小鼠皮肤角质细胞的分离和染色,用于细胞周期特定分析细胞蛋白表达的量度细胞测定

在分析癌症等高塑性疾病的动物模型时,基因表达与细胞周期阶段的相关性仍然是一个挑战。这一挑战的一部分是共同检测具有增殖标记的感兴趣的蛋白质(POI)。增殖细胞可在各种细胞周期阶段找到,包括G1、S、G2和M.Ki67是最常用的增殖标记之一,在细胞周期的所有阶段表达。它已被广泛用于分析人类和小鼠组织1,2,3。然而,与其他一般增殖标记一样,Ki67不识别单个细胞周期阶段。更精确的方法将胸腺素核苷类类似物(如溴氧尿酸(BrdU)结合到正在积极复制其基因组的细胞中(即S相)4、5。使用核苷酸类似物的一个缺点是需要在分析前几小时管理它们以活的动物。使用抗体在固定组织部分通常检测到 Ki67 和 BrdU。这种方法的一个优点是,POI的位置可以在组织架构(例如,皮肤表皮的基础层)中确定。这种方法也不需要组织分离,可能导致基因表达的变化。一个缺点是组织固定或组织处理OCT冷冻或石蜡切片可能遮挡抗体靶点(即抗原)。抗原的回收通常需要热或组织消化。染色强度的量化也可能具有挑战性。这是由于染色、截面厚度、信号检测和实验偏置的变化。此外,在大多数典型的实验室设置中,可以同时检测到数量有限的标记。然而,较新的多路复用染色方法有望克服这些限制;例如成像质量细胞测定和提拉姆德信号放大6,7。

流式细胞测定是另一种检测增殖细胞的强大技术。它允许对同一细胞中的标记进行多倍检测,但大多数非造血细胞类型需要组织分离。增殖细胞的分析通常通过使用结合DNA的染料(例如,碘化钠(PI))8。流式细胞学还允许更精确地测定细胞周期阶段,当与BrdU结合9的检测相结合时。BrdU/PI 流式细胞测量虽然是一种强大的方法,但确实存在其缺点。如果不纳入相位特异性抗体,它无法解决G2/M和G0/G1相。然而,可以使用的抗体数量受到细胞自荧光、荧光辐射的光谱溢出和使用补偿控制的限制。这种限制标志着与POIs共同检测细胞周期标记的表达更具挑战性和艰巨性。一个较简单的方法是使用质量细胞测定10,11。该技术使用具有较窄检测光谱的金属结合抗体。一旦细胞被金属标记的抗体染色,它们就会蒸发,并且细胞测量时间(CyTOF)质谱仪检测到的金属。由于这些特性,质量细胞仪能够使用现有平台10、11对>40个不同标记进行多路检测。此外,还可以用金属对样品进行条形码,从而节省宝贵的抗体,同时减少样品到样品的染色变异性。另一方面,质量细胞学确实有一些缺点。对于非血液衍生细胞,市售的金属标记抗体数量有限。与使用荧光DNA染料相比,DNA含量的定量不太敏感,与荧光流细胞测定相比,质量细胞测量具有较低的信号检测动态范围。

此处描述的方案旨在分析从小鼠皮肤中新分离的角蛋白细胞 (KCs) 中的细胞周期动力学,并使用质量细胞测定来描述这些细胞中的细胞周期特定蛋白表达。该协议也可以与培养的细胞一起使用,或适应其他细胞类型。

科罗拉多大学安舒茨医学院机构动物护理和使用委员会批准了本协议中描述的动物实验。

1. 准备工作

1. 设计一个金属标记的抗体面板。使用免费的在线面板设计软件^12,包括¹²⁷碘氧尿素 (IdU)、164 Dy(Dysprosium) 标记的抗 CCNB1 (CYCLIN B1)、175 Lu(卢泰姆)磷(p)-HISTONEH3^Ser28 (pHH3) 和¹⁵⁰ Nd (钛)-pRETINOBLASTOMA蛋白^Ser807/811 (pRB)¹³.添加其他金属标记的抗体,这些抗体在其通道^信号14中不重叠。
2. 准备 IdU 库存解决方案。在 60°C 下在 0.1 N NaOH 中以 10 mg/mL 溶解 IdU 粉末。将 IdU 库存溶液放入微离心管中,在 -20°C 冷冻,用于长期储存。
   1. 使用前立即使用 12 N HCl 将 IdU 溶液的 pH 量调整到 7.5。在丢弃等分液上使用 pH 条进行测试,以确保溶液在 pH 7.5。
      注: 在 pH 7.5 时,IdU 的长时间(>5 分钟)将导致降水,发生这种情况时需要 IDU 的新等分。
   2. 在处理 NaOH 或 HCl 解决方案时,请使用适当的个人防护设备(例如手套、实验室涂层和安全眼镜),并在安全柜中工作。
3. 准备 2x 甲醛 (PFA) 固定溶液。将 5 mL 的 10x PBS (pH 7.5) 和 1 mL 的 16% PFA 与 44 mL 的纯分子级 dH₂O (3.2% 最终浓度)结合。
   注:PFA 股票可以像之前发布的¹⁵起编制,也可以购买 16% 的股票,没有污染金属。
   1. 处理 PFA 粉末和解决方案时,请使用适当的个人防护设备并在安全柜中工作。
4. 将 5 mL 的无金属 10x PBS (pH 7.5) 与 45 mL 的纯分子级 dH₂O 相结合,制备无 1x PBS。
   注:PBS和其他试剂的质量对于避免污染在分析质量细胞测量数据时会引入背景噪声的金属非常重要。
5. 准备 100 mM 顺铂库存溶液。将300.5毫克顺铂粉末溶解在10mL的DMSO中。以 -80 °C 的等分存储。准备一个10 mM顺铂工作溶液,用于1d以上的实验。
6. 准备表皮/真皮分离溶液。通过在 1 mL 的 HBSS 或 PBS 中溶解 30 mg,制备 20x 的消用剂溶液。通过 0.22 μm 过滤器进行过滤灭菌,并在 -20°C 处储存在等分中。在 HBSS 中制备 1x IV 型胶原酶库存溶液,在 1mg/mL 下,通过 0.22 μm 过滤器过滤灭菌,并将等分液储存在 -20°C。

2. 由 IdU 公司注册 S 阶段标记

1. 称量小鼠。使用 P1-P3 新生儿幼崽或 8-10 周大的成年小鼠,并使用来自 C57BL/6、FvB 或 129 背景的雄性或雌性小鼠。确定剂量为0.1毫克IdU(pH 7.5)/克体重。例如,25 g 鼠标需要 0.25 mU 的 IdU。
2. 通过腹内注射管理IdU的剂量,等待2小时,然后再收获细胞。使用结核菌内注射器注射新生儿小狗。
   注:2mg/mL的IdU剂量可用于在37°C孵育1小时的组织培养细胞,然后收获并贴上质量细胞学标签。

3. 分离用于标记的细胞

1. 解冻消和胶原酶库存溶液。在无菌 HBSS 或 PBS 中,将 20x 脱脂库存溶液稀释至 1x (1.5 mg/mL)。保持冰上,直到准备使用。
2. 将2卷消糖与1卷胶原酶混合在总体积中,使皮肤自由浮动。例如,消化5个新生儿小鼠皮肤可以漂浮在8 mL的1x消沉与4 mL的胶原酶在100毫米培养皿。
3. 遵循经批准的方法对实验鼠实施安乐死(例如,异种胶过量/脚趾捏检查或CO2吸入/宫颈脱位)。用碘溶液清洁成人耳皮(见材料表),当分离的细胞用于组织培养时,用无菌水冲洗。
4. 手术切除底座处的耳(图1A)。当分离细胞用于组织培养时,在无菌PBS中冲洗耳朵。放在干燥的100毫米培养皿上。
5. 首先使用细钳在切割区域的中间或边缘创建一个口袋,并将两个皮瓣拉开(图1B-D)。将前皮与后皮分开。< 继续前皮和后皮。
   注:Litchi等人提供了解剖新生儿小鼠皮肤的详细说明。 此外,使用解剖范围可能有助于分离前体皮肤和鉴定解剖的表皮/皮肤侧皮肤:毛发在表皮侧可见,而真皮则有胶状外观。
6. 小心地放置耳朵的前皮和后部皮肤,皮肤的真皮侧接触脱粘/胶原酶溶液(图1E)。对12孔培养盘每孔单耳的前皮和后皮使用1 mL。在37°C孵育1小时。或者,在4°C下将皮肤浮在1x脱粒溶液上,16-18^小时。
   注:当细胞要培养时,使用无菌技术在组织培养罩中工作。
7. 放置消化的皮肤,表皮侧接触干净的培养皿的表面。平展皮肤,通过以圆形图案从中心到边缘工作,轻轻地将真皮从表皮上滑出。
8. 丢弃真皮或进一步消化它,以释放成纤维细胞的组织培养或^分析16。
   注:真皮在外观上会变暗,并且具有胶状和粘性成分。真皮应该很容易脱落。去除真皮的失败或困难表明组织消化不足。然而,在消化缓冲液中延长孵育将降低细胞的生存能力。表皮将保留在培养皿上,并会有漂白的外观。
9. 抓住边缘,将其从培养皿表面剥离,轻轻提起表皮。在RT处小心地将表皮放在预热前细胞分离溶液(见材料表)5分钟或RT时20分钟。在12孔培养板每孔2个成人耳表皮,使用500μL的细胞分离溶液,并使用750μL的细胞分离 6孔培养板每孔单一新生儿表皮的溶液。
10. 用无菌钳子抓住表皮,将表皮拖到菜底以分离细胞,进行磨砂。加入含有 1% FBS (0.01 mL) 的 1 mL DMEM,并通过 40 μm 细胞筛进入收集管。用额外的 2 mL DMEM 冲洗干净,并添加到细胞悬架中。
11. 在120 x g下离心5分钟,小心吸气上清液。
12. 在含有1%FBS的DMEM1-2 mL中重新悬浮细胞颗粒。使用 Trypan Blue 和血细胞计仪或自动计数设备确定细胞和% 活细胞计数。步骤 3.11 中所述的颗粒细胞。
    注:细胞可以在步骤3.12之后在适当的组织培养培养培养中培养。¹⁷

4. 西斯铂标签,以确定活/死细胞

1. 每 1 mL 的 DMEM 重新悬浮 1-3 x 10⁶个细胞,含有 25 μM 顺铂 (2.5 μL 库存/mL)。用同等体积的FBS(例如1 mL)移液孵育1分钟并淬火。
2. 在 120 x g下将 5 分钟从心,将上清液倒入含有稀释漂白剂的烧杯中,并倒置管,将剩余的溶液排到纸巾上。轻轻敲击,以释放管的颗粒和侧壁上剩余的溶液。
3. 在 Ba⁺²-无 PBS 的 2 mL 中重新悬浮细胞颗粒。如步骤 4.2 中所述的颗粒细胞。
   注:如果细胞不能立即染色,建议修复它们。

5. 顺铂标记细胞的固定(可选)

1. 在 1 mL 的 Ba^+2-无 PBS 中重新悬浮 1-3 x 10⁶顺铂标记细胞。涡流细胞在连续低功率下,并添加滴落1 mL(1卷)的2xPFA固定缓冲液。在 RT 上在摇动平台上孵育 10 分钟。
2. 如步骤 4.2 所述的颗粒细胞,但以 500 x g的离心机 5 分钟。
3. 洗涤细胞与2 mL的Ba^+2-无PBS和颗粒细胞,如步骤5.2所述。重复步骤 5.3 一次。
4. 在 Ba⁺²-2-无 PBS 的 2 mL 中重新悬浮颗粒。储存在 4°C 的 <3 d. 如果储存的时间更长>3 d,则将 FBS 添加到总体积的 3%(例如,0.3 mL 的 FBS/mL 细胞),如果储存时间更长 >3 d,则混合并冻结在 -80 °C。
   注: 固定可能会影响某些表位的检测。固定对抗体信号的影响需要从经验上确定。

6. 样品条形码(可选但推荐)

1. 如步骤 5.2 所述的颗粒细胞,然后在 1x 固定缓冲液的 1 mL 中重新悬浮 1-3 x 10⁶细胞(参见材料表)。在RT孵育10分钟。
2. 使用 1 mL 的条形码渗透缓冲液清洗细胞(参见材料表)。如步骤 5.2 中所述的颗粒细胞。重复步骤 6.2 一次。
3. 将100 μL的条形码渗透缓冲液添加到条形码(见材料表)18中,并在步骤6.2中的细胞进行颗粒化时立即混合。
4. 在800 μL的条形码渗透缓冲液中重新悬浮细胞颗粒。向细胞添加条形码溶液,在RT上混合和孵育30分钟。在2 mL的细胞染色缓冲液(见材料表)和颗粒再次洗涤细胞。
   注:多达20个样品可以标记与各种组合的铂^金属18。其他条形码策略在其它部分15上有描述。

7. 细胞质量测量的标签

1. 在1mL的核抗原染色缓冲液溶液中重新悬浮1-3 x 10⁶个细胞(见材料表)。使用条形码样品时,将样品组合到单个管中,以便后续步骤。在 RT 孵育 30 分钟。
2. 在2 mL的核抗原染色渗透缓冲液中重新悬浮1-3 x 10⁶个细胞(见材料表)。根据需要进行缩放。例如,对 10 个组合样本的缓冲液使用 6 mL,其细胞计数为 9 x 10⁶个单元格。如步骤 5.2 中所述的颗粒。
3. 重复步骤 7.2。轻轻涡涡细胞颗粒在残留体积留在管。
4. 每1-3 x 10⁶细胞加入50μL细胞内抗体鸡尾酒。根据需要进行缩放。例如,将150μL的抗体鸡尾酒用于10个组合样品,其细胞计数为9 x 10⁶细胞。在RT下混合和孵育45分钟。如步骤5.2所述,加入2 mL的细胞染色缓冲液和颗粒。
5. 在2 mL的细胞染色缓冲液中重新悬浮1-3 x 10⁶细胞颗粒。如步骤 5.2 中所述的颗粒细胞。重复步骤 7.5 一次。
   注:其他缓冲液可用于染色细胞外膜或细胞质标记物,如果需要检测不同细胞位置的表皮,实验者可能必须优化染色。使用活细胞进行染色时,在步骤 7.5 之后,细胞也可以固定在 PFA 中。
6. 在1 mL的间分溶液中重新悬浮1-3 x 10⁶个细胞,并在4°C下储存1-3d。
   1. 如果将细胞存储在分因溶液中,则将细胞储存在 -80 °C 的 DMSO 中,其中包含 >3 d. 小粒细胞的溶液,如步骤 5.2 中所述。如步骤 5.2 所述,在 1 mL 的细胞染色缓冲液和颗粒细胞中重新悬浮颗粒(1-3 x 10⁶细胞)。在 1 mL 的 10% DMSO/90% FBS¹⁹中重新悬浮颗粒,转移到冷冻液中,放入异丙醇冷冻容器中,并储存在 -80°C。
7. 如步骤 5.2 中所述的颗粒细胞。用 2 mL 的细胞染色缓冲液清洗 1-3 x 10⁶细胞,如步骤 5.2 所述进行颗粒处理。执行两个额外的处理与 2 mL 水, 颗粒在步骤 5.2 中所述.
8. 稀释水中的 EQ 校准珠 1:9(3.3 x 10⁵珠/mL 的库存溶液)。
9. 用稀释的EQ珠溶液将细胞颗粒重新悬浮在浓度为1 x 10⁶细胞/mL的浓度上。通过 35 μm 滤网盖流管过滤细胞。
10. 在质量细胞仪上运行样本并获取数据。数据将以流式细胞测定标准 (FCS) 文件格式存储。

8. 处理和分析大容量细胞学数据文件

1. 规范化 FCS 文件。使用 20https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest提供免费程序
2. 去分条形码FCS文件。将池条码填充分离到单独的条形码文件中,并在¹⁸ https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest提供免费程序
3. 分析规范化的 FCS 文件。使用商业21,22或免费软件程序(见web.stanford.edu/group/nolan/resources.html)。

表1显示了成人小鼠耳朵(图1)和非病理条件下新生儿皮肤的预期细胞产量和生存能力。该表还显示了来自混合 C57/126 背景的动物的代表性数据。预计其他菌株的皮肤会产生类似的细胞产量和活力。近似产量取决于皮肤的表面积,表明新生儿皮肤对于需要大量细胞的实验来说将是一个更好的选择(表1)。低产量或降低生存能力(<50%)会指示消化或实验性条件,降低皮肤完整性或诱导细胞死亡的问题。培养细胞与适当的介质和补充剂可以帮助评估质量的KC制剂17。

在FCS文件的规范化20和去角化18之后,数据门控将定义感兴趣的表皮细胞群,并去标记单个细胞周期阶段(图2)。在比较191Ir vs 193Ir 通道的双变量图中,完整的细胞可以在右上象限中封闭(图 2A)。绘制事件长度 vs 191Ir,并为191Ir 轴附近的紧密单元组选择标记单个单元格。活细胞通过门控低195Pt 级别的单元格,在195Pt vs 193Ir 绘图的图中选择。图2A所示的样品有碎屑和标有非活细胞的顺铂物增加的存在。这可能表明样品在染色前过度消化、处理严苛或长时间留在冰上或RT上,以免进行大规模细胞测量。组织培养细胞的轮廓通常给出195Pt阴性细胞的较高百分比(图2B)。或者,如果诱导细胞死亡是实验模型和/或条件的一个特征,则可预期存在195Pt阳性细胞。

理想情况下,定义感兴趣总体的标记应包含在特定单元格类型的分析中。例如,通过添加CD4523抗体,检测造血细胞(图2C),可以检测出预计在粗KC悬浮液中存在的免疫细胞。关于增殖抗体面板13,绘制IdU vs CYCLIN B1可解析类似于标准BrdU/PI流图(图2D)的细胞周期相(图2C),允许检测S相、G0/G1和G2/M细胞人口。在 IdU vs pHH3 图中,高 pHH3 正性识别 M 相细胞。最后,在高pRB信号上注道G0/G1单元可以区分G0(静止)和G1中的细胞(图2C,最左侧的面板)。

识别了不同的细胞周期阶段后,就可以为不同的细胞类型或实验条件构建细胞周期轮廓的图形表示。例如,在比较CD45-vs CD45+细胞群(图3A)中的CD45-vs CD45+细胞群时,会出现不同的细胞周期轮廓,如图2所示。正如预期的那样,在CD45组中发现的超塑性千氯CC在G0中细胞较少,在S、G2和M相3中细胞更多。相比之下,来自同一样本的免疫细胞在G0和G1中具有显著的人群群。除了细胞周期配置文件外,还可以以细胞周期依赖性的方式对基因表达进行表征。例如,在图3A提供的数据中分析了有助于定义EGFR和mTOR/PI3K信号的磷蛋白。对CD45-vs CD45+细胞的G1相的分析显示EGFR和mTOR/PI3K信号蛋白的轮廓相似,尽管在pS6和pEGFR阳性细胞的百分比上似乎略有不同(图3B)。类似的方法可以调整来描述细胞周期不同阶段其他信号通路蛋白或细胞过程的表达。

图 1:准备小鼠耳皮进行消化。(A) 首先,从动物身上取下耳朵,平放在干净的培养皿上。(B) 使用弯曲的精密钳子抓住耳朵的中间或边缘的一侧。(C) 翻转,使用另一对钳子,轻轻地拉开耳朵的两半,直到耳在折痕上撕裂。(D) 继续拉,直到两侧分成两半。(E) 在真皮侧接触溶液时,将耳朵半部浮在解散介质上。比例尺 = 2 毫米。请点击此处查看此图的较大版本。

图 2:量质细胞测量数据的测量策略。这个数字中的数据来自一个实验动物,如前所述,用phoresterTPA处理。TPA是一种PKC活化剂,诱导皮肤炎症24。(A) 面板显示条码数据规范化和递减后的初始门控策略。通过对事件长度、191Ir、193 Ir 和195Pt 通道进行浇注,可以选择完整、单和可行的单元。(B) 人类SCC SRB-P93细胞使用DMSO处理,然后染色进行大规模细胞测定。数据被封闭为 (A) 中的数据,图显示了此示例中活细胞的级别。(C) 列入系系标记允许选择感兴趣的细胞群。在此示例中, 来自 (A) 的活细胞在事件长度与 CD45 的封闭中,以排除造血细胞.用于将 IdU 与 CYCLIN B1 结合的 CD45- 细胞允许识别 S、G0/G1 和 G2/M 细胞群。选择pHH3高细胞定义M相,而对G0/G1的pRB正性分析识别G1中的细胞。(D) 图显示了通过检测基于荧光的流式细胞测定的BrdU结合和PI(DNA含量)的细胞周期分析的代表性结果。显示的数据来自人类Colo163 SCC细胞与BrdU一起生长1小时,如前所述3。请点击此处查看此图的较大版本。

图 3:细胞周期谱和相位特异性蛋白表达的表征。(A) 细胞周期配置文件在图2中确定 CD45- vs CD45+ 细胞的样本。(B) 在CD45-(橙色)和CD45+(蓝色)细胞中,对磷特异性抗体的G1相进行分析,发现EGFR和mTOR/PI3K信号通路的标记物的表达特征相似。请点击此处查看此图的较大版本。

表1:成年小鼠耳朵和新生儿皮肤的典型细胞产量和活力。从从n=7 8-10周成人小鼠耳朵或n=7 P3新生儿皮肤采集的耳K中,通过Trypan蓝色排除的细胞计数和生存能力平均。

作者没有什么可透露的。