪声的金属污染。
  5. 制备100 mM顺铂储备液。将300.5 mg顺铂粉末溶于10 mL DMSO中。分装后于-80 °C保存。实验时制备10 mM顺铂工作液，当日使用。
  6. 制备表皮/真皮分离溶液。通过将30 mg分散酶溶于1 mL HBSS或PBS中，制备20x分散酶储备液。经0.22 µm滤膜过滤除菌后分装，于-20 °C保存。在HBSS中配制1x IV型胶原酶储备液（浓度1 mg/mL），经0.22 µm滤膜过滤除菌后分装，于-20 °C保存。

2. 通过 IdU 掺入标记 S 期

  1. 称重小鼠。使用出生后第1至第3天的新生幼鼠或8至10周龄的成年小鼠，品系可为C57BL/6、FvB或129背景，性别不限。确定IdU（pH 7.5）给药剂量为每克体重0.1 mg。例如，一只25 g的小鼠需要注射0.25 mL的IdU。
  2. 通过腹腔注射给予IdU剂量，注射后等待2小时再收获细胞。对新生幼鼠使用结核菌素注射器进行注射。
    注意：对于组织培养细胞，可在收获和质谱流式标记前，使用2 mg/mL的IdU在37 °C下孵育1小时。

3. 用于标记的细胞分离

  1. 解冻dispase和胶原酶储备液。将20倍浓度的dispase储备液用无菌HBSS或PBS稀释至1倍浓度（1.5 mg/mL）。置于冰上保存，待用时取出。
  2. 将2体积的dispase与1体积的胶原酶混合，总体积需足以使皮肤自由漂浮。例如，可将5只新生小鼠的皮肤漂浮于100 mm培养皿中的8 mL 1x dispase与4 mL胶原酶混合液中。
  3. 采用批准的方法对实验小鼠实施安乐死（例如，异氟烷过量/脚趾挤压检查或CO₂）2 吸入/颈椎脱位）。用碘溶液清洁成年小鼠耳部皮肤（参见 材料表并将分离的细胞用无菌水冲洗，以便用于组织培养。
  4. 在基部手术切除耳部（图1A）。若分离的细胞用于组织培养，用无菌 PBS 冲洗耳组织。将其置于干燥的 100 mm 培养皿中。
  5. 使用精细镊子在切割区域的中部或边缘先创建一个囊袋，将前侧与后侧皮肤仔细分离，并将两片皮瓣拉开 图1B- D）。继续处理前侧和后侧的皮肤。
    注意：Litchi 等人提供了分离新生小鼠皮肤的详细操作步骤。16 此外，使用解剖显微镜可能有助于分离前侧与后侧皮肤，并识别所分离皮肤的表皮和真皮面：表皮面可见毛发，而真皮面则呈胶状外观。
  6. 小心地将耳部的前侧和后侧皮肤放置，使皮肤的真皮面接触dispase/collagenase溶液（ 图1E）。每个12孔培养板孔中，分别取单只耳朵的腹侧和背侧皮肤各1 mL。在37 °C下孵育1小时。或者，将皮肤置于4 °C的1×dispase溶液中漂浮处理16–18小时。3
    注意：细胞培养时应在组织培养超净台内无菌操作。
  7. 将消化后的皮肤置于干净的培养皿表面，使表皮侧朝下。展平皮肤，从中心向边缘以环形方式轻轻剥离真皮层，使真皮与表皮分离。
  8. 弃去真皮组织，或进一步消化以释放成纤维细胞，用于组织培养或分析16.
    注意：真皮层外观颜色较深，呈凝胶状且具有黏性，应易于剥离。若无法顺利或难以去除真皮层，表明组织消化不充分。然而，消化缓冲液中孵育时间过长会降低细胞活力。表皮层将留在培养皿上，呈漂白色外观。
  9. 轻轻抓住表皮边缘，将其从培养皿表面揭起并剥离。小心地将表皮放置于预热的细胞解离液中（参见 材料表在37 °C下孵育5分钟或在室温下孵育20分钟。每孔12孔培养板中加入500 µL细胞解离液，用于处理2个成年小鼠耳部表皮；每孔6孔培养板中加入750 µL细胞解离液，用于处理1个新生小鼠表皮。
  10. 用无菌镊子夹住表皮，通过将表皮在培养皿底部拖动摩擦以解离细胞。加入1 mL含1% FBS（0.01 mL）的DMEM，经40 μm细胞筛过滤至收集管中。再用额外的2 mL DMEM充分冲洗，并加入细胞悬液中。
  11. 以 120 x g 离心 g 5 分钟。小心吸除上清液。
  12. 用含1% FBS的DMEM重悬细胞沉淀，体积为1–2 mL。使用台盼蓝染色和血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞数量及活细胞百分比。按照步骤3.11所述方法离心收集细胞。
    注意：在完成步骤 3.12 后，细胞可在适当的组织培养基中进行培养。17

4. 顺铂标记法检测活/死细胞

  1. 每1 mL含25 µM顺铂（2.5 µL原液/mL）的DMEM中重悬1-3 × 106个细胞。孵育1分钟后，加入等体积FBS（例如1 mL）终止反应。
  2. 以120 × g离心5分钟。将上清液倾入含稀释漂白剂的烧杯中，倒置离心管使残留液体流至纸巾上。轻轻敲击以去除沉淀及管壁上残留的液体。
  3. 用2 mL不含Ba+2的PBS重悬细胞沉淀。按照步骤4.2所述方法沉淀细胞。
    注意：若细胞不能立即染色，建议进行固定。

5. 顺铂标记细胞的固定（可选）

  1. 将1-3 × 106个顺铂标记的细胞重悬于1 mL无Ba+2的PBS中。持续低功率涡旋细胞，同时逐滴加入1 mL（1个体积）2× PFA固定液。在室温下于摇床上孵育10分钟。
  2. 按照步骤4.2所述方法收集细胞，但在500 × g离心5分钟。
  3. 用2 mL无Ba+2的PBS洗涤细胞，并按照步骤5.2所述方法收集细胞。重复步骤5.3一次。
  4. 将细胞沉淀重悬于2 mL无Ba+2的PBS中。4°C保存，保存时间<3天。若需保存更长时间>3天，则向总体积中加入FBS至终浓度为3%（例如，每毫升细胞悬液中加入0.3 mL FBS），混匀后于-80 °C冻存。
    注意：固定可能影响某些表位的检测。固定对抗体信号的影响 需通过实验确定。

6. 样品条形码标记（可选但推荐）

  1. 按照步骤5.2所述收集细胞沉淀，然后重悬于1-3 x 106 1 mL 1x 固定缓冲液中的细胞（参见 材料表）。室温孵育10分钟。按步骤5.2所述方法离心收集细胞。
  2. 用 1 mL 条形码通透缓冲液洗涤细胞（参见 材料表). 按步骤 5.2 所述离心收集细胞。重复步骤 6.2 一次。
  3. 加入 100 µL 条形码通透化缓冲液至条形码中（参见 材料表)18 并在第6.2步细胞离心的同时立即混匀。
  4. 将细胞沉淀重悬于800 µL条形码通透缓冲液中。加入条形码溶液至细胞悬液，混匀后室温孵育30分钟。按照步骤5.2所述方法离心收集细胞。用2 mL细胞染色缓冲液洗涤细胞（见 材料表）并再次离心收集沉淀。
    注意：最多可使用多种钯金属组合对20个样本进行标记18其他条形码策略在别处有描述15.

7. 用于质谱流式细胞术的细胞标记

  1. 重悬 1–3 × 106 1 mL 核抗原染色缓冲液工作液中的细胞（参见 材料表). 若使用带条形码的样本，将样本合并至同一管中进行后续步骤。室温孵育30分钟。按步骤5.2所述方法离心收集沉淀。
  2. 重悬 1–3 × 106 2 mL 核抗原染色透化缓冲液中的细胞（参见 材料表）。根据需要调整比例。例如，对于细胞数量为 9 x 10⁶ 的 10 个合并样本，使用 6 mL 缓冲液6 细胞。按照第5.2步所述进行沉淀。
  3. 重复步骤 7.2。轻柔操作 将管中残留液体中的细胞沉淀进行涡旋振荡。
  4. 每1-3 x 10⁶细胞加入50 µL细胞内抗体混合液6 细胞。根据需要调整体积。例如，对于细胞数量为 9 x 10 的 10 个合并样本，使用 150 μL 抗体混合液6 细胞。混匀后在室温下孵育45分钟。加入2 mL细胞染色缓冲液，按步骤5.2所述方法离心收集细胞沉淀。
  5. 重悬 1–3 × 106 将细胞沉淀于2 mL细胞染色缓冲液中。按照步骤5.2所述方法离心收集细胞。重复步骤7.5一次。
    注意：可使用其他缓冲溶液对细胞外膜或胞质标记物进行染色，若需检测不同细胞定位的表位，实验者可能需要优化染色条件。当使用活细胞进行染色时，也可在第7.5步之后用PFA固定细胞。
  6. 重悬 1–3 × 106 1 mL 插层溶液中保存细胞，于 4 ˚C 储存 1–3 天。
    1. 将细胞置于含有 DMSO 的溶液中，于 -80 °C 保存 >3 d. 如果细胞处于嵌合溶液中，则按照步骤5.2所述离心收集细胞。重悬细胞沉淀（1-3 x 106 细胞）加入1 mL细胞染色缓冲液中，按步骤5.2所述离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于1 mL 10% DMSO/90% FBS中19转移至冻存管，置于无异丙醇的冷冻容器中，并于 -80 °C 保存。
  7. 按步骤5.2所述收集细胞沉淀。洗涤1-3 × 106 用2 mL细胞染色缓冲液重悬细胞，按步骤5.2所述进行离心沉淀。再用2 mL水进行两次额外洗涤，每次均按步骤5.2所述进行离心沉淀。
  8. 将EQ校准微球以1:9的比例溶于水中（储备液浓度为3.3 × 105 珠/mL
  9. 将细胞沉淀重悬，浓度为 1 x 106 细胞/mL 与稀释的 EQ 珠溶液混合。通过带有35 µm滤网帽的流式管过滤细胞。
  10. 在质谱流式细胞仪上运行样本并采集数据。数据将以流式细胞术标准（FCS）文件格式存储。

8. 质谱流式细胞术数据文件的处理与分析

  1. 标准化 FCS 文件。使用以下网址提供的免费程序： https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest20
  2. 解卷积条形码 FCS 文件。使用以下网址提供的免费程序，将混合的条形码样本拆分为独立的条形码文件： https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest18
  3. 分析标准化后的 FCS 文件。可使用商业21，22或免费软件（参见 web.stanford.edu/group/nolan/resources.html）。

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结果

表1展示了在非病理条件下，成年小鼠耳部（图1）和新生小鼠皮肤获得的预期细胞产量及细胞活力。该表还列出了来自混合C57/126遗传背景动物的代表性数据。预计其他品系小鼠的皮肤也会产生相似的细胞产量和活力。细胞产量大致取决于皮肤表面积，表明在需要大量细胞的实验中，新生小鼠皮肤是更优的选择（表1）。若产量较低或细胞活力下降（<50%），则提示消化过程或实验条件存在问题，可能导致皮肤完整性受损或诱导细胞死亡。使用适当的培养基和补充物培养细胞有助于评估角质形成细胞（KC）制备的质量17。

在对 FCS 文件进行标准化20和去卷积18后，通过设门（gating）可确定表皮细胞中感兴趣的细胞群...

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讨论

本论文所述方案可在约8小时内完成。最终获得的是富含角质形成细胞（KCs）的细胞悬液，可用于分析细胞周期依赖性的蛋白质表达。此前已有若干研究概述了从人和小鼠皮肤中分离角质形成细胞的方法16,25，其中一些研究还包含了用于流式细胞术的角质形成细胞分离方案26。然而，此前尚未有详细描述将角质形成细胞分离与利用质谱流式细胞术分析蛋白质表达及细胞周期动态相结合的完整实验流程。

本方案获得高质量结果的最大障碍在于所用活细胞的质量。文献中关于表皮/真皮分离的建议条件和酶种类差异很大16,25,26,27。因此，建议将皮肤消化时间控制在能够有效分离表皮与真皮所需的最短时间范围内。本...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作的支持来自科罗拉多大学皮肤病学系、科罗拉多大学盖茨再生医学中心 科罗拉多大学（UC）皮肤疾病中心形态学与表型分析核心实验室（NIAMS P30 AR057212）。作者感谢科罗拉多大学癌症中心流式细胞术共享资源及支持基金（NCI P30 CA046934）对质谱流式细胞仪运行提供的支持，并感谢核心实验室的Karen Helm和Christine Childs在流式细胞术和质谱流式细胞术技术方面提供的专业指导。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12孔板细胞处理229512
嵌入剂溶液Fluidigm201192A125 µM - Ir 插入剂溶液
多聚甲醛电子显微镜科学公司30525-89-416 %  PFA
筛网帽流管Fisher/Corning35223535 µm 孔径大小 
细胞筛Fisher2236354740 μm 孔径大小 
细胞解离液CELLnTECCnT-ACCUTASE-100Accutase
碘溶液ThermoFisher/Purdue67618-151-17聚维酮碘 7.5% 外科洗手液
条形码通透化缓冲液 Fluidigm201060Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
条形码Fluidigm201060Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
pH 试纸EMD9590colorpHast
DMEMHycloneSH30022.01杜尔贝科’s 改良伊格尔培养基
精细镊子杜蒙 & Fils0109-5-PODumostar #5
弯曲精密镊子杜蒙特 & Fils0109-7-PO杜莫斯塔 #7
校准微球Fluidigm201078EQ四元素校准微球
HBSSGibco14175-095Hank's 平衡盐溶液
水FisherSH30538.03Hyclone 分子生物学级水
碘脱氧尿苷 SigmaI7125IdU
冻存管ThermoFisher366656PK内螺纹
细胞染色缓冲液Fluidigm201068Maxpar 细胞染色缓冲液
固定 & Perm 缓冲液Fluidigm201067Maxpar Fix & Perm 缓冲液
Fix I 缓冲液Fluidigm201065Maxpar Fix I 缓冲液
磷酸盐缓冲液RocklandMB-008无金属 10x PBS
无异丙醇冷冻容器ThermoFisher5100-0001Mr. Frosty
氢氧化钠FisherBP359-500NaOH
培养皿Kord-Valmark2900由 Genesee 32-107 提供 
15 mL 离心管Olympus/Genesee28-101
50 mL 离心管Olympus/Genesee28-106
6孔板细胞处理229506
顺铂Sigma479306
Dispase IISigma/Roche4942078001
DMSOSigmaD2650
FBSAtlanta BiologicalsS11150
盐酸FisherA144-212
核抗原染色  透化缓冲液Fluidigm201063
核抗原染色缓冲液Fluidigm201063
台盼蓝SigmaT8154
结核菌素注射器BD309626
IV型胶原酶 沃辛顿生物科学CLSS-4

参考文献

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